一种将蛋白质递送到细胞中的方法

专利名称：一种将蛋白质递送到细胞中的方法
技术领域：
本发明主要涉及将蛋白质递送到细胞中的方法。
背景技术：
对各种病症、疾病和状态的治疗途径可以设想将生物活性蛋白质递送到 细胞中，从而使该蛋白质能够在细胞环境内执行其生物学功能。
现存的将生物活性蛋白质递送到细胞中的方法包括例如显微注射[6, 7] 和电穿孔[8， 9]的物理方法，该方法可证实难以应用在活体内。
分子技术包括使蛋白转导域(PTD)与活性蛋白质结合从而介导蛋白质的 细胞吸收。三个最活跃地研究的PTD源自Z>cwopM/" a""fe""a/^Wa肽、 HSV-VP22蛋白和HIV-TAT蛋白转导基序。通过这些PTD穿过细胞膜的转导 的发生机制目前尚未充分了解，但是研究已显示，肽和蛋白质的递送与PTD 中正电荷赖氨酸和精氨酸残基的含量和分布密切相关[IO, ll]。
正在日益兴起的合理的给药研究中的另一途径涉及阳离子型脂质和聚 合物。例如，聚乙烯亚胺(PEI)结合蛋白质通过离子电荷相互作用能够进入细 胞[12]。蛋白质与PEI的结合必需在温和条件下进行从而使蛋白质免于变性。 而且，PEI的细胞毒性也限制其在活体内的应用，特别是具有高分子量的PEI。
因此，需要将蛋白质(包括生物活性蛋白质或抗体)递送到细胞中的另一 途径。

发明内容
一方面，本发明提供了一种胶束-蛋白质复合物，其包含
5阳离子型聚合物的胶束，所述阳离子型聚合物具有通式I 一(W—X—Y—Z)p—(W'—X'—Y'—Z')q—的结构；和蛋白质，所述蛋白质具 有用来与所述胶束复合的区域。所述蛋白质通过蛋白质与阳离子型聚合物之 间的相互作用复合到所述胶束的外部。
在通式I中，W、 X、 Y和Z各自独立地选自
<formula>formula see original document page 6</formula>
;和不存在，其中W、 X、
Y和Z中只有一个为不存在，且W、 X、 Y和Z中至少一个为包含与R或R'
结合的氮的基团。
而且，在通式I中，W'、 X'、 Y'和Z'各自独立地选自
<formula>formula see original document page 6</formula>
;和不存在，其中W'、 X'、
Y'和Z'中只有一个为不存在，且W'、 X'、 Y'和Z'中至少一个为包含与R〃或 R〃'结合的氮的基团。
此外，在通式I中，R和R'各自独立地为H、烷基或杂烷基(heteroalkyl)-， R〃和R'〃各自独立地为疏水基；p和q各自独立地为大于零的整数；以及m、 n、 r、 s、 t、 m'、 n'、 r'、 s'和t'各自独立地为大于0的整数。在本发明提供的胶束-蛋白质复合物中，所述阳离子型聚合物可包括聚 {TV-甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(胆甾醇基氧羰基酰氨基乙基)甲基二(亚乙基)
溴化铵]癸二酸酉旨}(poly{iV-methyldietheneamine sebacate)-co-[(cholesteryl oxocarbonylamido ethyl) methyl bis(ethylene) ammonium bromide] sebacate})。
所述蛋白质可为寡肽、肽、多肽、全长蛋白质、蛋白质片段、蛋白质结构域 (protein domain)或融合蛋白，并且可为生物活性的。
在各种实施方式中，所述蛋白质可包括激素、受体配体、转录因子、转 录增强子、转录抑制因子、酶、激酶、磷酸酯酶、核酸酶、蛋白酶、生长因 子、抗体或细胞毒性蛋白质。在特别的实施方式中，所述生长因子可包括神 经胶质衍生的亲神经因子，所述细胞毒性蛋白质可包括凝集素A，以及所述 抗体可包括赫赛汀(herceptin)。
本发明提供的胶束-蛋白质复合物可进一步包含附加的治疗剂，其包括包 含在所述胶束内部的药剂或者复合到所述胶束外部的药剂或核酸分子。
另一方面，本发明提供了一种将蛋白质递送到细胞中的方法。该方法包 括使如本申请所述的胶束-蛋白质复合物与细胞接触以使胶束-蛋白质复合物 被吸收到细胞中。
所述细胞可为体外细胞，或者可为体内细胞，所以该方法包括向被试者 (包括例如人)施用所述胶束-蛋白质复合物。
在一些实施方式中，所述蛋白质为生物活性蛋白质并且在递送到细胞中 后保持生物活性。
再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本申请所述的胶束 -蛋白质复合物。所述药物组合物可进一步包含可药用的载体。
又一方面，本发明提供了如本申请所述的胶束-蛋白质复合物用于将蛋白 质递送到被试者的细胞中的用途。所述被试者可为人。在各种实施方式中，所述蛋白质为生物活性蛋白并且在递送到细胞中后 保持生物活性。
结合附图，在回顾本发明的具体实施方式
的下列描述后，对于本领域普 通技术人员来说，本发明的其它方面和特点将变得明显。


在图中，只通过实施例说明本发明的实施方式
图l:P(MDS-共-CES)胶束/凝集素A复合物的粒度和；电势。各条件重复 三次测试。用误差棒显示标准差。
图2:在用包含固定浓度的凝集素A和变化浓度的P(MDS-共-CES)的胶束 /凝集素A复合物孵育后MDA-MB-231 (a)、 HepG2 (b)、 HeLa (c)和4T1 (d)细 胞的生活力。各条件重复八次测试。用误差棒显示标准差。
图3:在用包含变化浓度的凝集素A和固定浓度的P(MDS-共-CES)的胶束 /凝集素A复合物孵育后MDA-MB-231 (a)、 HepG2 (b)、 HeLa (c)和4T1 (d)细 胞的生活力。各条件重复八次测试。用误差棒显示标准差。
图4:将P(MDS-共-CES)胶束介导的凝集素A和BioPorter介导的凝集素 A递送到MDA-MB-231 (a)、 HepG2 (b)、 HeLa(c)和4T1 (d)细胞中的比较研 究。在含血清培养基中分别以(a) 20 ppm、(b) 50 ppm、(c) 40 ppm禾口(d) 100 ppm 的固定浓度使用P(MDS-共-CES)。各条件重复八次测试。用误差棒显示标准 差。
具体实施例方式
本方法和组合物涉及生物可降解的阳离子胶束与蛋白质之间的复合物 的形成，以及这种复合物用于将蛋白质递送到细胞内部的用途。
以前，在美国专利申请第10/849,498号(公开为US 2005/0260276)中描述 了新的阳离子核-壳胶束。该申请涉及生物可降解的阳离子核-壳胶束用于递 送药物(包括在胶束内部封装的药物)以及递送核酸分子(包括与胶束外部结合
8的核酸分子)的用途。形成胶束的聚合物由具有连接到主链中季氨基
(quaternary amino group)处的主链上的疏水侧基的亲水主链组成。该带电季氨 基赋予聚合物聚阳离子性质、沿着主链分布的非中和正电荷。该聚合物还包 含沿着主链的叔氨基(tertiary amino group),其可被质子化和去质子化，从而 使该聚合物在生理环境中具有缓冲效应[14]。
如在US 2005/0260276中所述，通过在胶束装配过程中用聚合物包合药 物而将药物容易地封装在胶束内部。尽管一些疏水基可位于胶束外部，但是 许多药物包含疏水部分，例如疏水环结构，从而使药物与趋向与胶束结构的 内部分离的聚合物上的疏水侧基之间结合。
同样，如在US 2005/0260276中所述，如DNA的核酸可以容易地与胶 束外部结合。核酸是具有沿着分子主链有规则地分布的负电荷的柔性分子， 并因此能够与胶束表面的轮廓相符并且与位于胶束外表面的阳离子电荷静电
^口 口 o
相反，蛋白质可以折叠成复杂结构，包括球状结构，特别是在活性通常 取决于蛋白质的构象折叠的生物活性蛋白质的情况下。蛋白质即使在具有负 电荷区域时亦不会与聚阴离子核酸具有相同的电荷分布，并且往往是不能以 与核酸相同的方式与胶束的表面一致。同样，蛋白质往往对环境(包括微环境) 十分敏感，并且在不适宜的条件下可变性，导致生物活性丧失。尽管蛋白质 伴随这些明显的困难，本发明人现已证实了先前所述的胶束能够令人惊讶地 用于将蛋白质(包括折叠的生物活性蛋白质)递送到细胞中。
在保留蛋白质可具有的生物活性的同时，所述核-壳胶束可用于将该蛋白 质递送到细胞内部。细胞毒素凝集素A用作示范性的具有生物活性的蛋白质， 并且如下列实施例1所述，与BioPorter(包括阳离子脂质的商业可利用的蛋白 质载体)相比，凝集素A被更加有效地递送到细胞中。同样，在通过胶束递 送时凝集素A针对各种癌细胞系的细胞毒性比在通过BioPorter递送时的高得多。因此，本方法可导致蛋白质被非常有效地递送到细胞中的同时保持蛋 白质可具有的任何生物活性。所述胶束-蛋白质复合物具有多种应用，包括体 外应用、研究和人的医学应用。
尽管将凝集素A用作示范性蛋白质，但是本发明所述的方法和复合物意 欲延伸到通常蛋白质，包括抗体，例如赫赛汀；可以理解的是，本发明的方 法和复合物不依赖于在该方法或复合物中所用的蛋白质的任何特定氨基酸序 列或者生物活性。
因此，提供了一种将蛋白质递送到细胞内部的方法。由生物可降解的、
阳离子型两亲性聚合物(amphilic polymer)形成的胶束用作递送载体并且用来 与要被递送的蛋白质形成复合物。然后，使该复合物与将要向其中递送蛋白 的细胞接触。该复合物适当地带正电荷并且具有使复合物被胞吞的适当尺寸 并因此被细胞吸收，从而将蛋白质递送到细胞中。
首先，提供了与蛋白质复合的胶束。如US 2005/0260276中所述，示范 性的胶束包含阳离子型聚合物。如上所述，该聚合物具有包含氨基的亲水主 链。在形成聚合物主链的骨架的亲水分子中的氨基为叔氨基。所述叔氨基可 根据pH被质子化或者去质子化，根据溶液条件影响净正电荷。然而，经由 至少一部分叔氨基将疏水侧基连接到亲水主链上，其通过将这些氨基永久地 转变成带正电荷的基团(即季氨基)，从而导致聚合物为阳离子型的(不管pH)。
所述阳离子型聚合物具有通式I的结构
—(W—X—Y—Z)p—(W'—X'—Y'—Z')q
W、 X、 Y和Z各自独立地选自
<formula>formula see original document page 10</formula><formula>formula see original document page 11</formula>;禾口不存在,
W、 X、 Y和Z中只有一个为不存在，且W、 X、 Y和Z中至少一个为 包含与R或R'结合的氮的基团。
W'、 X'、 Y'和Z'各自独立地选自
<formula>formula see original document page 11</formula>J ;和不存在。
W'、 X'、 Y'和Z'中只有一个为不存在，且W'、 X'、 Y'和Z'中至少一个为 包含与R〃或R'〃结合的氮的基团。
R和R'各自独立地为H、垸基或杂烷基。
此处所用的烷基指的是含有1 20个碳原子、1 12个碳原子或1 8个 碳原子的直链或支链饱和烃一价基团并且任选用例如烷氧基((任选低级)烷基 的垸氧基)、卤素、三氟甲基、氰基、羧基、氨基甲酸酯、磺酰基或氨磺酰取 代。
此处所用的杂烷基的主烃链的部分如上述烷基所定义，但是包含一个或 多个杂原子(例如N、 O、 S等)。
R〃和R'〃各自独立地为疏水基。此处所用的疏水基为通过从疏水分子中除去氢而形成的一价基团，所述 疏水分子例如为胆甾醇、聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚己酸内酯、聚碳酸 酯或多酚。
p和q各自独立地为正整数，例如1 2000、 1 1000或1 500的整数。 将要理解的是，各一(W—X—Y—Z)—和各一(W'—X'—Y'—Z')—单体可以沿 着聚合物主链随机排列，并且上述式I并没有必须地暗示单体在嵌段中排列。
m、 n、 r、 s、 t、 m'、 n'、 r'、 s'和t'各自独立地为大于0的整数，例如l 20的整数、1 12的整数或1 8的整数。
在具体的实施方式中，所述聚合物可以具有通式n的结构:
<formula>formula see original document page 12</formula>
对于式II，p、 q、 n、 s、 t、 n'、 s'、 t'、 R和R〃各自如上述式I中所限定。
在具体的实施方式中，所述聚合物可以具有通式m的结构
<formula>formula see original document page 12</formula>
对于式III，p、 q、 n、 s、 t、 n'、 s'、 t'、 R和R〃各自如上述式I中所限定。 在具体的实施方式中，所述聚合物可以具有通式IV的结构<formula>formula see original document page 12</formula>
对于式IV， p、 q、 m、 n、 r、 t、 m'、 nr、 r'、 t'、 R、 R'、 R〃和R'〃各自如上述式I中所限定。
在具体的实施方式中，如在US 2005/0260276中所述，所述聚合物包含 聚甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(胆甾醇基氧羰基酰氨基乙基)甲基二(亚乙 基)溴化铵]癸二酸酯} (P(MDS-共-CES))。在具体的实施方式中，所述聚合物 为P(MDS-共-CES)。
由于沿着主链包含酯基和氨酯基，如上所述的聚合物是生物可降解的。 同样，由于沿着主链设置的酯基、醚基和氨基以及沿着主链在氨基处的主链 上接枝的疏水基，所述聚合物是两亲的。聚合物的两亲性使聚合物形成胶束， 当在水溶液或亲水性溶液中形成时，疏水基趋向于定位朝向胶束的内部，而 亲水的阳离子主链趋向于定位朝向胶束的外部。
从式I-IV中可以看出，用接枝的疏水基取代主链的程度因带正电荷的第 四位取代的氨基的形成而影响聚合物的总的静电荷和正电荷分布。因此，为 了使胶束与蛋白质形成复合物从而将蛋白质递送到细胞中，用接枝的疏水基 取代主链至足够的程度，以使聚合物形成胶束并且向聚合物提供适当的阳离 子电荷。例如，取代程度可为约1% 约100%、约10% 约90%、约20% 约50%、约25% 约40%。或者取代程度可为小于约100%、小于约90%、 小于约80%、小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%、大于约 25%、大于约30%、大于约40%、大于约50%、大于约80%、大于约90%。 用(主链上包括疏水基取代基的季氨基的数目)除以(适合用疏水基取代的可能 的氨基的数目)乘以100%测量得出取代程度的百分比。
所述聚合物链长具有足够的重均分子量以使聚合物形成胶束，包括通过 自装配。在各种实施方式中，所述聚合物的重均分子量为约1 kDa 约50 kDa、约1 kDa 约30 kDa、约5 kDa 约30 kDa、约5 kDa 约20 kDa、约5 kDa 约15 kDa、约8 kDa 约12 kDa或约3 kDa 约8 kDa。
所述聚合物可以通过本领域已知的标准化学技术制备，包括在US 2005/0260276描述的那些和在下列实施例中描述的那些。例如，适合的縮合 反应可用于使适合的单体反应来得到所需的亲水主链。然后，可使该主链与 适合的疏水分子反应从而进行聚合物主链上的叔氨基的氮原子与疏水分子中 的弱电子中心(electron-poor centre)间的反应。
具体地，在US 2005/0260276中、在Wang等人淑Ma紋2006， 5, 791 中和在下述实施例1中描述了 P(MDS-共-CES)的合成机制。
因此，可以将所述阳离子型聚合物装配成胶束。使用本领域已知的标准 方法和如US 2005/0260276中所述的方法可以形成胶束。例如，胶束通常可 以通过溶解技术、透析技术或者通过本领域已知的单乳胶技术形成。
所述阳离子型聚合物可以被设计为自装配成胶束，包括通过使用其中将 阳离子型聚合物溶于适合的溶剂(如极性非质子溶剂(例如二甲基甲酰胺))中 而后对水和缓冲水溶液进行透析的透析技术，包括如US 2005/0260276中和 在下列实施例中所述。
胶束大小是这样大小的胶束胶束在与蛋白质形成复合物时可具有使蛋 白质要被递送到其中的细胞对胶束-蛋白质复合物进行胞吞作用的足够尺寸。 例如，胶束的截面尺寸可为小于约1 (im、约250nm以下、约180nm以下、 约10 nm 约250 nm、约50 nm 约200 nm、约100 nm 约200 nm、约100 nm 约180 nm、约130 nm 约160 nm、约150 nm。
在本发明所述的方法中，胶束与蛋白质复合。本文所用术语"胶束-蛋白 质复合物"或者本文所用术语蛋白质与胶束"复合"或者形成"复合物"指
14的是胶束与蛋白质间的相互作用，其足够稳定以使蛋白质与胶束结合从而将
其递送到细胞中。本文所用术语向细胞中"递送"或者"递送到"细胞中指6A且/f击压ifq r^JU细胎frfi力k运l^龙入51l细胎的riti都J由甘巨R曰力:细胞溶质中成沐
细胞的细胞器内。
本文所用蛋白质指的是两个或更多个氨基酸通过肽(酰胺)键连接在一起形成的链，并且包括多肽、抗体、全长蛋白质、蛋白质片段、蛋白质结构域或融合蛋白。多肽可为寡肽或肽。
由于蛋白质在特定生物背景下具有生物学功能，例如，酶活性、与如另一蛋白质或蛋白质结构域或核酸序列的靶分子结合、激素活性、细胞信号活性、转录激活或抑制活性、细胞生长或细胞周期调节、抗癌活性或细胞毒素活性，所以蛋白质可为生物活性蛋白质。
蛋白质将具有用来与胶束形成复合物的区域或部分。例如，通过蛋白质上可利用的各种官能团与胶束外部上可利用的互补官能团之间的疏水、静电或氢键结合相互作用，蛋白质可与胶束形成复合物。
因此，为了使胶束与要被递送到细胞中的蛋白质复合，该蛋白质可具有带负电荷的或阴离子的区域，例如蛋白质的部分或者附着于蛋白质上的标签部分。蛋白质上的负电荷使蛋白质与阳离子胶束通过静电相互作用形成复合物。例如，如果蛋白质是短的寡肽，则该寡肽沿着其长度可包含一个或多个带负电荷的氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸。如果蛋白质为折叠链(包括全长蛋白质、抗体、蛋白质结构域或融合蛋白)，则蛋白质可包含由于带负电荷的氨基酸位于蛋白质表面的空间排布而带负电荷的蛋白质的表面上的区域。例
如在生物活性蛋白质或蛋白质结构域的c端，蛋白质可以设计成具有一段长
度的包含带负电荷的氨基酸的氨基酸的融合蛋白。或者，可以用带负电荷的基团或附着于蛋白质上的标签修饰蛋白质。将理解的是，任何修饰(包括通过
融合额外的氨基酸或者通过附着带负电荷的标签)的进行都应当不干扰蛋白
活6A生铷^Tli台！^m j ^!^nyj 丁 "J hid o
或者，为了使胶束与要被递送到细胞中的蛋白质复合，蛋白质可具有疏水区域，例如蛋白质或附着于蛋白质上的标签的部分。蛋白质的疏水区域使蛋白质与阳离子胶束通过与暴露在胶束外部上的任意疏水侧基的疏水相互作用而形成复合物。例如，如果蛋白质为短的寡肽，则该寡肽沿着其长度可包含一个或多个疏水氨基酸，例如苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸。如果蛋白质为折叠链(包括全长蛋白质、抗体、蛋白质结构域或融合蛋白)，则蛋白质可包含由于疏水氨基酸位于蛋白质表面的空间排布而疏水的蛋
白质的表面上的区域。例如在生物活性蛋白质或蛋白质结构域的c端，蛋白
质可以设计成具有一段长度的包含疏水氨基酸的氨基酸的融合蛋白。或者，可以用疏水基或附着于蛋白质上的标签修饰蛋白质。将理解的是，任何修饰(包括通过融合额外的氨基酸或者通过附着疏水标签)的进行都应当不干扰蛋白质的生物学功能。
或者，为了使胶束与要被递送到细胞中的蛋白质复合，该蛋白质可具有极性或带电的区域，例如蛋白质的部分或者附着于蛋白质上的标签部分。蛋白质上的极性或带电基团使蛋白质与阳离子胶束通过氢键结合相互作用形成复合物。例如，如果蛋白质是短的寡肽，则该寡肽沿着其长度可包含一个或多个极性或带电氨基酸，该氨基酸含有能够充当氢键供体或受体基团的官能团，例如，酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。如果蛋白质为折叠链(包括全长蛋白质、抗体、蛋白质结构域或融合蛋白)，则蛋白质可包含由于极性或带电氨基酸位于蛋白质表面的空间排布而成为极性或带
电的蛋白质的表面上的区域。例如在生物活性蛋白质或蛋白质结构域的c端，蛋白质可以设计成具有一段长度的包含极性或带电氨基酸的氨基酸的融合蛋白。或者，可以用含有能够充当氢键供体或受体基团的官能团的极性或带电
的其「7Fli^附差平岳f^活卜的K效^袖岳白活—牧拥舰的县皿^^CT修他^n飪il
过融合额外的氨基酸或者通过附着极性或带电的标签)的进行都应当不干扰蛋白质的生物学功能。
具体的可与胶束复合以递送到细胞中的蛋白质可以包含或者为激素、受体配体、转录因子、转录增强子、转录抑制因子、酶、激酶、磷酸酯酶、核酸酶、蛋白酶、生长因子(例如神经胶质衍生的亲神经因子)、细胞毒性蛋白
质(例如凝集素A)或抗体(例如赫赛汀)。
如需要，胶束可以用于与蛋白质一起向细胞中递送附加的治疗剂。例如，如US 2005/0260276中所述，药剂(例如药物)可以在胶束形成的过程中被包含在胶束的内部。或者，如果药剂具有足够的负电荷、极性氢键供体或受体基团或者疏水域，则该药剂可以以与蛋白质相同的方式与胶束的外部复合。核酸和蛋白质都可以与胶束的外部复合，这样可以确保细胞内的特异定向和/或协同治疗效果。
因此，将胶束与要被递送到细胞中的蛋白质，以及任选附加的治疗剂复合，包括小分子药物或者核酸。通过将胶束加入到包含蛋白质和可选的附加治疗剂的溶液中(如果要与胶束的外部复合)可以使胶束被复合。
使用常规实验室方法，可以使蛋白质与胶束的质量比最优化从而确保复合物的适当形成并且提供具有所需大小和；电势的复合物。在具体的实施方式中，胶束:蛋白质的质量比为约0.2以上，或约1以上，或约2.5以上，或约5以上，或约10以上，或约20以上，或约30以上，或约40以上，或约50以上能够确保有效且稳定的复合物形成。可以使用；电势(表面电荷量度)作为精确测量复合物形成的参数。例如，正；电势(例如约5mV以上、约5 mV 约20 mV或者约20 mV 约100 mV)可用于表示蛋白质与胶束之间形
R^S当的有A物—
一旦与蛋白质复合的胶束被提供(包括任何可选的附加治疗剂)，则该复 合物可被递送到细胞中从而使蛋白质被吸收到细胞中。
向细胞中的递送包括使胶束-蛋白质复合物与细胞的表面接触。在没有限 定到任何具体理论的情况下，细胞可以胞吞胶束-蛋白质，导致胶束-蛋白质 复合物被吸收到细胞中。 一旦进入细胞内部，该复合物可以解离，将蛋白质 释放到细胞腔隙中，例如内涵体。在内涵体中，聚合物中至少一些叔氨基可 质子化，造成内涵体膜的分解并且使复合物从内涵体中逸出，从而将蛋白质 释放到细胞溶质中。
蛋白质要被递送到其中的细胞可为任何细胞，包括体外细胞、培养细胞 或被试者内的体内细胞。除非另外指定，本文所用术语"细胞"指并且包括 环境允许的单细胞、多细胞或细胞群体。细胞可为体外细胞(包括从被试者体 内移植的细胞)，或者细胞可为被试者体内的体内细胞。同样地，除非另外指 定，术语"细胞"也包括环境允许的单细胞。
细胞可以来自于任何生物体，例如昆虫、微生物(包括细菌)或者动物(包 括哺乳动物(包括人))。
如上所述，在递送到细胞中时，蛋白质可以保持其生物学功能(如有)。 使用已知的方法和技术(包括蛋白质检测方法、免疫测定和荧光标记技术)， 技术人员可以容易地确定是否蛋白质已被递送到细胞中。如果对细胞内特定 的生物学功能存在直接或间接测定法，则技术人员也可以容易地确定蛋白质
18是否保持其生物学功能。例如，如果将要检测激酶活性，则可以比较递送蛋 白质之前和之后的靶蛋白的磷酸化水平，其包括使用放射标记的磷酸盐。
此外，本发明提供了如上所述的胶束-蛋白质复合物，包括包含附加的治 疗剂的胶束-蛋白质复合物。
另外，本发明提供了上述胶束-蛋白质复合物用于将蛋白质递送到细胞中 的用途，或者上述胶束-蛋白质复合物用于制造将蛋白质递送到细胞中的药剂 的用途，其包括在细胞为被试者体内的体内细胞的情况下。
为了帮助向被试者施用这种胶束-蛋白质复合物，可以将该复合物配制成 药物组合物中的成分。
因此，本发明提供了包含如上所述的胶束-蛋白质复合物的药物组合物。 所述药物组合物可以进一步包含可药用的稀释剂或载体。所述药物组合物可 以常规地包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂和各种相容的载体。对于递 送的全部形式，可以将所述胶束-蛋白质复合物配制在生理盐溶液中。
通过所选的施用途径、与生物活性蛋白质的相容性(如果合适)和标准制 药实践确定可药用的稀释剂或载体的比例和特性。
通过用于制备适合向被试者施用的可药用的组合物的己知方法可以制 备所述药物组合物，所以使有效量的胶束-蛋白质复合物和任何附加的活性物 质(一种)或物质(多种)以混合物的形式与可药用的载体组合。向被试者施用有 效量的胶束-蛋白质复合物。本文所用术语"有效量"指在实现预期效果(例 如将蛋白质递送到被试者体内的靶细胞或细胞群体中)所需的剂量和时间段 内有效的量。
例如，在雷明顿氏药物禾4学(Remington's Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Company, Easton, Pa., USA 1985)中描述了适合的载体。在此基础
上，该组合物包括，但不限于，与一种或多种可药用的载体或稀释剂联合且 /fe7今女目右;苦4的nW估日t^生神、戚^:笙、涂的么慈油、狡、谅由的H^市.岳^1 !^有A
物溶液。
在储藏和使用的普通条件下，这些药物组合物可包含防止微生物生长且 会保持蛋白质的任何生物活性的防腐剂。本领域技术人员会知道如何制备适 合的制剂。例如，在雷明顿氏药物科学中和在美国药典(1999年出版的国家 处方集(USP24NF19))中描述了选择和制备适合制剂的常规程序和成分。或 者，在无需防腐剂的情况下，可以在充分接近于使用的时间时，通过混合胶 束与蛋白质溶液配制复合物。
在向患者施用时，以为实现所需效果的有效的量和剂量以及足够的时间 段内施用胶束-蛋白质复合物。例如，可以以递送可以起到缓解、改善、减轻、 改进、稳定、防止蔓延、延迟或慢化进程或者治愈感染、疾病或病症作用的 蛋白质所需的数量和剂量施用所述胶束-蛋白质复合物，或者例如抑制、减少 或损害与疾病有关的酶的活性。与疾病有关的酶是一种与代谢或生化途径有 关的酶，该酶在所述途径被中断时，或者在酶或途径的调控被中断或抑制时， 酶的活性与疾病或病症的发作和进程有关。
向被试者施用的胶束-蛋白质复合物的有效量可以根据例如胶束-蛋白质 复合物的药效性质、施用方式、被试者的年龄、身体状况和体重、病症和疾 病状态的性质和程度、治疗的频率、治疗的并发性类型(如有)以及胶束-蛋白 质复合物的浓度和形式的各种因素发生变化。
基于以上因素，本领域技术人员可以确定适合的量。根据被试者的临床 反应，最初可以以可按照需要调节的适合的量配合施用。胶束-蛋白质复合物的有效量可以根据经验确定并且取决于可以安全地施用的胶束-蛋白质复合 物的最大量。然而，施用的胶束-蛋白质复合物的量应为产生所需效果的最小
如本领域技术人员所理解的，根据所选的施用途径，可以以各种形式向 被试者施用所述药物组合物。优选非经口途径，特别是如果生物活性剂以相 同的方式与胶束-蛋白质复合物同时施用。本发明的组合物可以采用手术或者 通过注射向所需部位施用。在不同的实施方式中，可通过注射(非肠道注射、 皮下注射、静脉注射、肌肉注射、直接注射到靶组织或者器官等)直接在所 需部位施用该组合物。
通过下列非限定性的实施例进一步例示本方法和用途。
实施例
实施例l
在该实施例中，使用凝集素A作为示范性的要被递送到细胞中的阴离子 生物活性蛋白质。几十年来，研究一直集中在来自槲寄生提取物的凝集素作 为人类癌症的治疗活性物质。许多研究已经描述了在几个体外体系中有效力 的和细胞毒性的韩国槲寄生诱导细胞凋亡的能力。从韩国槲寄生(n^Mm a/6tm7 Co/ora&m)的提取物中分离的细胞毒素凝集素是在肿瘤细胞中诱 导细胞凋亡的糖蛋白[l]。报道显示了韩国槲寄生凝集素-II (ML-II)是对Molt4 细胞的细胞毒素[2,3]，并且能够通过半胱天冬蛋白酶级联的激活致使U937 细胞发生细胞凋亡而死亡[4]。
关于这种K 的抗癌活性应归于凝集素A,凝集素A属于2型核糖
体失活蛋白(RIPII)，由两个二硫化物连接的蛋白质亚单位组成[1,3]。具有rRNA N-糖苷酶活性的催化活性A-链通过引起28S rRNA中第4324位的腺嘌 呤的脱嘌呤而使核糖体失活[5]。这导致蛋白质生物合成期间细胞翻译的易位 步骤的破坏，并由此，发生细胞死亡。
凝集素A的对应物，B-链，不是直接具有细胞毒素性质，而是用于通过 与细胞表面上的具有适合的糖基的糖蛋白结合而介导细胞毒素A-链的输送 和定向。由于凝集素A仅仅能够在其已被引入到细胞中后发挥其细胞毒性作 用，所以凝集素B同样对促进连续的通过胞吞的内化起到重要作用[3]。
通过重组方法从植物提取物或其产品中分离ML II具有如繁重的纯化工 作和扩大的问题的困难。因此，本实施例提供了用于细胞内递送凝集素A的 另一稳定和足以胜任的载体。
材料和方法
材料重组凝集素A (Mw: 30.7 kDa)出品于新加坡南洋工科大学 (Nanyang Technological University, Singapore)的Ho Sup Yoon，s实验室。根据 先前报道的规程合成P(MDS-共-CES) [13]。 二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲 酰胺(DMF)购自美国Sigma-Alrich。用于胶束制备的透析缓冲液使用来自美 国默克(Merck,USA)的ACS等级的乙酸钠和乙酸自行制备。除非另外规定， 全部试剂和溶剂均为商品级，并且被公认使用。MDA-MB-231、 HeLa、 HepG2 和4T1细胞系从美国ATCC获得并且按照ATCC的建议培养。HepG2和HeLa 生长在DMEM中，MDA-MB-231在Leibovitz L-15中以及4T1生长在RPMI 1640中。全部培养基补充有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100叱/ml链 霉素(HyClone,USA)。 BioPorterTM购自美国Genlantis，并且按照制造商的指 导使用。3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四氮唑 (3-[4，5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(MTT)购自美国
22Sigma，其以浓度为5 mg/ml在磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)中使用，并且用0.22 iam过滤器过滤该溶液以除去蓝甲階结晶(blue formazan crystal)。
P(MDS-共-CES)胶束的制备与特性通过三步合成制得P(MDS-共-CES) [13]。首先，通过iV-甲基二乙醇胺和癸二酰氯(sebacoylchloride)之间的縮聚 制备主链，聚(iV-甲基二乙烯胺癸二酸酯)(PMDS)。使用过量三乙胺除去氢氯 化物并且限制叔胺的质子化作用。接着，在酰胺化反应中使胆甾醇氯甲酸酯 与2-溴乙胺氢溴酸盐反应。然后，通过季铵化反应将生成的疏水7V-(2-溴乙基) 氨基甲酰基胆甾醇(AK2-bromoethyl) carbarmoyl cholesterol)接枝到亲水聚(, 甲基二乙烯胺癸二酸酯)主链上以得到最终产物。主链为聚酯，而侧链包含潜 在可水解的不稳定氨酯基，致使该共聚物可降解。胆甾醇的接枝程度为约 28.5%。如凝胶渗透色谱法所测量的，P(MDS-共-CES)的重均分子量(Mw)为 5.0kDa，多分散指数为1.7。为了制备阳离子胶束，将15.0mg的P(MDS-共-CES)溶于 5.0 ml的DMF中，将其置于分子量分离点为2000 Da的透析膜 中(Spectrum Laboratories, USA)。然后，在室温下将该透析袋浸渍于pH 4.6 的500ml的20mM乙酸钠/乙酸缓冲液中24小时。在24小时进程期间，头 8小时每小时一次用新鲜的缓冲液替换透析缓冲液。在透析过程的结尾，生 成的胶束溶液然后在无菌环境中通过0.22 过滤器过滤以除去大的附聚 物。使用具有动态光散射能力(散射角90。)且装备有658 nm的He-Ne激光 束的zetasizer粒度分析仪(zetasizer (Malvern Instruments Zetasizer Nano ZS, UK))定性得出胶束的大小和；电势。每个测量重复三次并且得出平均值。
胶束/凝集素A复合物的形成在实验过程中将用于该项研究的重组凝 集素A保持在冰浴中以防止温度变化引起其结构稳定性的破坏。首先向pH 6.0乙酸钠/乙酸缓冲液中加入凝集素A。然后通过将新鲜制备的胶束溶液以 变化的质量比加入到蛋白质溶液中形成胶束/凝集素A复合物，并且轻轻混合。将该复合物溶液在室温下静置30分钟，之后将其定性并引入到癌细胞中。
细胞毒性研究将HepG2、 HeLa、 MDA-MB-231和4T1癌细胞以每孔 1 x 104个细胞的密度接种到96孔板上，并且在100 ^的培养基中培养。然 后，将培养板返回培养箱中孵育24小时以在施用胶束/凝集素A复合物之前 使汇合度达到70%-80%。当达到所需的细胞汇合度时，从每个孔中除去消耗 的培养基并更换为100^1l的预先制备的复合物溶液。在用复合物孵育4小时 之后，用新鲜的培养基替换培养基。然后将培养板返回培养箱中并且在5% C02中在37。C保持2天。每种条件重复测试八次。在2天孵育结束时，用 100 pl的新鲜培养基加20 ^tl的MTT溶液替换培养基。然后将培养板返回培 养箱中并且在5% C02中在37°C另外保持3天。然后除去每个孔中的培养基
和过量MTT。然后将200 pl的DMSO加入到每个孔中以溶解纳入的紫甲階 结晶。从每个孔中取出100pl等分部分并转移到新的96孔板中。然后，使 用微孔板酶标仪(PowerWave X, Bio-tek Instruments, USA)在550 nm以及690
nm参考波长处测定培养板。甲H暨结晶的吸光度读数为在550 nm的吸光度 读数减去在690nm的吸光度读数。结果表示为空白的吸光度的百分比。
结果和讨论
胶束与胶束/凝集素A复合物的特性如图1所示，空白P(MDS-共-CES)
胶束的平均粒度为140 nm且；电势为约28 mV。在胶束与凝集素A的质量 比在5以下的较低情况下，聚合物的量不足以充分浓縮并结合凝集素A，并 且粒度对于胞内吸收可能太大(〉160nm)。在质量比在5以上的情况下，复合 物的大小较相似地保持在大约150 nm而C电势在25 30 mV之间，这表明在 这些质量比下，凝集素A被充分浓縮并与胶束复合。复合物的小的粒度和正 ;电势致使它们适合胞内细胞吸收。凝集素A、胶束和胶束/凝集素A复合物的细胞毒性评价凝集素A、 胶束和胶束/凝集素A复合物对MDA-MB-231、 HeLa、 HepG2和4T1细胞的
细胞毒性作用。空白胶束具有非选择性细胞毒性，其随着剂量的增加而增大。 因此，首先要使聚合物浓度最优化以将其细胞毒性作用减至最小，而同时， 提供足够的要有效递送的凝集素A的量。图2显示了聚合物浓度对处于固定 浓度的凝集素A的凝集素A的细胞毒性的作用。观察到，空白P(MDS-共-CES) 胶束在低浓度下对全部四种细胞系都不具有显著的细胞毒性。在高浓度下， 尤其对MDA-MB-231、 HepG2和HeLa细胞其的确产生了细胞毒性。此外， 单纯的凝集素A对细胞没有发挥显著的细胞毒性，这说明在没有输送载体的 情况下，凝集素A不能进入细胞并发挥其细胞毒素性质。明显相反，在使用 P(MDS-共-CES)胶束递送凝集素A时，癌细胞被成功地消除。在用适量的用 于递送凝集素A的聚合物处理后，剩下的活细胞的百分比对于全部四种细胞 系显著下降。
从图2还可以观察到，对于全部测试的细胞系，凝集素A的细胞毒性作 用在低聚合物浓度的情况下是不显著的，可能是因为凝集素A没有充分浓縮 且胶束/凝集素A复合物的大小对于有效的细胞吸收太大。另一方面，空白 P(MDS-共-CES)胶束尤其在高浓度下具有非选择性细胞毒性。因此，必需确 定最佳的聚合物浓度。对于MDA-MB-231，最佳的P(MDS-共-CES)浓度确定 为20ppm。对此的原因是由于在固定凝集素A浓度为lppm的情况下，聚 合物浓度增加超过20ppm，细胞生活力相对恒定地保持在22-34%。然而， 在聚合物浓度从20 lppm减少时，细胞生活力不断地增大。更重要的是， 在20ppm时，聚合物没有显示出明显的细胞毒性。通过将相同的原理应用 于其它三种细胞系，分析HeLa、 HepG2和4T1的最适宜聚合物浓度分别为 50、 40禾卩100ppm。在确定并固定最适宜聚合物浓度的情况下，而后进行研究来确定凝集素 A的ICso值。图3显示了在变化的凝集素A浓度下的细胞生活力，由此
MDA-MB-231、 HeLa、 HepG2和4T1细胞的凝集素A的1<:5()值分别确定为 0.2、 0.5、 10和50ppm。各种细胞系间的IC5。的不同揭示了它们对胶束/凝集 素A复合物的细胞毒性不同程度的敏感性。MDA-MB-231细胞显示了最小 的对复合物的细胞毒性作用的耐受性，其后为HeLa、 HepG2和4Tl细胞。
图4显示了在没有使用胶束的情况下，凝集素A没有显示出明显的细胞 毒性，特别是针对MDA-MB-231、 HepG2和4Tl细胞，甚至在80 100ppm
下，这进一步证实了凝集素A本身不能进入细胞。然而，阳离子胶束有效地 介导凝集素A的细胞吸收。比较使用胶束的凝集素A的细胞毒性与通过 BioPorter诱导的凝集素A的细胞毒性。如图4所示，在全部四种测试的细胞 系中，BioPorter介导的凝集素A的细胞毒性作用在含血清的细胞培养基中比 在不含血清培养基中的低，这是由于在血清的存在下其不稳定。然而，通过 胶束/凝集素A复合物诱导的凝集素A的细胞毒性即使在含血清培养基中仍 然明显高于BioPorter/凝集素A复合物在不含血清培养基中产生的。这可能 是因为细胞吸收越多，胶束/凝集素A复合物的稳定性和内体缓冲能力越强。
如向癌细胞递送生物活性凝集素A所示，这些实验证实了生物可降解的 阳离子P(MDS-共-CES)胶束可以成功地用于蛋白质的细胞内递送。胶束/凝集 素A复合物对于介导细胞吸收足够的小并且具有适合的正电荷分布。该胶束 同时具有良好的内体缓冲能力从而诱导凝集素A在被细胞吸收后的细胞内释 放。即使在含血清培养基中通过P(MDS-共-CES)胶束递送的凝集素A的细胞 毒性也明显高于通过BioPorterTM诱导的。因此，这些胶束看用作蛋白质(包 括生物活性蛋白和蛋白质)的细胞内递送的载体。
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都在本申请中引用作为参
26考，就如同每一篇出版物或专利申请被具体单独指出以被引用作为参考那样。
任何出版物的引用为在申请日前公开的内容并且不应将其解释为由于在前发
明的这些公开而承认本发明不被赋予更早的日期。
如在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式的"一"、"一种"
和"该"包括复数含义，除非文意另有明确表示。在本申请说明书和所附权
利要求书中，所用术语"包括"、"包含"、"含有"和这些术语的其它形
式意指非限定的包含含义，即是说，在没有排除其它任何元素或成分的情况
下，包括具体所述元素或成分。除非另外定义，本文所用全部技术和科学术 语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
虽然通过用于清楚理解的说明和实施例已经在一定程度上详细描述了 前述发明，对本领域普通技术人员来说，显而易见的是，鉴于本发明的教导， 在没有脱离所附权利要求的实质或范围的情况下，可以另外进行一些变化和 修改。 参考文献 T丄Yoon， Y. C. Yoo, T. B. Kang， K. Shimazaki, S. K. Song， K. H. Lee， S. H. Kim, C. H. Park, I. Azuma，丄B. Kim, C匿er ie化1999, "6， 33. H. S. Lee, Y. S. Kim, S. B. Kim, B. E. Choi, B. H. Woo, K. C. Lee， Ce//. A/o/. h/e 1999, 55, 679. W. Vervecken, S. Kleff， U. Pfliller, A. BUssing,■/别oc&w Ce〃 S/o/. 2000, 32, 317. M. S. Kim, H. S. So, K. M. Lee， J. S. Park, J. H. Lee, S. K. Moon, D. G. Ryu, S. Y. Chung, B. H. Jung,
Y. K. Kim, G. Moon， R. Park, Ge"era/Ptomwco/ogv 2000， 34, 349. Y. Endo， K. Tsurugi, H. Franz,尸￡55丄ett. 1988， 378. O. Zelphati, Y. Wang, S. Kitada， J. C. Reeds, P. L. Feigner, J. Corbeil, J. S/o/. C/^肌2001, 276, 35103. [7] O. T. Brustugun, K. E. Fladmark, S. O. D0skeland， S. Orrenius and B. Zhivotovsky, Ce〃 Z)e函D#er. 1998, 5, 660.[8] A. K. Banga, M. R. Praunitz， 7>e"cfc肌otec/j"o/" 1998， 76, 408. M. Fenton, N. Bone and A. J. Sinclair, /附ww"o/. Afe^o<iy. 1998, 2/2， 41 K. G. Ford, B. E. Souberbielle, D. Darling, F. Farzaneh, Ge"e Tfera;^ 2001, S, 1. J. S. Wadia, S. F. Dowdy, Cwr. Op,'". SZofec/wo/. 2002, ", 52. J. Futami, M. Kitazoe, T. Maeda， E. Nukui， M. Sakaquchi,丄Kosaka， M. Miyazaki, M. Kosaka， H. Tada,
M. Seno,丄Sasaki, N. H. Huh, M. Namba, H. Yamada, J.SZoewg. 2005, 99, 95 Y. Wang, S. Gao. W. H. Ye, H. S. Yoon, Y. Y. Yang, Ato. Mater. 2006, _5, 791. K. C. Wood, S. R. Little, R. Langer， P. T. Hammond, zi"gew. Cfe肌/W. ￡d 2005, ", 6704.
权利要求
1、一种胶束-蛋白质复合物，其包括阳离子型聚合物的胶束，该阳离子型聚合物具有通式I的结构-(W-X-Y-Z)p-(W′-X′-Y′-Z′)q-；和蛋白质，该蛋白质具有用来与所述胶束复合的区域；所述蛋白质通过蛋白质与所述聚合物之间的相互作用复合到所述胶束的外部；其中，在通式I中W、X、Y和Z各自独立地选自 id="icf0002" file="A2008800212160002C2.tif" wi="104" he="21" top= "131" left = "29" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>和不存在，其中W、X、Y和Z中只有一个为不存在，且W、X、Y和Z中至少一个为包含与R或R′结合的氮的基团；W′、X′、Y′和Z′各自独立地选自 id="icf0004" file="A2008800212160002C4.tif" wi="102" he="21" top= "216" left = "24" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>和不存在，其中W′、X′、Y′和Z′中只有一个为不存在，且W′、X′、Y′和Z′中至少一个为包含与R″或R″′结合的氮的基团；R和R′各自独立地为H、烷基或杂烷基；R″和R″′各自独立地为疏水基；p和q各自独立地为大于零的整数；以及m、n、r、s、t、m′、n′、r′、s′和t′各自独立地为大于0的整数。
2、 根据权利要求1所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述蛋白质的用 来与所述胶束复合的区域为负电荷区域、极性区域或疏水区域。
3、 根据权利要求1或2所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述阳离子 型聚合物包括聚(AA-甲基二乙烯胺癸二酸酯)-共-[(胆甾醇基氧羰基酰氨基乙 基)甲基二(亚乙基)溴化铵]癸二酸酯}。
4、 根据权利要求1 3中任一项所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述 蛋白质为寡肽、肽、多肽、全长蛋白质、蛋白质片段、蛋白质结构域或融合 蛋白。
5、 根据权利要求l 4中任一项所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述 蛋白质为生物活性蛋白质。
6、 根据权利要求5所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述蛋白质包括 激素、受体配体、转录因子、转录增强子、转录抑制因子、酶、激酶、磷酸 酯酶、核酸酶、蛋白酶、生长因子、抗体或细胞毒性蛋白质。
7、 根据权利要求6所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述生长因子包 括神经胶质衍生的亲神经因子，所述细胞毒性蛋白质包括凝集素A，以及所 述抗体包括赫赛汀。
8、 根据权利要求1 7中任一项所述的胶束-蛋白质复合物，其进一步包 含附加的治疗剂。
9、 根据权利要求8所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述附加的治疗 剂为包含在所述胶束内部的药剂。
10、 根据权利要求8所述的胶束-蛋白质复合物，其中，所述附加的治疗 剂为复合到所述胶束外部的药剂或核酸分子。
11、 一种将蛋白质递送到细胞中的方法，其包括使根据权利要求1 10中任一项所述的胶束-蛋白质复合物与细胞接触 以使所述胶束-蛋白质复合物被吸收到细胞中。
12、 根据权利要求ll所述的方法，其中，所述细胞为体外细胞。
13、 根据权利要求12所述的方法，其中，所述细胞为体内细胞，并且所述方法包括向被试者施用所述胶束-蛋白质复合物。
14、 根据权利要求13所述的方法，其中，所述被试者是人。
15、 根据权利要求11 14中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质为生 物活性蛋白质并且在递送到细胞中后保持生物活性。
16、 一种药物组合物，其包含根据权利要求1 10中任一项所述的胶束 -蛋白质复合物。
17、 根据权利要求16所述的药物组合物，其进一步包含可药用的载体。
18、 根据权利要求1 10中任一项所述的胶束-蛋白质复合物用于将蛋白 质递送到被试者的细胞中的用途。
19、 根据权利要求18所述的用途，其中，所述被试者是人。
20、 根据权利要求18或19所述的用途，其中，所述蛋白质为生物活性 蛋白质并且在递送到细胞中后保持生物活性。
全文摘要
本发明提供了一种由阳离子型聚合物形成的胶束与蛋白质的复合物以及使用该复合物将蛋白质递送到细胞中的方法。
文档编号C08L67/08GK101686940SQ200880021216
公开日2010年3月31日 申请日期2008年4月30日 优先权日2007年4月30日
发明者杨义燕, 勇 王, 阿什林灵智·李 申请人:新加坡科技研究局