专利名称：羟基苯交联大分子网络及其应用的制作方法
羟基苯交联大分子网络及其应用
背景技术：
关节软骨在健康的关节中行使基本功能。关节软骨吸收和分散冲 击和摩擦载荷从而将这些载荷从骨骼上转移，保护骨骼免受伤害。软 骨通过将载荷力转移至受限于关节间隙内的聚集蛋白聚糖分子(在下 一节中有所描述)三维网络内的流体相实现该功能。聚集蛋白聚糖分
子含有与核心蛋白相连的多达ioo条的硫酸软骨素链，在每条硫酸软
骨素链全长上分布着多个电负性的硫酸根基团。这些硫酸根基团引起 了单个聚集蛋白聚糖分子上的各条硫酸软骨素链之间的相互排斥(造
成静态聚集蛋白聚糖分子占有最大的空间体积)，并导致软骨聚集体中 相邻的聚集蛋白聚糖分子互相排斥。
在健康软骨中，聚集蛋白聚糖分子与透明质酸长链相连，而透明 质酸链被胞外胶原纤维基质限制于关节伺隙内的大型软骨聚集体中。 因此，即使每个聚集蛋白聚糖分子(和与相同或不同的透明质酸链相 连的相邻聚集蛋白聚糖分子)中相邻的硫酸软骨素链之间相互排斥， 它们仍然被限制在胶原基质中。图1描述了正常、健康的软骨。由于 硫酸软骨素链之间如此排斥，透明质酸一聚集蛋白聚糖网络(或大分 子网络)在胶原基质的限制下会尽可能大的延展从而在静态获得尽可 能低的能量态，即使得相邻的电负性的硫酸根基团间的距离尽可能最 大化。由此，网络分子为了避免和相邻的网络分子靠近而很难发生移 动或替代。这些大型软骨聚集体被限制在体积为其自由溶液体积五分 之一的胶原纤维网络中，无法继续膨胀。具有很高的负电荷密度的软 骨聚集体与大量溶剂结合从而赋予软骨吸收载荷和抵抗变形的能力。 在压縮下，固定在聚集蛋白聚糖上的负电荷基团之间的距离縮小，从 而增加了电荷_电荷之间的排斥力以及自由浮动的平衡阳离子的浓度
(如C^+和Na+)。这些效应均对软骨的粘弹性和软骨抵抗变形及吸收压
縮载荷的能力有所帮助，以下将进一步加以说明。
水分子在大分子网络中提供了充分连续的流体相。如下所述，大 分子网络通过将冲击和摩擦载荷转移至连续的流体(水)相将它们从 骨骼上转移。当关节承受载荷时，大分子网络首先将力吸收，该力作 用于网络欲使其变形或将其压缩。力在流体相中形成压力梯度从而诱 导流体流动以适应由载荷造成的网络的变形或压縮。但是流体无法改 变坚实的大分子网络，网络填满了相互排斥的硫酸软骨素链，足以在 不移动或替代网络分子的情况下容纳大量的水。因此，虽然每个水分 子可以在网络中扩散，但由于网络分子不会发生替代，因此除非流速 大幅减慢，否则大量的流体相将基本被限制于网络中而无法通过。尽 管存在压力梯度，但是由于水分子无法顺利流动，冲击或摩擦载荷的 能量转移至流体相并被其吸收，其中该能量压縮液体水直至水发生充 分的转移以适应网络形状且压力梯度发生衰减。总体效果即软骨吸收 潜在有害载荷，并将其从骨骼上转移。
通过该完善的机制，正常的关节能够通过将大量的载荷力转移至 受限于大分子网络内的流体相而吸收大量的载荷。在现有技术中，该 过程还没有被人工或合成方法充分地重现。因此，对于软骨退行性疾 病还无法进行充分的治疗，如关节炎，其中聚集蛋白聚糖分子从它们 的透明质酸链上脱离，被消化或运出软骨聚集体。
据估计，骨性关节炎和风湿性关节炎分别影响着20. 7和2. 1百万 美国人。仅骨性关节炎每年就造成大约7百万次的医生探访。对于严 重的致残性关节炎，目前的治疗包括全关节置换手术，仅美国每年就 平均进行168， 000桩全髋关节置换和267， 000桩全膝关节置换手术。 由于软骨细胞在修复软骨中的有限能力，关节软骨的缺陷带来了复杂 的治疗问题。迄今为止的治疗策略将重点放在对细胞培养中的自体软 骨细胞的应用或在体内通过趋化试剂或促有丝分裂试剂对间质干细胞 的募集上。这些策略的目的在于增加和/或活化软骨细胞群落从而重新 合成正常的、健康的关节软骨表面。这些策略的一个主要问题是无法 将这些试剂保留在缺陷位点。由于透明质酸特有的性质，包括极佳的 生物相容性、可降解性和流变学及理化性质，有提议将透明质酸用作
发展软骨细胞或生物活性试剂局部给药的生物材料的候选材料。然而， 悬浮于组织工程透明质酸基质中的软骨细胞能否合成机械性质与正常 健康的关节软骨相当的新软骨基质仍然是未知的。这是因为由透明质 酸制成传统生物材料的化学制备方法与保持细胞存活力不相容。软骨 细胞必须在基质形成后才能被引入基质，结果不稳定且通常很差。
因此，本领域需要一种能够以有效的方式将载荷力从骨骼上有效 转移的人工或合成基质。优选地，此基质在整形外科手术过程中可以 在原位点或在体内修复或置换关节软骨。更优地，人工或合成基质以 一种液体或多种液体的形式提供在原位点或体内靶点，在位点与病人 体内已经存在的软骨或骨骼组织形成基本密实的整合。
发明内容
发明综述
本发明提供的大分子网络包含以下结构<formula>formula see original document page 6</formula>
其中&和R2分别是或者包含选自聚羧酸酯、聚胺、聚羟基苯分子 以及它们的共聚体的结构，其中R和R2的结构可以相同也可以不同。
本发明还提供了含有大量酪胺取代透明质酸分子的大分子网络， 其中至少两个相邻透明质酸分子由二酪胺键相连。
本发明还提供了一种水凝胶，水凝胶包含酪胺取代透明质酸分子 的大分子网络，网络通过透明质酸分子之间的二酪胺键交联。
本发明还提供了制备大分子网络的方法，包含步骤有提供第一 类大分子，大分子选自羟基苯取代聚羧酸酯、羟基苯取代聚胺、其它 聚羟基苯分子和它们的共聚物；以及在与相邻的第一类大分子分别相 连的两个羟基苯基团之间形成至少一个二羟基苯键。
本发明还提供了包含下列步骤的制备水凝胶的方法a)提供第一 溶液，其中含有过氧化物酶或过氧化物但不同时含有两者，同时含有
一类大分子，大分子选自羟基苯取代聚羧酸酯、羟基苯取代聚胺、其它聚羟基苯分子和它们的共聚物；b)提供第二溶液，其中含有第一溶 液中所没有的过氧化酶或过氧化物中的一种；和c)混合第一和第二溶 液起始二羟基苯交联反应，形成水凝胶。
图1是正常健康的人体软骨的示意图。
图2是本发明的二羟基苯交联大分子网络的示意图。
图3是透明质酸分子的结构式。
图4是本发明的T-HA水凝胶在封闭抗压测试机械测试中(平衡应 力对施加张力)的结果与已公开的关节软骨栓的结果(实施例3)的比 较图表。
图5是埋于T-HA水凝胶中(1. 7%和4. 7%T-HA)的软骨细胞与在组 织培养塑胶上培养的软骨细胞(对照)关于葡萄糖利用的比较数据的 图表。
具体实施例方式
在此所用的术语聚羧酸酯指链长含有至少两个功能基团或单位的 分子、结构或类，其链中的至少两个这样的基团或单位是或者包含羧 酸基团，在所述的亲核取代反应中，该羧酸基团在空间上是可以接近 的。同样在此所用的术语聚胺指链长含有至少两个功能基团或单位的 分子、结构或类，其链中的至少两个这样的基团或单位是或包含可用 于亲核取代反应的一级胺基团。同样在此所用的聚羟基苯分子指链长 含有至少两个功能基团或单位的分子，其链中的至少两个这样的基团 或单位是或包含羟基苯基团，它们能通过C-C键与另一个羟基苯基团 相连。同样用于此的水凝胶是制备的一种含有大分子网络的材料，大 分子网络用于组织置换或工程应用，例如作为人工软骨、作为手术器 材的包被材料以防止组织发炎、或作为人工肾的半透膜等。
本发明包括大分子网络的一种新颖的结构，大分子网络通过相邻 长链大分子上的羟基苯基团之间的连接形成，这些连接使得大分子之
间形成有效的交联从而生成一个巨大的网络。网络的基本交联结构如 下所示
<formula>formula see original document page 8</formula>
其中R1和R2分别是长链大分子。R,和R2可以是相同的或不同的分
子，但将了解到为了生成合适的网络，本发明的网络中至少有部分二
羟基苯键中的K和R2是不同的分子。R和R2不必需但却优选地是同类 分子。
通过相邻大分子之间形成的大量二羟基苯键，生成了如图2中所 示的二羟基苯交联大分子网络。在图中，大分子用圆柱形带表示，每 个大分子含有至少两个与其相连的羟基苯基团。需要注意的是并不是 每个羟基苯基团都必须与另一个羟基苯基团相连。
简要地，所记载的发明包括含有羟基苯的化合物经过碳化二亚胺 介导的反应通过它们的一级胺(或羧基)基团共价连接到各种聚合支 架材料上的羧基(或一级胺)基团上，所述化合物包括但不限于酪胺， 所述聚合支架材料包括但不限于透明质酸或硫酸软骨素(例如以聚集 蛋白聚糖的形式)。在分离和纯化羟基取代聚合支架后，在极稀的过氧 化氢的存在下，山葵过氧化物酶(HRP)使得羟基苯残基选择性地发生 交联生成水凝胶。
制备大分子网络的第一步是制备或提供周期性地带有羟基苯基团 的长链大分子。在一个具体实施方案中，大分子为带有多个或周期性 带有羟基苯基团的聚羟基苯分子，如多酚。合适的多酚包括聚氨基酸 (例如聚酪氨酸)、表没食子儿茶酚(EGC)和从绿茶中分离出的表没 食子儿茶酚没食子酸(EGCG)、其他次优的多酚。
在进一步的具体实施方案中，通过化学反应可将羟基苯基团周期 性地或随机地添加到大分子的长链上。将羟基苯基团添加到大分子上 的一个优选方法是利用碳二亚胺介导的取代反应途径在带有一个羟基 苯基团的一级胺和大分子上的羧酸基团之间形成酰胺键。在此方法中，
优选的长链大分子是周期性带有羧酸基团的聚羧酸酯分子。羟基苯基 团是带有一级胺基团的小分子中的一部分，通过碳二亚胺途径可以连 接到长链大分子的羧酸基团中的羧基碳原子上。反应进行如下<formula>formula see original document page 9</formula>其中
结构A是碳二亚胺；
结构B是聚羧酸酯(虽然仅标明了一个C02H基团)； 结构C是反应A的产物，活化的O-酰基异脲； 结构D是含有羟基苯基团的一级胺； 结构E是羟基苯取代聚羧酸酯；
结构F是酰基脲副产物；
其中各个R可以分别选择，彼此相同或不同，可以是直链或支链
垸基或酰基基团，或其他任何结构，只要这些结构不会干扰碳二亚胺
反应途径在NH2和C02H之间生成上述结构E中的酰胺键即可。
在以上示意的途径中，反应A代表了碳二亚胺对羧基基团的活化进而生成活化的o-酰基异脲中间体。该中间体中正电性的碳原子可以
接受相邻的带有羟基苯基团的一级胺分子中氮原子的孤对电子的亲核攻击。该亲核取代反应(反应B)的产物是羟基苯取代聚羧酸酯和酰基脲副产物，酰基脲可以通过透析去除从而得到足够纯的羟基苯取代聚 羧酸酯产物。
上述碳二亚胺反应途径中可能发生特定的副反应，该领域的普通 技术人员应该对此加以考虑。首先，碳二亚胺可与其它亲核试剂反应，
而不是与生成理想的o-酰基异脲所必需的聚羧酸酯分子的羧酸氧原子发生反应(反应A)。其它的亲核试剂可以包括上述结构D中的胺和/ 或羟基苯基团。特别地，反应A会发生3种可能的副反应从而降低碳 二亚胺和带有羟基苯基团的一级胺的有效浓度(结构A和D)，并且可 能导致在聚羧酸酯(结构B)上生成非理想的加合物
纖C
纖0
細E
胺和碳二亚胺的反应产物(反应c)没有自由胺基，因此有效地减 少了可以和o-酰基异脲发生反应的酪胺的量。该反应还减少了可以生成理想的0-酰基异脲的碳二亚胺的量。羟基苯反应产物(反应D)没 有UV吸收，这使得在最终的羟基苯取代聚羧酸酯产物(解释见下)中
用uv光谱对它们进行观察变得更加困难。但是，由于这些产物仍然带
有自由胺基，它们可以通过反应B和聚羧酸酯分子生成酰胺键。反应 可生成两种无效的透明质酸取代结构，由于缺乏生成自由基(解释见 下)所需的可提取的酚羟基氢原子，两个结构均无法参与到制备本发 明交联网络的第二步过氧化物酶交联反应中(说明见下)。最终，碳二 亚胺会与水发生无效的反应(反应E)生成与上述反应B副产物相同的 酰基脲，但是没有理想产物，结构E的生成。
一旦在反应A中生成理想的0-酰基异脲产物，又可能发生某些额 外的副反应
<formula>formula see original document page 11</formula> 0-酰基异脲(结构C)可以如反应F所示发生水解，释放出原始的
未修饰的聚羧酸酯(结构B)和碳二亚胺的酰基脲(结构F)。该反应 是和反应E相似的无效反应，降低了碳二亚胺的有效浓度。0-酰基异 脲还可以通过分子内重排(反应G)生成两种化学惰性的N-酰基脲。 这些结构在羧酸酯分子上生成无效的加合物，无法用于本发明网络制 备中的过氧化物酶催化交联反应(以下讨论的步骤2)。 0-酰基异脲也 可以和相同或不同聚羧酸酯分子上的第二个羧基基团发生反应(反应 H)生成酸酐。该分子随后可与结构D发生反应形成理想的酰胺并重新
获得第二个羧基基团。因此对于o-酰基异脲存在两个可能的副反应，
这些副反应能降低碳二亚胺的有效浓度(反应F和G)并可能导致在聚 羧酸酯分子上生成非理想的加合物。
这些副反应的负面效应并非由于不当的实验方法，而是通过常规 操作就会发生。
上述途径中的大分子为聚羧酸酯(结构B)，在另一种可选择的途 径中，大分子可以是带有多个或周期性带有胺基基团的聚胺，其中羟 基苯基团作为羧酸小分子的一部分。合适的聚胺包括聚己糖胺如壳 聚糖(聚葡萄糖胺)；聚氨基酸如聚赖氨酸；聚脱氧核糖核酸如聚(dA) (聚脱氧腺苷酸)、聚(dC)(聚脱氧胞苷酸)、聚(dG)(聚脱氧鸟苷 酸)；以及聚核糖核酸如聚(A)(聚腺苷酸)、聚(C)(聚胞苷酸)和 聚(G)(聚鸟苷酸)。碳二亚胺介导反应途径完全按照以上所解释的反 应途径进行，从而在胺基基团和羧酸基团之间形成酰胺键，唯一的不 同是生成的产物是羟基苯取代聚胺而不是聚羧酸酯，这是本领域普通 技术人员能够理解的。其他肽和/或蛋白质也可以用作本发明中的大分 子，只要其带有羟基苯基团，或通过在此说明的取代反应可以获得羟 基苯取代基团即可。例如，除了本发明已记载的肽，聚精氨酸可以被 用作大分子。
当聚羧酸酯分子上发生取代时，用于本发明的合适的含有羟基苯 的化合物包括带有自由一级胺的化合物， 一级胺能够用于修饰带有多 个或周期性带有C02H基团的支架材料，包括酪氨酸(2-氨基-3- (4-羟基苯)丙酸)和酪胺(酪胺或2- (4-羟基苯)乙胺)。当聚胺上发生
取代时，合适的含有羟基苯的化合物包括带有自由C02H基团的化合物， C02H基团可以用于修饰带有多个或周期性带有一级丽2基团的支架材 料，包括酪氨酸、3- (4-羟基苯)丙酸和4-轻基苯乙酸。
根据本发明制备交联大分子网络的第二步是通过二羟基苯连接结 构将获得的己经带有一个或多个羟基苯基团的大分子连接。在这一步 中，不同的大分子上的羟基苯基团通过以下的反应机理在过氧化物酶 的存在下利用过氧化物试剂发生连接
<formula>formula see original document page 14</formula>錢驅苯取代聚羧黢醱(结构E)
<formula>formula see original document page 14</formula>
(应当注意的是一些二羟基苯连接也可以在同一分子的不同羟基 苯基团之间形成。)在稀释的过氧化物(优选H202)存在下过氧化物酶 可以从带有羟基苯的化合物中(如酪胺)提取酚羟基的氢原子，留给
酚羟基氧原子一个孤电子，成为极端活跃的自由基。该自由基将两个 等价邻位碳原子中的一个异构化，随后两个这样的结构发生二聚化形 成共价键将结构有效地交联，交联结构经过烯醇化生成二羟基苯二聚 体(以下说明的二羟基苯键如二酪胺键)。
简明起见，以上只显示了单个的二羟基苯连接反应，但是应该明 白当把带有羟基苯基团的大分子置于反应条件下时(过氧化物和过氧 化物酶)将会生成数个或多重这样的键。上述机制中使用了过氧化氢， 但也可以使用其他合适的过氧化物。同样地，过氧化物酶优选山葵过 氧化物酶(HRP)。可选地，能够生成自由基使带有羟基苯基团的支架 材料发生交联的其它任何合适的酶(或其它试剂)均可以使用，在下 述的普通代谢条件下发生作用的为优选。
由于交联反应是酶驱动的(过氧化物酶)，二羟基苯交联大分子网 络优于传统的软骨或其它组织置换或取代方法和产品。酶驱动意味着
交联反应在普通的体内或代谢条件下进行，温度为35°C_39°C (例如 37°C)、 pH范围为6-7 (例如6.5)，反应试剂等等。(过氧化物，如过 氧化氢，是交联反应中唯一需要的反应试剂)。因此，交联反应可以在 体内进行，在手术位点如整形外科手术位点提供交联的水凝胶，从而 促成水凝胶和天然组织如骨骼和软骨组织之间最大程度的密实整合。 由于羟基苯取代大分子支架在交联之前迅速地渗透入已经存在的软骨 基质中，不仅与其它的羟基苯取代大分子支架材料发生交联，还可能 与已存在于软骨基质中的蛋白的酪氨酸残基发生交联，因此新的水凝 胶支架和天然软骨基质的整合可以迅速发生。这样就可以消除在使用 预先制成的基质栓时发现的典型问题，即它们很难整合进天然的软骨 组织。能够将水凝胶直接交联在关节表面就不再需要在手术中将伤口 扩大以适应预先制好的栓，对于那些化学反应对病人有毒或否则就无 法在病人体内形成的水凝胶必须事先制栓。应当注意的是由关节炎引 起的大部分软骨损伤表现为关节表面不同程度的变薄而不是具有一定 形状的洞。
由于交联反应需要过氧化物和过氧化物酶(优选山葵过氧化物 酶)，为了方便地应用于手术位点，可以制备含有所有组分而唯缺一种
组分的溶液。例如，可以制备含有酪胺(或其它含有羟基苯的种类) 取代聚羧酸酯(如酪胺取代透明质酸等)和过氧化物酶的溶液，并制 备含有过氧化物的第二溶液。可选地，第一和第二溶液中的过氧化物 和过氧化物酶可以交换，重要的是在交联反应发生之前过氧化物和过 氧化物酶分开保存(即在分开的溶液中)。随后，使用第一溶液，(例 如在体内手术位点)，并将第二溶液在体内使用或喷洒在第一溶液上， 在原位点形成酪胺残基的交联。交联反应在体内发生。根据本发明的 记载，其它的组合对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。
此外，由于交联反应在普通代谢条件下发生，因此可以将额外的 活细胞，如软骨细胞、祖细胞、干细胞等，直接加入含有未交联的羟 基苯取代聚羧酸酯或聚胺(或多酚)的培养基中，即前一节中的第一 或第二溶液，其中将富含细胞的培养基和大分子一起应用于体内位点， 分子随后在加入过氧化物酶和过氧化物后发生交联。于是交联后的大 分子网络中分散了理想的细胞。由于制备传统基质时极端的温度和pH 条件，这种富含细胞的网络不可能在传统组织置换基质中形成。此外， 如以下实施例5中所描述，已经证实上述发明基质中的细胞在根据本 发明发生酪胺取代透明质酸交联(描述见下)生成网络后仍然存活。
在特别适用于制备合成软骨及其它合成或人工组织的优选实施方
案中，根据本发明用于生成网络的大分子是透明质酸(HA)，且羟基苯
基团以酪胺的形式提供。
如图3所示，HA由重复的以P-l，3糖苷键连接的葡萄糖醛酸 (glcA)和N-乙酰葡萄糖胺(glcNAc)残基对组成。对于每一条透明 质酸链，该简单的二糖重复多达10，000次，每个重复的二糖之间通过 P -1， 4糖苷键连接。每个glcA在其葡萄糖环的5位碳原子上连有一个 羧酸基团(C02H)。酪胺是带有与苯环OH基团正对的乙胺基团的酚类分 子。当使用这些分子时，将酪胺取代至HA的C02H基团的单键氧原子上 的机制如下所示，是通过上述碳二亚胺介导的反应机制进行的。优选 的碳二亚胺类是所示的1-乙基_3- (3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。<formula>formula see original document page 17</formula>其中
结构A是EDC;
结构B是透明质酸(虽然只表明了一个C02H);
结构C是反应A的产物1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)异脲；
结构D是酪胺； 结构E是酪胺取代透明质酸；
结构F是卜乙基-3- (3-二甲氨基丙基)尿素(EDU)。 在上述途径中，透明质酸分子羧基基团上的电负性的氧原子通过 亲核反应机制攻击碳二亚胺分子(EDC)上缺电子的二酰亚胺碳原子生 成活化的0-酰基异脲(反应A)。于是HA羧酸酯基团中的碳原子对电 子的缺乏使得其易受酪胺分子中胺基团的孤对电子的攻击(反应B)。 优选地，反应A由合适的催化剂催化在反应A中生成活化的酯，使得 反应可以在基本中性的pH (例如pH二6.5)下进行。合适的催化剂包括 N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、次优的l-羟基苯并三唑(H0Bt)或N-羟基 磺基琥珀酰亚胺(NHSS)、次优的其它通过形成活化酯有效提高碳二亚 胺反应使得碳二亚胺在更高pH下的无效水解最小化的合适催化剂或它
们的混合物。除了 EDC外可以使用的其它次优的碳二亚胺包括卜环己
基-3-[2-(4-甲基吗啡啉)乙基]碳二亚胺(CMC)以及二环己基碳二亚 胺(DCC)。
上述反应A生成了 0-酰基异脲取代透明质酸；EDC分子临时取代 至HA分子中glcA残基的羧酸基团上，使得羧酸基团的碳原子带有弱 正电性。如上一节中所解释的，酪胺分子末端胺基团的电子对随后通 过亲核取代反应取代至碳原子上(反应B)。反应B生成了酪胺取代HA 分子(T-HA)和副产品酰基异脲。应当了解的是反应A和B将在HA分 子的周期性glcA残基上生成多个酪胺取代；出于简单明了的考虑在此 只显示了单个取代。
如以上说明和解释，在生成T-HA之后，多个T-HA分子通过过氧 化物和过氧化物酶发生反应生成交联的T-HA分子。即与HA分子相连 的酪胺残基的羟基苯基团在过氧化物酶的存在下和过氧化物(优选 H202)发生反应从而去除了酚羟基的氢原子生成酪胺自由基，其中酚上 的氧原子带有未配对电子。该自由基发生异构化或共振，生成的共振 结构(或自由基异构体)中未配对电子转移至酚环上的邻位碳原子。 在该位置，未配对电子迅速地和另一个酪胺自由基上相似位置上的未 配对电子生成共价键。其结果是在相同或不同的HA分子的不同glcA 上的不同酪胺自由基残基之间发生自由基驱动的二聚化。该二聚体进 一步发生烯醇化生成相互连接的酪胺残基，生成二酪胺键结构。应该 明确的是在相邻的酪胺残基间将发生很多所述的反应，生成本发明的 T-HA分子的交联大分子网络，该网络具有如下交联结构
交联的T-HA网络可以通过传统方法如通过连接蛋白加入聚集蛋白 聚糖，生成的交联T-HA网络中聚集蛋白聚糖分子与HA链相连。于是， 根据本发明可以获得与正常软骨聚集体中的网络相似的网络，其中二 酪胺键取代正常软骨中的胶原纤维将网络连在一起并由此限制住所含 的聚集蛋白聚糖网络。
由本发明可知，其它的粘多糖、多糖和聚羧酸也可被用作大分子 生成在此记载的交联网络。例如，除了HA以外的合适的粘多糖包括软 骨素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和肝磷脂。其它合适 的聚羧酸酯包括蛋白聚糖如多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和由聚 集蛋白聚糖、透明质酸及连接蛋白组成的软骨聚集体；聚糖醛酸如聚 果胶酸盐(聚半乳糖醛酸)、聚葡萄糖醛酸、果胶(聚半乳糖醛酸甲基 酯)、聚唾液酸(聚[2，8-(N-乙酰神经氨酸)])和海藻酸盐(甘露糖醛 酸和古洛糖醛酸共聚物)；以及符合上述聚羧酸酯的定义的氨基酸(具 有至少2个氨基酸单元)，如聚天冬氨酸和聚谷氨酸。采用在此记载的 碳二亚胺介导的反应途径，本领域的普通技术人员通过正确的实验方 法可以对所有这些大分子进行一个或多个羟基苯基团的取代。
如上所述，还应当了解的是天然多酚化合物已经含有两个或多个 羟基苯基团，羟基苯基团可以通过所述酶催化化学反应交联，因此多 酚化合物可以替代上述必须通过化学反应加上羟基苯基团的聚羧酸酯 和聚胺。
在另一个优选具体实施方案中，用酪胺交联的硫酸软骨素分子(独 立地或作为聚集蛋白聚糖的一部分)网络用于模拟或置换正常软骨。 硫酸软骨素与透明质酸相同，除了 1)重复的二糖结构包含的是N-乙酰半乳糖胺(galNAc)而不是glcNAc，唯一的差别在于接在4位碳 上的羟基基团(在图3中用圆圈标明)；2) 0-硫酸盐发生在galNAc残 基的4和/或6位和/或glcA残基的2位羟基上(图3)以及3)硫酸 软骨素的链长，比透明质酸少20 — 100个重复的二糖单位。(聚集蛋白 聚糖分子由多条——大约100条硫酸软骨素链通过每条链的还原末端 的连接糖与核心蛋白相连)。在该具体实施方案中，相邻的(交联的) 硫酸软骨素分子电负性的S042—基团产生的排斥力使得网络聚集体具有
抗压性而酪胺交联防止硫酸软骨素网络断裂或散裂。由此生成了与正 常软骨中类似的不可替代的硫酸软骨素网络(以及伴随着的不透水 性)，但是没有正常软骨中的胞外胶原纤维基质或HA链。事实上，通
过直接交联硫酸软骨素分子(而不是前述具体实施方案中的核心HA分
子)，相邻硫酸软骨素分子之间的排斥力增强，使得其对流体流的抵抗 力较正常软骨更强。由于间隙内流体相的流动受到更大的限制，直接 交联的硫酸软骨素分子对于载荷力的吸收和分散能力比正常软骨更 强。在硫酸软骨素分子直接交联的该具体实施方案中， 一些软骨退化
的情况被彻底控制；例如某些情况下正常软骨中与硫酸软骨素分子正 常相连的核心蛋白在HA结合域(Gl)与第二个球形结构域(G2)之间 发生断裂，于是软骨素硫酸富集区从软骨聚集体中扩散出去。在该具 体实施方案中，由于硫酸软骨素分子之间直接交联而没有与聚集蛋白 聚糖或其它蛋白聚糖分子相连，它们不会像在正常软骨中那样被切断 或运走。
然而，由于HA的可利用度高，优选酪胺交联的T-HA网络(带有 聚集蛋白聚糖分子的HA骨架链，聚集蛋白聚糖分子包括硫酸软骨素 链)。这在使用本发明进行软骨置换或修复中可能是有益的，因为身体 生成软骨的正常代谢途径可以直接在植入的酪胺交联T-HA网络上形 成，以下将对此进行说明。
上述的二酪胺交联T-HA网络对于生产人工或合成软骨具有特别的 用途。软骨移植常用于头和颈重建过程以修复外伤或先天畸形中的软 骨或骨骼缺陷。专门针对于耳的应用包括耳廓和耳的重建，此应用经 常用于修复由于外伤、肿瘤(即鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑素瘤) 和先天形成的缺陷如小耳症。专门针对鼻的应用包括鼻和鼻中隔的修 饰和重建过程。在鼻部美容整形中常用到鼻梁增高、鼻尖软骨(tip graft)、罩软骨(shield graft)和支撑软骨(spreader graft)。对 外伤、肿瘤、自免疫疾病如Wegeners肉芽肿或先天性缺陷的鼻重建需 要软骨进行修复。隔膜穿孔难以治疗并经常治疗失败。将软骨嫁接用 于这些治疗非常理想，但是自体或捐赠的软骨经常短缺。专门针对喉 的应用包括喉气管的重建，对于儿童通常需要取肋软骨，这也是危险
的。耳和隔膜软骨对于这种应用而言经常是不够的。因此在此描述的 交联HA网络形成的工程软骨在解决这些问题上将产生重大影响。喉气 管重建经常用于治疗由于声门下或气管狭窄而引起的气道狭窄。病源 可以是外伤(即插管损伤或气管切开术)或先天性的。
其它应用还包括下巴和面颊增高、下眼睑外翻修复以及大量的颅 面应用。应当注意的是在这些应用中的软骨可能不需要和关节软骨有 着完全一致的机械性质。同时可能希望其中可以包含细胞群或生物活 性试剂。
本发明的交联网络发挥主要作用的一个特别应用是生产人工肾。 肾脏通过两种机制过滤血液 一种通过尺寸排除，另一种通过电荷排
除。已经设计出MEMS装置用于人工肾装置，装置中包含了精确定义的
微孔，微孔只能有效地模拟肾脏的尺寸排除特征。在健康的肾脏中， 关于电荷排除的过滤是由于基底膜中存在硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，该 过滤将两种不同类型的细胞分离，对于肾脏的其它相关功能非常重要。
为了在MEMS工程人工肾中模拟这种电荷屏障，可以制备含有硫酸乙酰 肝素或肝磷脂的水凝胶，水凝胶通过在此描述的二羟基苯(二酪胺) 联结进行交联，并且装入MEMS装置的孔中。该肝磷脂/硫酸乙酰肝素 水凝胶随后可被夹入两层在此所述的透明质酸水凝胶(如上述的T-HA) 中，两层水凝胶分别含有正常功能肾脏中通常存在的一类细胞。中间 的肝磷脂/硫酸乙酰肝素水凝胶为该装置提供了电荷排除的能力。外面 的两层透明质酸水凝胶保护中间层免受免疫系统侵犯和正常细胞及分 子碎片的污染。在过滤屏障两面包含的两类细胞以正常的生理方向提 供了细胞组分。
在另一个具有前景的应用中，本发明的水凝胶可用于发展人工胰 腺。发展人工胰腺的一个问题是由于体内监测仪电极的污垢，MEMS工 程葡萄糖感应器的半衰期很短。在这些监测仪表面覆盖上在此所述的 透明质酸水凝胶(即T-HA)将允许探测用的小分子量葡萄糖分子的扩 散，但同时可以保护感应器免受免疫系统侵犯和正常细胞及分子碎片 的污染。
总而言之，根据前述显而易见的是用作形成水凝胶的支架材料的
大分子包括但不限于聚羧酸酯(含有自由羧基基团)、聚胺(含有自 由一级胺基团)、多酚(含有自由羟基苯基团)和它们的共聚体，以 上已经举例描述。当使用多酚时，本发明上述制备网络的第一步可以 省略，因为多酚己经包含了多个或周期性的羟基苯基团。相反地，聚 羧酸酯和聚胺都必须优选地通过上述碳二亚胺反应途径在其中加上或 取代上羟基苯基团。为了形成交联的结构，制备网络的第二步是在相 邻大分子(无论是聚羧酸酯、聚胺或多酚)上的两个羟基苯基团间进 行酶驱动的二聚化反应。该步骤在代谢温度和pH条件下，在合适的酶 (优选服P)存在下用过氧化物试剂(优选过氧化氢)进行。
在优选的二酪胺交联T-HA网络中，在第一步中高分子量透明质酸 (HA)上的羧基基团由酪胺取代，酪胺将活性的羟基苯基团引入HA分 子。该酪胺取代反应优选地由碳二亚胺，1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基) 碳二亚胺(EDC)介导，HA上酪胺的取代程度由反应混合物中的酪胺、 EDC和HA的摩尔比例及绝对浓度决定。过量的反应试剂如未发生反应 的酪胺和EDC随后通过透析去除，从而可以分离和恢复高分子量的酪 胺取代HA (T-HA)。在各T-HA制备中的酪胺取代百分比可以通过以下 测量简单地计算l)制备中酪胺的浓度，根据酪胺在275nm特有的UV 吸收性质可以光谱定量(见以下实施例2);和2) HA制备中总的羧基 基团的浓度，通过标准的己糖醛酸分析光谱定量。通过该技术，仅含 有4-6%的酪胺取代的T-HA已经通过实验常规合成。在此酪胺取代水平 上，HA分子中的大部分(优选的至少60、 70、 80、 90或95%)化学 上保持不变，由此仍然保持生物功能。基于该T-HA配方(即4-6%酪胺 取代)，通过简单地改变过程第二步中使用的T-HA的浓度可以生成具 有广泛的物理性质的广泛的生物材料。
在交联反应中，T-HA溶液通过酶(过氧化物酶)驱动反应交联形 成水凝胶，反应催化相邻HA分子上的两个酪胺加合物间形成共价键， 生成单个二酪胺交联。每个HA分子中通过生成数百个这样的二酪胺交 联从而生成了稳定的三维支架或水凝胶。交联反应的起始需要加入非 常稀的过氧化物(优选HA)，因为过氧化物酶的真正底物是过氧化物， 而不是HA。过氧化物酶对过氧化物的反应产物是由酪胺的羟基苯环优
先获取的自由基，从而生成二酪胺交联。二酪胺连接结构具有蓝色荧 光(见实施例2)，该性质可用于水凝胶成像和衡量水凝胶的交联程度。 由于交联反应是酶驱动的，水凝胶可以在生理条件下形成，因此在形 成中可以包含细胞或生物活性制剂，或直接与活体组织相邻而保持细 胞和组织的活性。
生成的水凝胶视觉上是透明的，根据起始T-HA的浓度的不同可具 有各种物理性质。例如，实验显示通过含有6.25、 12.5、 25、 50和100 mg/ml T-HA的T-HA溶液形成的水凝胶分别具有果冻、凝胶、生面团、 类弹力橡胶合成物(类似于橡胶球)和类软骨材料的物理性质——见 实施例3。这些材料在广泛的临床条件下具有应用潜力，包括用于整形 外科(即软骨、骨骼、肌腱、半月板、椎间盘等)和非整形外科(肾、 肝、胰腺等)组织的组织工程、基因和药物传递、体内移植的非生物 设备(即葡萄糖感应器、人工心脏等)的包被、伤口修复、生物感应 器设计和声带重建。
所述水凝胶的优良性质包括1)能够简单地进行鉴定和质量控制； 2)能够与现存组织基质整合；3)能够直接整合进新生成基质；4)能 够直接包含细胞和生物活性因子；5)能够保持生物相容性；6)能够 控制生物重吸收；7)能够简单地在复杂的解剖形态中制胶(见以下实 施例6);和8)能够呈现天然组织如关节软骨的机械性质。
结合以下一个或多个实施例对本发明的各方面进行进一步了解， 实施例提供于此作为例证。
实施例 实施例1
实验用量的本发明的具有二酪胺交联的酪胺取代透明质酸水凝胶 按照如下方法制备。HA以基于己糖醛酸的1 mg/ml的浓度溶解于250 mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES) ， 150mMNaCl， 75 mM NaOH， p朋.5的溶 液中，溶液中含有相对于HA羧基基团的摩尔浓度10倍过量的酪胺。 随后加入相对于HA羧基基团摩尔浓度10倍过量的EDC起始羧基基团 上的酪胺取代。将相对于EDC摩尔量的摩尔比为1/10的N-羟琥珀酰亚胺(NHS)加入反应通过形成活化酯协助EDC催化的酰胺化反应的进行。 反应在室温进行24小时，随后通过先后对150 mM NaCl和超纯水进行 彻底的透析及冻干将大分子从未发生反应的小分子量反应试剂如酪 胺、EDC、 NHS和MES中恢复过来。在冻干后，根据所需的最终水凝胶 的硬度，将酪胺取代HA (T-HA)产物以5 — 100mg/ml之间的操作浓度 溶解于PBS (该缓冲液与细胞悬液、体内组织接触以及交联反应兼容) 中进行不同浓度的制备。可选择的，溶剂可以是除了 PBS以外的其它 任何合适的溶剂，只要溶剂对酶活性基本没有负面影响且不会通过选 择性吸收由酶产生的自由基而干扰交联反应的发生。合适的替换溶剂 包括水、传统的生物组织培养基和细胞冷冻液(通常由大约90%的血 清和大约10%的二甲亚飒)。在将细胞悬浮(见实施例5)或在体内 与组织接触之前，应将T-HA通过0. 2 Mm的滤器过滤。随后在每一个 T-HA制备中加入10 U/ml II型山葵过氧化物酶(HRP)进行酪胺一酪 胺连接。加入小体积(卜5 W)的稀过氧化氢溶液(0.012%-0.00012Q/0 终浓度)起始交联以生成最终具有理想硬度的水凝胶。为了制备更大 量或大体积的理想水凝胶，本领域的普通技术人员可以将本节中提供 的试剂量适当放大。
实施例2
进行实验确定本发明的T-HA大分子网络的酪胺取代(以及随后的 二酪胺交联)程度。首先，根据上述方法制备3种配方的(未交联的) 酪胺取代透明质酸(T-HA)，命名为OX、 1X或10X。 OX配方的制备不 使用EDC (即不含有碳二亚胺)，意味着不存在碳二亚胺介导酪胺NH2 基团和HA分子C02H基团之间生成酰胺键的反应。因此，OX配方可被 视作对照。IX配方在反应混合物中含有与HA分子上的C02H基团量的 化学计量比为l: 1的EDC。 IOX配方在反应混合物中含有与HA分子上 的C02H基团量的化学计量比为10: 1 (或10倍过量)的EDC。在所有 三个配方中，酪胺的化学计量过量都是相对于HA的C02H基团的数量而 言的。在所有三个配方(OX、 IX和10X)中，反应试剂和配方中适量 的EDC在试剂瓶中混合并摇晃加速酪胺取代反应。所有的配方在室温
反应24小时，随后透析试剂瓶中的内容物去除未发生反应的酪胺分子、
EDC和反应副产物酰基脲(EDU)。由于酪胺、EDC和EDU的体积相对 于大分子HA而言比较小，通过透析很容易将这些分子与HA和任何已 生成的T-HA分子分离。 一旦去除了未发生反应的酪胺和EDC，对每个 配方的剩余物进行分析以确定对于HA分子上的所有可利用的C02H总数 的酪胺取代率。
酪胺在275 nm出现UV吸收峰，根据酪胺标准曲线可以容易地观 察出酪胺取代程度。根据对上述三种T-HA配方的UV光谱分析发现在 没有EDC存在时(配方0X)进行的HA-酪胺取代反应在HA分子上发生 的酪胺取代几乎为0。该结果证实了在酪胺取代反应中使用碳二亚胺反 应途径的重要性。但是，酪胺取代反应中以l: 1 EDC: C02H的化学计 量比制备的T-HA配方中的酪胺吸收显示HA链上所有可用的C02H基团 中的酪胺取代率大约为1.7%。 IOX配方(10: 1 EDC: C02H)造成了大 约4. 7%的取代率。
随后，将过氧化氢和山葵过氧化物酶(HRP)以5mg/ml的浓度分 别加入三个透析过的HA/T-HA配方中(0X、 IX和10X)，生成的配方 发生反应直至反应完全。在加入过氧化物和HRP的反应完成后观察到 OX配方仍保持完全的液体，具有明显的弯月面；没有观察到凝胶的形 成，证实了在没有使用EDC的酪胺取代反应中没有或基本没有发生酪 胺取代的事实。IX配方只观察到微弱的弯月面且试剂瓶中的内容物已 经凝胶化，证实发生了酪胺取代和交联。IOX配方形成了较硬的凝胶， 事实上相对于容器中初始的液体体积发生了收縮，在其上部留有一定 量的液体(具有弯月面)。IOX配方制备的胶(有4.7%的酪胺取代率) 比具有1. 7%酪胺取代率的IX配方坚硬很多。
二酪胺结构暴露在UV光下呈现出蓝色荧光。将上述各配方的产物 暴露于UV光下以观察二酪胺交联的存在。和预期的相同，IX和IOX水 凝胶均呈现出蓝色荧光(IOX水凝胶的荧光比1X水凝胶的荧光更强)， 但是OX配方完全没有蓝色荧光。结果证实在IX和10X水凝胶中存在 二酪胺交联，在较硬的水凝胶(10X)中生成的二酪胺比在较软的水凝 胶(IX)中更多。
总的结果证明了碳二亚胺介导的反应途径的重要性，证实了本发
明中由交联T-HA网络形成的水凝胶的相对硬度与二酪胺交联程度成正 比，二酪胺交联程度与HA上的酪胺取代程度成正比。相当惊人和出人 意料的结果是根据本发明，即使1.7%的酪胺取代率(以及随后形成二 酪胺的连接率)仍可提供合适强度的T-HA凝胶(或水凝胶)。4.7%的 取代率(和交联)甚至生成了更加坚固的T-HA凝胶。同样惊人的是在 反应混合物中存在的相对于羧酸基团量以化学计量10倍过量的碳二亚 胺(EDC)(配方10X)仅造成了大约4.5_4.7%的酪胺取代率，虽然 可以得到稳定和粘着的酪胺交联T-HA网络。
这些结果意味着虽然生成的网络是粘着稳定的水凝胶，HA分子上 的大部分羧酸基团没有发生取代和酪胺交联而基本保持与天然HA分子 中的一样。因此，当本发明的网络在体内用作软骨取代物时，由于和 正常软骨中的HA相比，本发明的T-HA网络或凝胶中的大部分HA分子 基本没有改变，人们相信身体的天然代谢途径(需要或不需要T-HA网 络中提供的细胞的帮助)可将本发明的网络看作天然生物材料并能够 进行与其相关的普通的合成和代谢功能。此外，人们注意到在身体内 HA是一种高度普遍存在的材料且在人体内不产生免疫性。因此，人们 相信本发明的含有大量未发生改变的天然HA的交联大分子网络将在广 泛的希望或必须在人体中提供合成组织的组织工程应用中具有重要应 用。这标志着技术状态的显著进步。因此，非常让人吃惊地，高度的 酪胺取代，例如大于大约10-20%的取代可能是不希望的；上述实验证 明生成合适的T-HA网络并不需要高度的取代。优选地，本发明的二羟 基苯(例如二酪胺)交联聚羧酸酯(例如HA)网络基于聚羧酸酯(HA) 分子上的C02H总量的羟基苯(酪胺)取代率的百分比低于50，优选地 低于40，优选地低于30，优选地低于20，优选地低于15,优选地低 于10，优选地低于9，优选地低于8，优选地低于7，优选地低于6， 优选地低于5。
实施例3
传统地，人们已经相信天然软骨具有粘弹性，并且主要由于聚集 蛋白聚糖基质中存在的相邻硫酸软骨素链上负电性的so42—基团之间的 排斥力，天然软骨能够抵抗变形和吸收压縮载荷。进行试验确定本发 明中只含有二酪胺交联透明质酸分子(即没有聚集蛋白聚糖和硫酸软 骨素)的大分子网络在没有so42—基团的情况下与天然软骨相比在抵抗 变形和吸收压力方面的功效。根据实施例1制备和纯化未交联的具有
大约5%酪胺取代率的T-HA配方。基于该T-HA配方，制备五种不同的 T-HA浓度
浓度l: 6.25 mg T-HA/ml PBS;
浓度2: 12.5 mg T-HA/ml PBS;
浓度3: 25 mg T-HA/ml PBS;
浓度4: 50 mg T-HA/ml PBS;
浓度5: 100 mg T-HA/ml PBS。
以上各制备随后在过氧化氢和山葵过氧化氢酶的存在下发生反 应，和实施例1中一样在T-HA分子间形成二酪胺交联从而相应地生成 水凝胶l、 2、 3、 4和5。令人吃惊和出乎意料地发现根据制备中T-HA 浓度的不同，五种水凝胶成为具有不同物理性质的稳定和基本粘着的 材料。例如，浓度1生成的水凝胶具有与凡士林或果冻相当的硬度和 流变学性质；水凝胶稳定且粘着，然而用诸如抹刀或其它传统工具施 加外力可以引起流动或伸展。水凝胶1具有极佳的粘性，是外科手术 如眼外科手术中外科器械的非过敏性包被材料的理想候选材料。水凝 胶2比水凝胶1更加坚硬，这是由于制备中T-HA的浓度更高及随后可 预见的T-HA浓度的增加引起的分子内交联的减少和分子间交联的增 加。水凝胶2呈现出凝胶特征性的流变学和硬度性质，以及对于外部 载荷一定程度的粘反弹力。在更大的载荷下，水凝胶2不会流动而是 破裂成小碎片，这也是凝胶材料的特征。水凝胶3具有生面团或可延 展面团的性质和一致性，在施加外部载荷力时也不会流动。和水凝胶l 和2相比，该材料显示出更强的粘弹性。水凝胶4是高度坚硬和粘着 的凝胶，能够很强地抵抗外力不会破裂。水凝胶4是具有高度弹力的 类橡胶合成物，在突然性压力(如摔在地板上)下可以产生弹力。水 凝胶4这种对于突然性压力产生弹力的能力使其在一些关节置换/修复
应用中成为理想的材料，这些关节要经受重复性的或周期性的压力载 荷(如踝关节)。除了所述水凝胶4的性质外，水凝胶5具有类软骨性 质，外观类似关节软骨且用手术刀片切割时具有软骨的感觉。
进行封闭抗压测试以定量地确定上述五种不同的水凝胶的压縮机 械性质。封闭抗压测试使用定制的聚碳酸酯封闭箱和多孔的聚丙稀滤
器滚筒(20 Mm孔，20%有孔率)。用封闭箱和以下实施例4所述的冷 冻一融解技术制备五个具有各水凝胶浓度的圆柱形栓(直径为7. 1 mm， 厚度大约3mm)。随后按照下列测试步骤进行封闭抗压中的一系列应力 释放实验。所有实验用Instron 5543测试仪在电脑控制下进行，机器 以10 Hz的频率记录时间一位移—载荷数据。每个实验均使用士5 N或 ±50 N的荷重仪(Sensotec)对载荷量全程跟踪。每一步使用30 Mm (30 Mm/秒)的速度，该速度相当于1%的张力，直至样品达到平衡。 这被定义为弛豫率，当该弛豫率减慢至10 mN mirf i以下时，下一步自 动启动直至完成20个循环(相当于大约20%的张力)。封闭抗压测试 中各样品的厚度采用机械法确定，通过Instron 5543仪测量抗压反应 引起的样品相对于箱底的位移。测试的厚度用于计算每一步的张力百 分比。
五种水凝胶的压縮机械性质通过前一节所述的方法确定。载荷数 据用样品横剖面面积(39. 6 mm2)进行标准化以计算应力。每种材料配 方的平衡应力对所加张力描点作图。每一步的聚集系数定义为平衡应 力除以所加张力。对于每种材料，聚集系数定义为平衡应力一张力数 据在线性最好的范围内的斜率。图4显示了封闭抗压测试的结果。所 有五种水凝胶均可以进行封闭抗压测试并在测试中证明了典型的两相 材料(如软骨)特征性的张力弛豫反应。6. 25 mg/ml和12. 5 mg/ml H-TA 水凝胶的聚集系数比关节软骨低1_2个数量级。25 mg/ml T-HA水凝 胶的聚集系数是关节软骨的报道值的一半。50和100 mg/ml T-HA水凝 胶的聚集系数在线性区域小于关节软骨的报道值，但是大于关节软骨 在15 — 20%张力下的值。这些数据证明了用标准机械分析可以对水凝 胶进行鉴定，并且证明了可以生成与关节软骨具有相似机械性质的水 凝胶。
基于以上实验，惊人并出人意料地发现二酪胺交联的透明质酸网 络可以生成粘着的水凝胶材料，为了适应特定的应用，通过在对酪胺
基团进行交联前变化T-HA的浓度可以改变水凝胶的硬度和其它物理性
质(流变学)。即使网络中没有(或基本没有)任何so广基团提供电荷
一电荷排斥力产生材料的抗压性和弹性，仍然观察到这些水凝胶的粘 着性和弹性。这个相当惊人和出乎意料的结果在组织工程应用中可能 具有相当积极的作用。透明质酸是在人体内发现的高度普遍存在和无 免疫反应性的分子。因此，由二酪胺交联透明质酸网络组成的水凝胶 可以成为非常合适的组织置换材料移植入人体内，其硬度可以根据应 用的需要加以调节。由于这些材料主要由没有发生改变的无免疫反应 性的透明质酸组成，人们相信该材料可能引起的免疫反应为零或接近 于零。这是和很多传统组织工程材料相比具有的重要优势，传统材料 由于在化学合成中苛刻的反应条件或反应试剂，其在体内的应用受到 阻碍，且材料最终的化学结构具有更大的诱发免疫反应的可能。
实施例4
己经发展了多种制备方法用于在事先确定的三维形状中制备或形
成水凝胶，诸如上述实施例3中的水凝胶。这对于很多组织工程应用
非常重要，这些应用中必须将人工组织材料填入病人的天然组织缺陷 或空洞中。
第一种方法是采用原位点形成技术，在该技术中水凝胶在原位置 形成，即以最终应用的位置和结构的形状形成。此原位点形成方法按
如下实验方法进行。酪胺取代透明质酸(T-HA)通过在此描述的碳二 亚胺介导途径制备。在透析去除未反应的酪胺、EDC、 NHS等以及将产 物以理想浓度溶解于PBS中后(见以上实施例l)，将小量山葵过氧化 物酶加入T-HA制备液体中形成第一溶液。将第一溶液加入内部具有特 定几何形状的实验室容器中(模拟体内位点)。随后，制备含有很稀的 过氧化氢的第二溶液(终浓度为0. 012%_0. 00012%)。随后将相对于第 一溶液而言小体积的第二溶液注射进已经装有第一溶液的容器从而起 始二酪胺交联反应生成水凝胶。通过该技术制备的水凝胶具有以上实
施例3中所述的不同的硬度和流变学性质，并且很好地与制备容器的 内表面轮廓吻合。由于主要的试剂(H202、透明质酸和过氧化物酶)是
非过敏性分子或扩散性分子，并且由于交联反应在代谢的温度和pH下
进行，该技术可作为手术程序在病人体内的手术位点操作，从而生成 缺陷适配水凝胶。该方法对于面部重建手术特别具有吸引力，该手术
中外科医生可以将未交联的T-HA制备物(包含过氧化物酶)进行皮下 注射并操作以形成理想的面部轮廓，随后通过注射小体积的过氧化氢 溶液使水凝胶发生交联。
第二种方法是多孔模具技术，适合形成具有更复杂三维结构的水 凝胶。该技术中首先根据所需最终结构的形状和轮廓制备多孔中空模 具。例如，如果需要立方形水凝胶，制备的模型可以具有立方体形的 内表面。模具可以用传统的多孔材料通过传统技术制备或浇铸，例如 熟石膏、多孔或烧结塑料或金属等。在特别优选具体实施方案中，模 具用纤维素透析膜制备。按以上方法制备第一和第二溶液，将第一溶 液装入多孔模具中空的模巢中。随后，将装满的模具用极稀的过氧化 物浴浸没。大分子T-HA和过氧化物酶由于其分子尺寸不能从多孔模具 中扩散出模具，但是非常小的过氧化物分子(H202)能够扩散进模具并 在过氧化物酶的存在下发生反应生成二酪胺交联。在该方法中交联自 外向内发生生成最终的水凝胶形状，且在过氧化物浴中需要一定程度 的试错法以决定最优的或充分的浸没时间。本领域的普通技术人员有 能力确定这段时间的长短。通过这种多孔模具技术在实验室实验中已 经成功完成了三维水凝胶的制备。
第三种方法是冷冻—融解技术，该技术适用于制备具有预先确定 的高度复杂三维形状的本发明的水凝胶，例如人耳内部折回。在该技 术中，模具用柔软的或有延展性的材料制备，如具有低玻璃转换温度 的多聚体材料，例如低于一8(TC。优选的模具材料是具有低玻璃转换 温度的硅树胶，如玻璃转换温度大约为一127。C的聚二甲基硅氧烷，当 然其它合适的低玻璃转换温度的硅树胶(例如低于一8(TC)及其它多 聚体也可以使用。首先通过传统或适用技术(即模压成形法、雕刻法 等)制备硅树胶(首选材料)，使其内部模巢和所需的水凝胶部分的表
面形状、轮廓和体积吻合。如上制备第一和第二溶液并将第一溶液加 入硅树胶模的内部模巢中。充填后的硅树胶模随后通过与固体C02 (干 冰)接触冷冻至大约一8(TC。由于第一溶液主要是水，溶液冷冻成固 态冰的形式与模具的内表面的形状和轮廓吻合。但是，玻璃转移温度
低于一8(TC的硅树胶模仍然是柔软且有延展性的，可以轻易地将第一
溶液的固态冰形式取出。由于第一溶液在冷冻时发生膨胀，应当使用 合适的机械器材确保在溶液膨胀时硅树胶模不会变形或膨胀。优选地， 在模中提供出入孔，当第一溶液在冷冻过程中膨胀时允许溶液的膨胀 及释放。
一旦第一溶液的固态冰形式被制成模，三维结构中微小的缺陷或 瑕疵可以使用合适的工具通过雕刻加以修复，且可以加入更多的液态 第一溶液充填表面空洞，液体通过和固态冰形式接触瞬间冻结。同样 地，如果希望保证一致的温度以及确保所有加入的第一溶液材料的冻 结，可以将冰放回干冰表面。 一旦冰的三维形状完美形成，将其浸没 于液态过氧化物溶液中自外而内地起始冰冻水的融化及二酪胺的交 联。由于交联反应的快速动力学，这种方法是可行的。当形成的水凝 胶的中心最后剩余的冰冻水融化时认为交联完成，由于形成的水凝胶 基本透明，所以很容易观察到交联的完成。
根据该冷冻一融解技术已经进行了非常成功的实验生成了人耳形 状的本发明的固体水凝胶。通过这种方法可以形成的其它结构，如椎 间盘、半月板等，对于本领域的技术人员而言是显而易见的。在该冷
冻一融解技术中应当注意的是，模具材料的临界玻璃转移温度一8(TC 是大致根据固体C02 (干冰)的表面温度选择的，从而确保在第一溶液 冷冻生成固态冰的形式时模具材料不会变得易碎。但是如果使用C02 以外的其它冷冻材料，合适的模具材料的临界玻璃转移温度可以相应 的调整。
对于上述生成水凝胶的三种方法，第一溶液含有过氧化物酶和 T-HA，而第二溶液含有过氧化物。尽管可以交换第一和第二溶液中的 过氧化物酶和过氧化物，但将过氧化物与T-HA加入第一溶液并非优选。 这是因为一旦将过氧化物、过氧化物酶和T-HA混合，T-HA迅速地开始形成交联的大分子网络。如果过氧化物酶(过氧化物酶是大分子)还
没有均匀地分布于T-HA内，过氧化物酶可能不能或基本难以通过形成 的水凝胶的孔扩散，难以在整个T-HA/过氧化物溶液中生成均一的交 联。结果可能导致T-HA不均一的和/或不完全的交联和不均一的水凝 胶。相反地，相对小的过氧化物分子(过氧化氢只比水大一个氧原子) 可以相对容易地通过水凝胶的孔结构进行扩散，生成均一的水凝胶结 构。
此外，过氧化物酶的大分子量使得其与T-HA类似地保留在多孔模 具中，该模具只对小分子量过氧化物具有渗透性，过氧化物可以通过 模具和新生成的大分子网络(即水凝胶)轻松且均一地发生扩散。由 于这些原因，优选在第一溶液中均一分布过氧化物酶和T-HA，在第二 溶液中单独提供过氧化物。
第四种方法是交互喷雾层覆或刷涂层覆技术。按上述方法制备第 一溶液并包含过氧化物酶和T-HA。但是，第二溶液不仅含有上述的过 氧化物，并且含有与第一溶液相同浓度的T-HA。随后将第一溶液的薄 层涂在所需位点(原位点)随后覆盖上第二溶液的薄层。重复该步骤 连续交替喷刷第一和第二溶液层直至缺陷或使用位点充填完成。非常 薄的第一和第二溶液的交替层促进了二酪胺交联的完成，确保了最终 水凝胶的高度一致性，且水凝胶具有理想的由两溶液的起始T-HA浓度 决定的流变学性质。理想的液体层很薄，以确保第一溶液层中过氧化 物酶生成的自由基能够完全渗透进相邻的第二溶液层并完成交联，该 交联不依赖于过氧化物酶向第二溶液层的扩散(见上)。在两溶液中均 包含T-HA从而保证在最终水凝胶中均一的T-HA浓度。在实验室实验 中已经完成了该技术并生成了轮廓吻合和大量充填的均一的水凝胶。 当需要生成薄而变化的酪胺交联HA层时该技术高度适用，如在骨关节 炎裸露的关节的表面，在病人的移植位点几乎没有健康的软骨。
以上所有四种技术对二酪胺交联透明质酸进行描述，但是应该知 道在本发明的范围内的其它组合(其它二羟基苯交联大分子，如聚羧 酸酯、聚胺、聚羟基苯分子和它们的共聚物)可以通过以上技术制模。
实施例5
将大鼠的软骨细胞埋入(交联的)T-HA水凝胶中以测试它们在交 联反应中的存活能力。将活细胞加入第一溶液与T-HA和过氧化物酶共 同分散，随后加入含有过氧化物的第二溶液起始二酪胺交联，于是分 离得到的软骨细胞被悬浮于实施例2中描述的1. 7%和4. 7%的T-HA水 凝胶中。埋有软骨细胞的1. 7%和4. 7%T-HA水凝胶中均一地分布了软骨 细胞，且凝胶视觉透明，整个凝胶具有可视性。采用葡萄糖利用作为 交联形成水凝胶后细胞活力的指示剂，因为软骨细胞对于葡萄糖消耗 巨大，在少于24小时内耗尽葡萄糖培养基。结果显示埋于T-HA水凝 胶中的软骨细胞与在单层中培养的相同的软骨细胞在24小时中具有基 本相同的葡萄糖消耗情况(图5)。该情况持续长达7天，说明细胞是 活的且代谢活跃。培养基葡萄糖通过标准己糖激酶分析进行测试。
对于含有软骨细胞和软骨组织的T-HA水凝胶的冻结部分还进行了 荧光成像。水凝胶骨架和软骨基质的HA样品通过生物素标记的HA结 合蛋白(b-HABP)试剂荧光染色成像，而细胞核用标准的DAPI染色成 像。b-HABP试剂用纯化的软骨聚集蛋白聚糖(只含G1结构域)和连接 蛋白制备，该试剂识别并不可逆地与天然HA片断结合，这些片断正常 情况下与软骨中的聚集蛋白聚糖和连接蛋白相结合。结果显示b-HABP 对T-HA水凝胶的染色比对软骨染色效果更强，因为组织中的透明质酸 已经结合了天然聚集蛋白聚糖和连接蛋白。在水凝胶T-HA骨架和悬浮 的软骨组织基质之间没有明显分别意味着严密的整合。这些结果证明 了在水凝胶交联反应中保持软骨细胞活性的可行性，以及水凝胶严密 地整合进己存在的软骨基质的能力，两者均对软骨修复的应用非常有 利。结果还证明T-HA中足够多的片段在化学上保持不变，并可以在原 位点与新合成的聚集蛋白聚糖和连接蛋白结合。结果还证实氧气、二 氧化碳、葡萄糖和胰岛素可以在本发明的T-HA水凝胶中以一定速率扩 散，该速率对软骨细胞代谢不发生限制，这不仅对于软骨置换物非常 重要，而且对于其它应用如葡萄糖感应器设计和人工肾的发展非常重 要。
为了将细胞如软骨细胞加入用实施例4中的冷冻/融解技术以复杂
的组织形态制模的水凝胶中，人们希望酶驱动交联反应在标准的细胞
冷冻溶液的存在下进行，比如包含10%二甲亚砜(DMS0) /90%胎牛血 清(FBS)的细胞冷冻溶液。这一点己在实验室中通过实施例3中描述 的所有T-HA水凝胶配方加以了证实。能够直接加入含有90%FBS的溶 液也证明了反应中可以包含生物活性因子，如生长因子、荷尔蒙和控 制细胞分化的因子，因为这些因子是FBS的正常组分。
虽然上述具体实施方案组成了优选实施方案，应该清楚的是，在 不悖离所附权利要求书中所述的本发明的精神和范围的情况下，可以 对本发明进行各种改变或修正。
权利要求
1.一种制备水凝胶的方法，所述方法包括的步骤有a)提供含有过氧化物酶或过氧化物的第一溶液，但溶液中不同时含有上述两种物质，溶液中还含有选自羟基苯取代聚羧酸酯、羟基苯取代聚胺、其它聚羟基苯分子以及它们的共聚物的大分子；b)提供第二溶液，该溶液含有所述第一溶液中没有提供的所述过氧化物酶或过氧化物中的一种；以及c)混合所述第一和第二溶液促使二羟基苯交联以形成所述水凝胶。
2. 如权利要求1中所述的方法，所述方法进一步包含无孔模具， 所述模具的内模巢与所需水凝胶部分的形状、轮廓和体积吻合，所述 方法还包括在所述内模巢中混合第一和第二溶液生成具有内模巢形状 的所述水凝胶。
3. 如权利要求1中所述的方法，所述方法进一步包含的步骤有d) 提供用多孔材料制作的模具，所述模具具有与所需水凝胶部分 的形状、轮廓和体积吻合的内模巢；e) 在所述模具的所述内模巢中提供所述第一溶液；以及f) 将其中含有所述第一溶液的所述多孔模具浸没于所述第二溶液浴中从而促使所述的二羟基苯交联和所述水凝胶的生成。
4. 如权利要求1中所述的方法进一步包含的步骤有d) 提供用柔韧材料制作的模具，所述模具具有与所需水凝胶部分 形状、轮廓和体积吻合的内模巢；e) 在所述模具的所述内模巢中加入所述第一溶液；f) 冷却所述模具，冻结内模巢中的所述第一溶液，生成具有所述 内模巢形状的固态冰形式；以及 g)将所述固态冰形式浸没于所述第二溶液浴中由此促使冻结水 的融解和二羟基苯的交联以形成所述水凝胶。
5.如权利要求1中所述的方法，所述第二溶液进一步包含所述大 分子，所述步骤进一步包含在位点交替使用第一和第二溶液层由此促 使所述二羟基苯交联和所述水凝胶的形成。
全文摘要
本发明提供了二羟基苯交联的大分子网络，该网络可用于人工组织和组织工程应用中，如人工或合成软骨中。在该网络制备中首先提供聚胺或聚羧酸酯大分子(在分子链上分别带有多个胺基或羧酸基团)，该大分子若是聚胺，则将其与带有自由羧酸基团的羟基苯化合物反应，若是聚羧酸酯，则与带有自由一级胺基团的羟基苯化合物反应，通过碳二亚胺介导的反应途径将羟基苯化合物取代至大分子上生成羟基苯取代大分子。随后在代谢的温度和pH条件下，在分别与不同大分子相连的两个羟基苯基团间发生酶催化二聚化反应，从而将该大分子连接至另一大分子上。在优选具体实施方案中，大分子网络由通过二酪胺键连接的酪胺取代透明质酸分子组成，从而提供了具有理想物理性质的稳定、粘着的水凝胶。本发明还提供了制备该网络的方法。
文档编号C08G63/91GK101366974SQ200810088049
公开日2009年2月18日 申请日期2004年1月9日 优先权日2003年1月10日
发明者安东尼·卡拉布罗, 安尼克·B·达尔, 理查德·A·格罗斯 申请人:克利夫兰临床基金会