专利名称：径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，尤其是一种径向色谱纯化天然可溶性多糖的 方法。
背景技术：
早在20世纪50年代，随着色谱技术不断研究，径向色谱迅速发展起来。 这种色谱技术主要是Rhee et al将传统的轴向色谱演化而来的，目前这种色谱 已经广泛的被应用于分子分离技术。
在径向色谱与轴向色谱相比较的相关报道中，径向色谱都显示出了处理 量大、速度快的优点，同时还具有样品在起始处与填料接触面积大和在出液 口汇聚的特点。到了20世纪80年代中期，径向色谱技术开始实现工业化，主 要应用于蛋白质的分离纯化，如单克隆抗体的纯化、IGase酶的分离纯化和人 尿激肽释放酶的分离纯化等方面，然而径向色谱运用于分离纯化多糖的研究 鲜有报道。
天然多糖主要是从动物、植物、真菌及微生物或其分泌物中提取分离得 到的，是一种极性大分子化合物。但是一般植物组织或动物组织中提取的粗 多糖通常会存在多种不同多糖及杂质，因此要将不同分子量或组成的多糖分 离开来或除去其中非糖组分，需要对多糖混合物进行分离和纯化。常用的多 糖分离纯化方法有以下几种分部沉淀法、季铵盐沉淀法、盐析法、金属络 合物法及柱层析法等，其中柱层析法包括离子交换层析和凝胶层析两种方法。
离子交换层析是根据被分离多糖所带阳或阴离子与带相反电荷的离子交 换剂间的静电结合，即根据物质的酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附 和脱吸附而将待分离溶液各多糖组份分开；样品加入后，用电解质溶液或缓 冲液进行洗脱，基于电荷不同的各种物质对离子交换剂有不同的亲和力，通 过改变洗脱液离子强度及pH值，控制这种亲和力，使这些多糖不同组分及杂 质按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来，从而达到分离和纯化的目的。
凝胶层析是将粗多糖的溶液缓慢地流经凝胶色谱柱，各分子在柱内同时 进行着两种不同的运动沿流动相方向移动和在凝胶固定相内无定向的扩散
运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布在 颗粒之间，所以在洗脱时向前移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗 粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在流动 相洗脱过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的移动速度落后于大分子物质，从而使样品 中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，从而 将不同的分子量的多糖分离或将多糖与小分子非糖杂质分开。
发明内容
本发明提供一种径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，是利用径向色谱 样品和流动相从柱的外周向柱圆心会聚且处理量大、速度快的特点对天然可 溶性多糖进行分离纯化。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案
一种径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，其特征在于粗多糖溶液进 入径向色谱柱后，由色谱柱的周围向中心流动，流经色谱柱填充的固定相， 用相应的溶剂作流动相进行洗脱，然后由中心出液口流出。
而且，所述色谱柱固定相半径R应大于或等于lcm。
而且，所述粗多糖从动物、植物、真菌及微生物或其分泌物中得到，包 括壳聚糖、人参多糖、发菜多糖、螺旋藻多糖、当归多糖、灰树花多糖、猪 苓多糖、茯苓多糖、灵芝多糖、芦荟多糖、紫菜多糖、莲子心多糖、茶多糖、 银耳多糖、浒苔多糖、香菇多糖、黄原胶、结冷胶、肝素、硫酸软骨素、柴 胡多糖、短梗霉多糖、冬虫夏草多糖、枸杞多糖、石斛多糖、普鲁兰多糖黄 芪多糖、银耳多糖、当归多糖、木耳多糖、苦瓜多糖、天麻多糖、短梗霉多糖、右旋糖酐和小核菌萄聚糖等，其分子量在5,000 5,000,000范围内，并含 有一种以上多糖组分，或多糖总含量<97%，在水溶液中溶解度在常温下大于 0.2g/L。
而且，所述粗多糖溶液通过水提或醇提而得多糖粗提物，醇提时乙醇与 水以各种比例混和。
而且，所述径向色谱柱固定相是离子交换树脂或凝胶树脂的阳离子交换 树脂或阴离子交换树脂，如苯乙烯型离子交换树脂、丙烯酸系离子交换树脂、 琼脂糖离子交换树脂、交联葡聚糖离子交换树脂及纤维素离子交换树脂。
而且，所述径向色谱柱固定相可以是凝胶树脂，包括交联葡聚糖凝胶、 琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和聚苯乙烯凝胶，其凝胶类型为G-10、 G-15、 G-25、 G-50、 G-75、 G-IOO、 G-150、 G-200， Sephadex LH-20 、 Sepharose 和 Styrogel。
而且，所述洗脱流动相分别是指，离子交换层析中的洗脱液是浓度为0 4.7mol/L的KC1溶液、浓度为0 6.2 mol/L的NaCl溶液、浓度为0 9.4 mol/L 的NH4C1溶液以及磷酸氢盐如钠盐、钾盐或铵盐与磷酸二氢盐如钠盐、钾盐 或铵盐组成的缓冲溶液，或者是三羟甲基氨基甲烷(Tris) -NaCl缓冲液、 Tris-KCl缓冲液；其中凝胶层析中的洗脱液是去离子水或蒸馏水。
本发明的优点和积极效果是
本发明在进行色谱分离时流动相由色谱柱的周围向中心流动，携带多糖 沿径向流经固定相，使得多糖中不同的物质由于其在固定相中移动速度不同 而分离开来，达到分离纯化多糖不同成分的目的。本发明径向色谱柱具有样 品在起始处与填料接触面积大和在出液口汇聚的特点，可对天然可溶性多糖 进行分离纯化。
图1是本发明径向色谱柱结构简图； 图2是本发明离子交换层析洗脱曲线； 图3是本发明凝胶层析洗脱曲线。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是 限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中径向色谱柱1是由两个滤网4构成的同轴多孔圆环组成，参见 图1，两个滤网中间空间用来填充固定相填料。径向色谱纯化天然可溶性多 糖的方法是填料自填料口2进入，由出料口5出料；流动相和样品从进液 口 3进入，由圆柱的周围通过外多孔滤网径向进入填料固定相向中心迁移， 最后通过内多孔滤网由出液口 6流出，样品内不同组分由于在固定相内迁移 的速度不同而实现彼此分离。
下面通过具体示例来进一步证明本发明的先进性。
示例1:
(1) .选用DEAE-650M阴离子交换树脂填充满径向色谱柱(尺寸见图1)， 称取15mg发菜粗多糖溶于去离子水配成浓度为0.5mg/mL的多糖溶液，离心 除去沉淀后，进行离子交换层析。
(2) .用1000mLNaCl溶液从01.0 mol/L进行线性梯度洗脱，洗脱速度为 lmL/min，利用部分收集器收集洗脱液。
(3) .采用苯酚一硫酸法检测各管的吸光度A490，以洗脱体积为横坐标，吸
光度值和NaCl溶液的浓度梯度变化为纵坐标做图，得多糖的离子交换层析 洗脱曲线，见图2。从图中可以看到，洗脱曲线呈三个独立的峰，即发菜多 糖呈三个不同组分，并且第一个峰和第二个峰的分离度R12以及第二个峰和 第三个峰的分离度R23在经过径向色谱柱后分别达到1.191和l.OOl(分离度， 又称为解析度、分辨率，是色谱图中相邻两峰分离程度的量度)。
(4) .将三个不同峰的洗脱液分别合并，透析，冷冻干燥，依次得NaCl含 量约为1.5%的三个不同单组分多糖4.2mg、 4.5mg和3.9mg。
示例2:
(1) .选用凝胶G-100填充自制径向色谱柱(尺寸见图1)，称取3mg发 菜多糖(实施例1中得到的第1组分的发菜多糖)，溶于去离子水配成浓度 为0.5mg/mL的多糖溶液，离心除去沉淀后，进行凝胶层析以除去所含大部 分电解质NaCl。
(2) .用200mL去离子水进行洗脱，洗脱速度为0.3 mL/min，利用部分收 集器收集洗脱液。
(3) .采用苯酚一硫酸法检测各管的吸光度A490，以洗脱体积为横坐标，吸
光度值和NaCl的电导率变化为纵坐标做图，得多糖的凝胶层析洗脱曲线(见 图3)。
(4) .将两曲线交点处之前的洗脱液合并，减压浓縮，冷冻干燥，得NaCl 含量为0.06%的发菜多糖2.4mg。
权利要求
1. 一种径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，其特征在于粗多糖溶液进入径向色谱柱后，由色谱柱的周围向中心流动，流经色谱柱填充的固定相，用相应的溶剂作流动相进行洗脱，然后由中心出液口流出。
2. 根据权利要求1所述的径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，其特征 在于所述色谱柱固定相半径R大于或等于lcm。
3. 根据权利要求1所述的径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，其特征在于所述粗多糖从动物、植物、真菌及微生物或其分泌物中得到，包括壳 聚糖、人参多糖、发菜多糖、螺旋藻多糖、当归多糖、灰树花多糖、猪苳多 糖、茯苓多糖、灵芝多糖、芦荟多糖、紫菜多糖、莲子心多糖、茶多糖、银 耳多糖、浒苔多糖、香菇多糖、黄原胶、结冷胶、肝素、硫酸软骨素、柴胡 多糖、短梗霉多糖、冬虫夏草多糖、枸杞多糖、石斛多糖、普鲁兰多糖黄芪 多糖、银耳多糖、当归多糖、木耳多糖、苦瓜多糖、天麻多糖、短梗霉多糖、右旋糖酐和小核菌萄聚糖等，其分子量在5，000 5,000,000范围内，并含有一 种以上多糖组分，或多糖总含量<97%，在水溶液中溶解度在常温下大于 0.2g/L。
4. 根据权利要求1所述的径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，其特征 在于所述粗多糖溶液通过水提或醇提而得多糖粗提物，醇提时乙醇与水以 各种比例混和。
5. 根据权利要求1所述的径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，其特征在于所述径向色谱柱固定相是离子交换树脂或凝胶树脂的阳离子交换树脂 或阴离子交换树脂，如苯乙烯型离子交换树脂、丙烯酸系离子交换树脂、琼 脂糖离子交换树脂、交联葡聚糖离子交换树脂及纤维素离子交换树脂。
6. 根据权利要求1或5所述的径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，其特征在于所述径向色谱柱固定相可以是凝胶树脂，包括交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和聚苯乙烯凝胶，其凝胶类型为G-IO、 G-15、 G-25、 G-50、 G-75、 G-IOO、 G-150、 G-200, Sephadex LH-20、 Sepharose和 Styrogel 。
7. 根据权利要求1所述的径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，其特征在于所述洗脱流动相分别是指，离子交换层析中的洗脱液是浓度为0 4.7mol/L的KC1溶液、浓度为0 6.2 mol/L的NaCl溶液、浓度为0 9.4 mol/L 的NH4Cl溶液以及磷酸氢盐如钠盐、钾盐或铵盐与磷酸二氢盐如钠盐、钾盐 或铵盐组成的缓冲溶液，或者是三羟甲基氨基甲烷(Tris) -NaCl缓冲液、 Tris-KCl缓冲液；其中凝胶层析中的洗脱液是去离子水或蒸馏水。
全文摘要
本发明涉及一种径向色谱纯化天然可溶性多糖的方法，其中粗多糖溶液进入径向色谱柱后，由色谱柱的周围向中心流动，流经色谱柱填充的固定相，用相应的溶剂作流动相进行洗脱，然后由中心出液口流出。本发明利用径向色谱柱具有样品在起始处与填料接触面积大和在出液口会聚的特点，对天然可溶性多糖进行分离或纯化。
文档编号C08B37/00GK101385909SQ20081015131
公开日2009年3月18日 申请日期2008年9月12日 优先权日2008年9月12日
发明者瑾 姚, 岳思君, 戴玉杰, 王静文, 鹏 许, 谭之磊, 贾士儒, 贾梦瑶, 伟 郭 申请人:天津科技大学