纤维生物质的并行糖化和发酵的制作方法

专利名称：纤维生物质的并行糖化和发酵的制作方法
技术领域：
本发明涉及将纤维生物质分级为组成部分的系统和方法。更具体地说，本发明涉
及在一个容器中从木质纤维素材料同时产生和发酵碳水化合物
背景技术：
植物产生的天然的纤维生物质通常含有各种己糖碳水化合物，如葡萄糖、半乳糖 和甘露糖，它们容易被产乙醇酵母发酵为乙醇。葡萄糖是纤维素的唯一部分，但也是半纤维 素，特别是在软木中半纤维素的重要组分。半乳糖和甘露糖是存在于半纤维素中的其它的 主要己糖碳水化合物。当用于乙醇工业生产的酵母和包括葡萄糖、半乳糖和甘露糖的原料 一起存在时，它们首先发酵葡萄糖，并且当基质中的它们被消耗后，酵母细胞接着适应摄取 和发酵甘露糖，当甘露糖耗竭后，酵母细胞将又适于代谢半乳糖，半乳糖是来源于半纤维素 的三种主要碳水化合物中最难发酵的。这种类型的适应代谢行为被称为二阶段生长或代谢 (对于两种碳水化合物)和三阶段生长或代谢(对于三种碳水化合物)。在碳水化合物利用 的各阶段之间，通常会有几个小时的时间不发生代谢，在此期间在酵母的细胞膜中诱导所 需要的转运蛋白。这种诱导现象通常显著地延长完全消耗来自半纤维素的可发酵碳水化合 物的混合物的时间。在设计为用于从木质纤维素材料如被子植物纤维、裸子植物纤维和大 田作物纤维产生的混合的己糖碳水化合物原料流中生产乙醇的工业工艺中，在二阶段生长 和三阶段生长代谢过程中由酶调节引起的发酵延迟显著增加了与这些工艺有关的资金和 运转费用。因此，通常利用菌株筛选策略，基于在实验室规模系统中菌株将液体己糖流转化 为乙醇或其它代谢产物的效率，来鉴定和筛选有望适于工业发酵工艺的酵母菌株。将液体 己糖流发酵为乙醇的适宜示例性酵母菌株包括连续代谢葡萄糖_甘露糖_半乳糖的酿酒酵 母Tl和连续代谢半乳糖_葡萄糖_甘露糖的酿酒酵母Y-1528 (Keating等人，2004， J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:235-244)。 工业规模加工纤维性木质纤维素材料的初始阶段一般包括物理化学破裂纤维，然 后使用溶剂、稀释的酸或碱化学提取破裂的材料。溶剂提取过程通常实现木质素从纤维 的低聚糖和多糖部分中的分离，导致木质素和至少一些单糖、低聚糖和多糖释放进入到提 取溶剂中。回收溶剂后，废提取水溶液接着可以用作原料流产生乙醇。然而，提取废液通 常也含有大量的木质纤维素衍生的有机化合物，如酮类、醛类、羧酸类和其它的显著损害 或抑制微生物发酵代谢过程的此类化合物。这样的抑制剂的例子有糠醛、5-羟基甲基糠 醛、乙酸等。因此，鉴定商业上使用的发酵微生物的选择标准也包括评价它们在长时间暴 露于抑制剂的过程中的耐受性和代谢性能。Keating等人，2006， Biotechnol. Bioeng. 93 : 1196-1206已经表明，尽管当包含在液体己糖流的选择的抑制剂水平升高时，酿酒酵母菌株 Tl和Y-1528的发酵速率下降，但实验室规模间歇发酵的总乙醇产量不受影响。

发明内容
本发明的示例性实施方案包括设计成用于同时并存的下游糖化和发酵在上游提取纤维性木质纤维素原料过程中释放的结构组分的工业过程、系统和方法。适于本文提供、 描述和期望的本发明的工业规模并行的糖化和发酵过程、系统和方法的示例性纤维性木质 纤维素结构组分，包括纤维素、半纤维素、多糖和低聚糖。 根据本发明的一个示例性实施方案，提供了用于同时并存的糖化和发酵有机溶剂 提取纤维性木质纤维素原料过程中释放的结构组分的工艺。示例性的工艺一般包括步骤 用有机溶剂加工选择的木质纤维素原料产生混合的固体部分和液体部分，分离固体部分和 液体部分，混合分离的固体部分和选择的液体单糖和/或低聚糖或混合的单糖/低聚糖流 以降低分离的固体部分的粘度，随后将粘度降低的固体部分与有效量的包含用于发酵戊糖 和/己糖碳水化合物的合适微生物培养物的接种物混合，另外，向其中加入有效量的用于 糖化多糖和低聚糖的合适酶，然后提供合适的反应条件糖化固体部分和发酵单糖和/或低 聚糖合适的时间(如果微生物具有发酵低聚糖的能力)。 适宜的固体部分可以从以下示例性的纤维性木质纤维素原料产生被子植物生物 质、裸子植物生物质、大田作物生物质、植物浆和/或果实浆、木材和木材加工碎片和废料、 可回收再用的纸和硬纸板货物等。 用于降低从提取的木质纤维素原料分离的固体部分粘度的适宜液流的示例为从 提取的木质纤维素原料分离的去木质素液体部分。其它适宜的液流示例为包括水、短链醇、 酸、碱等的含碳水化合物的溶液。所述液流还可以添加有一种或多种选择的单糖碳水化合 物，诸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等。 发酵戊糖和/或己糖碳水化合物的适宜微生物接种物包括选自于酵母菌种、真菌 菌种、细菌菌种、原生动物(protozoae)或其它种类的一种或多种适宜菌株。适宜酵母的示 例为酵母属(Saccharomyces spp)和毕赤酵母属(Pichia spp)。适宜的酵母属的示例为酿 酒酵母，诸如菌株Y-1528， Tembec-l等。适宜的真菌菌种的示例为曲霉属和木霉属。适宜 细菌的示例为天然的和遗传改造的大肠杆菌、发酵单胞菌属、梭菌属和棒状杆菌属等。提供 包括以下菌的接种物也在本发明的范围内，该接种物包含单个菌株，或可选地，包括来自单 个类型微生物的多个菌株，或者还可选地，包括来自多个菌种和微生物类型的菌株(即，酵 母、真菌和细菌)的混合物。 适宜酶的示例为纤维素酶、半纤维素酶、13 -葡萄糖苷酶、|3 -木糖苷酶、a -淀粉 酶、P-淀粉酶和其它的聚糖酶。 本发明的一个方面是回收和循环从提取的纤维性木质纤维素原料的固体部分分 离的液体部分。在木质纤维素原料加工过程中提取进入溶剂的木质素与液体部分分离。脱 毒的或非脱毒的液体部分，或可选地，部分去木质素的液体部分是降低分离的固体部分粘 度的适宜稀释剂。在用于降低固体部分的粘度前用一种或多种单糖碳水化合物调理脱毒的
或非脱毒的液体部分是适宜的。适宜的单糖碳水化合物的示例为葡萄糖、甘露糖、半乳糖等。 根据一个方面，所述工艺是间歇工艺。
根据另一个方面，所述工艺是连续工艺。
根据再一个方面，所述工艺是半连续工艺。 根据本发明的另一个实施方案，提供了并行糖化和发酵从提取的纤维性木质纤维 素原料分离的固体部分的系统。所述系统一般包括(a)能够分离为固体部分和液体部分
6的提取的纤维性木质纤维素原料供应，(b)多个设计为分开接收和加工其中的分离自提取 的木质纤维素原料的固体和液体部分的适宜装置和操作系统，(c)富含选择用于降低固体 部分粘度的可发酵碳水化合物的适宜液流供应，(d)合适的微生物培养物供应，(e)适宜的 选择的酶，和(f)可控地将固体部分、液流、微生物培养物和酶混合成反应混合物的器件、 装置、设备和软件，其中所述反应混合物包括反应产物，例如木质素和乙醇。适宜的液流的 示例为这样的液体部分，其从提取的纤维性木质纤维素原料收集，接着脱毒或不脱毒，然后 在与用于降低其粘度的固体部分混合前完全或部分除去乙醇。从反应混合物分离的乙醇可 以用作燃料或可选地在进一步纯化后用作燃料组分或其它的非燃料相关的应用，如用于制 药、食品和饲料业。 根据一个方面，所述系统可以另外设计为接收和脱毒其中的富含从提取的木质纤 维素纤维性原料分离的可发酵碳水化合物的液体部分，所述木质纤维素纤维性原料包括悬 浮的颗粒纤维素、半纤维素、多糖和低聚糖。 根据另一个方面，所述系统可以被设计为连续接收和加工从提取的木质纤维素原 料分离的分批固体部分，同时排出反应产物。 根据另一个方面，所述系统可以被设计为连续接收和降低从提取的木质纤维素原 料分离的，和进一步加工各批固体部分，同时排出反应产物。
根据本发明的另一个方面，所述系统被设计为间歇系统。 根据再一个方面，所述系统被涉及为回收和恢复用过的有机或无机溶剂，以及循 环所述的恢复的无机或有机溶剂。 根据进一步的方面，所述系统被设计为回收和再生用过的有机或无机溶剂，循环 再生的有机或无机溶剂，以在并行糖化和发酵所述固体部分前，在其中用作降低从提取的 木质素原料分离的固体部分粘度的液流。 根据本发明的再一个示例性实施方案，提供了并行糖化和发酵从提取的纤维性木 质纤维素原料分离的固体部分的方法，其包括混合分离的固体部分、其中包括碳水化合物 的适宜无机或有机溶剂、有效量的选择用于发酵戊糖和/己糖碳水化合物的适宜的微生物 培养物和有效量的适宜酶。包括碳水化合物的适宜有机或无机溶剂的示例为，从提取的木 质纤维素原料分离并接着在与固体部分混合前脱毒或不脱毒的液体部分。用于发酵戊糖和 /己糖碳水化合物的适宜微生物培养物包括选自酵母菌、真菌和细菌种类的一种或多种适 宜菌株。适宜的酵母的实例为酵母属和毕赤酵母属。适宜的酵母属的示例为酿酒酵母，诸如 菌株Y-152、Tembec-l等。适宜的真菌种类示例为曲霉属和木霉属。适宜的细菌的示例为 大肠杆菌、发酵单胞菌属、梭菌属和棒状杆菌属。包括天然的和遗传改造的菌等。在本发明 范围内的是，提供包括以下菌株的接种物单个菌株或可选地来自 一个类型微生物的多个 菌株或进一步可选地包括来自多个种或微生物类型(即，酵母、真菌和细菌)的菌株的菌株 混合物。适宜的酶的示例是纤维素酶、半纤维素酶、P-葡萄糖苷酶、P-木糖苷酶、a-淀 粉酶、P-淀粉酶和其它这样的聚糖酶。 根据本发明的另一个示例实施方案，提供了并行糖化和发酵从提取的纤维性木 质纤维素原料分离的固体部分的方法，其包括混合以下组分分离的固体部分和适宜的液 流、有效量的被遗传改造为发酵戊糖碳水化合物和分泌降解生物质的酶的酿酒酵母菌株 Y-1528培养物。


本发明通过结合以下附图描述，其中 图l是比较专有酿酒酵母菌株(Ethanol Red ;Ethanol Red是法国巴黎Lesaffre et Compagnie的注册商标)与命名为"Y-1528"的公有领域酿酒酵母菌株当培养在包括 两种或三种单糖的混合物溶液时，它们的己糖到乙醇的转化效率。数据点是三个样品的平 均值的图。数据点上方和下方延伸的条代表在95%置信水平的士标准偏差(SD)。没有SD 条的数据点包含那些数据点的SD范围。 图2是显示了当培养在使用添加有从采伐的不列颠哥伦比亚(BritishColumbia) 白杨(欧洲白杨)全原木获得的阔叶树固体部分作为发酵基质的同时存在的糖化和发酵系 统中，酿酒酵母菌株Y-1528的乙醇产生速率。数据点是三个样品的平均值。数据点上方和 下方延伸的数据条代表在95%置信水平的±标准偏差(SD)。没有SD条的数据点包含那 些数据点的SD范围。 图3显示，当培养在添加有半乳糖和甘露糖的从白杨获得的阔叶树固体部分作为 发酵基质同时存在的糖化和发酵系统中，酿酒酵母菌株Y-1528的乙醇产生速率。数据点是 三个样品的平均值。数据点上方和下方延长的数据条代表在95%置信水平的±SD。没有 SD条的数据点包含那些数据点的SD范围。 图4显示，当培养在半乳糖/甘露糖基质16h后，接种到添加有从白杨获得的阔叶 树固体部分作为发酵基质的同时存在的糖化和发酵系统中，酿酒酵母菌株Y-1528的乙醇 产生速率。数据点是三个样品的平均值。数据点上方和下方延长的数据条代表在95%置信 水平的±SD。没有SD条的数据点包含那些数据点的SD范围。 图5显示，比较了图2-4中所示的三个系统中酿酒酵母菌株Y-1528的乙醇产生速 率。数据点是三个样品的平均值。数据点上方和下方延长的数据条代表在95%置信水平的 ±SD。没有SD条的数据点包含那些数据点的SD范围。
具体实施例方式
本发明的示例性的实施方案关于这样的发酵工艺和系统，其设计为并行糖化和发 酵(CSF)固体部分和任选地富含从提取的纤维性木质纤维素和用过的提取溶剂分离的碳 水化合物的脱毒液体部分。这种CSF系统通常也称为并行糖化和发酵(SSF)工艺。本发明 的发酵工艺可以设计为间歇工艺，或可选地，连续工艺，或进一步可选地为半连续工艺或补 料分批工艺。 本发明的示例实施方案涉及用有机溶剂加工选择的木质纤维素原料，产生通常包 括纤维素纤维(即，富含纤维素的固体部分)的固体部分和包括有机溶剂的液体部分，所述 有机溶剂中溶解有包括在木质纤维素原料的各种结构性有机和矿物组分。用于分离成固体 和液体部分的适宜木质纤维素原料混合物的示例为来自植物材料如被子植物、裸子植物和 大田作物、植物性或果实浆料、木头和木头加工的碎片和废料，可循环的纸、硬纸板货物等 以及它们的混合物的纤维生物质。选择的木质纤维素原料与适宜的通常用于有机溶剂工艺 的溶剂混合，然后加工木质纤维素原料一段合适的时间，使得包括纤维素浆料的固体部分 与含有溶解的组分如木质素、半木质素、多糖、低聚糖及其它化合物的液体部分分离。有机溶剂工艺利用有机化学品如短链脂族醇(例如甲醇、乙醇)、甲酸、乙酸、乙酸乙酯、苯酚和 甲酚作为浆化溶剂，从植物生物质溶解和转移木质素。在纤维性木质纤维素材料的溶剂去 木质素的过程中，大多数植物基的纤维的半纤维素组分部分水解和溶解到溶剂中。随着有 机溶剂工艺逐渐完成，简单的碳水化合物和低聚糖释放到黑液中(黑液是溶解的木质素、 碳水化合物、碳水化合物分解的化合物和其它的有机和无机化合物与水和用于提取的化学 物质的混合物)。接着将这些碳水化合物经过浆液加工步骤，其包括在沸点温度下蒸发稀 释的液流、冷却蒸发过的液体、调节PH到发酵的条件和最后将作为蒸发浓縮物排出加工系 统，准备与SSF工艺方案中的固体混合或准备另外发酵为乙醇。 本发明的另一个示例实施方案是关于进一步加工蒸发浓縮物除去木质素组分或 木质素降解产物、碳水化合物降解产物、提取物降解产物，由此产生富含脱毒的碳水化合物 的有机溶剂，该有机溶剂适合用于在进行并行糖化和发酵步骤前稀释富含纤维素的固体部 分以降低其粘度。 本发明的另一个示例实施方案涉及混合含有富含脱毒碳水化合物的有机或无机 溶剂的富含粘度降低的纤维素固体部分和选择用于增加以下的速率和效率的微生物接种 物和酶(a)将富纤维素的固体主要糖化为葡萄糖、甘露糖、半乳糖和较少程度地糖化为木 糖和阿拉伯糖，和(b)并行发酵这些通过酶水解作用产生的己糖和戊糖。发酵戊糖和/或 己糖碳水化合物的适宜微生物接种物包括选自酵母菌种、真菌种和细菌种的一种或多种适 宜菌株。适宜的酵母的示例为酵母属和毕赤酵母属。适宜的酵母属的示例为酿酒酵母等。 适宜的真菌菌种的示例为曲霉属和木霉属。适宜细菌的示例为天然的和遗传改造的大肠杆 菌、发酵单胞菌属、梭菌属和棒状杆菌属等。提供下列菌株的接种物也在本发明的范围内 单个菌株或可选地，包括来自单个类型生物的多个菌株，或者还可选地，包括来自多个菌株 和微生物类型(即，酵母、真菌和细菌)的菌株的混合物。适宜的酵母属培养物的示例为酿 酒酵母菌株Y-1528、Tembec-l，它们可以是天然的和/或遗传工程改造的菌株。在纤维生物 质例如木质生物质发现的所有的三个主要己糖碳水化合物，即葡萄糖、半乳糖和甘露糖会 被这样的酿酒酵母菌株Y-1528培养物同时发酵为乙醇，由此避免通常使用的酵母种和菌 株的长滞后时间和与之相关的高运行成本。消除这些自养相关的时间滞后具有加快总发酵 工艺、由此减少设备大小要求和相关的资本成本等益处。另外，通常在糖化纤维素中使用的 降解生物质的酶制剂常常具有足够的第二种活性，将预处理步骤期间衍生于半纤维素的大 多数半纤维素多糖和低聚糖水解为它们的组成多糖。因此，由于衍生于半纤维素的低聚糖 可以任意地加入到本发明工艺的糖化阶段，不需要大量的另外的降解半纤维素的酶来最大 发酵在提取纤维性木质纤维素原料所提供的水解工艺期间产生的各种单糖组分。依赖于纤 维素酶的酶源，可以有足够的第二活性来完全水解与固体纤维素浆料相关的半纤维素。如 果没有，任选地将附加的木聚糖酶、P-木糖苷酶、酯酶和其它的降解半纤维素的酶可以任 选地加到糖化混合物中以实现该期望目标。 尽管本发明的工艺，其中有效量的微生物培养物如酿酒酵母菌株Y-1528与纤维 性生物质固体部分和适宜的液流混合，特别适于工业SSF工艺，但是它们也适于分开的水 解和发酵(SHF)工业工艺。另外，处理从提取的木质纤维素原料分离的固体部分以在将生 物质运送到SSF工艺或可选地运输到SHF工艺前启动纤维破裂和水解在本发明的范围内。
在目的是产生燃料乙醇的工业工艺中，经济期望的是，在从有机溶剂提取或其它
9适于纤维性木质纤维素原料的提取或预处理方法中获得的发酵液中产生的乙醇浓度为大 于5. 0-6. 5% w/w。为了实现该目标，在糖化阶段典型的有机溶剂预处理的生物质样品需要 具有至少16% (w/w)的木质纤维素固体稠度。这些发酵母液浓度(大约> 5. 0% w/w)是在 相对低的干物质浓度的有机溶剂基质的情况下取得的。含有16%固体的混合的固体部分悬 浮液很稠、很粘，且难于混合。这是预处理最好的有机溶剂基质的最好实例(其它的基质如 蒸汽爆裂木材或稀酸预处理的农业残留物会需要高得多的稠度(30-40%)以实现该目标， 因为具有高含量的非发酵组分，如灰分(5-15%)和木质素(20-40% ))。有机溶剂处理的来 自提取的木质纤维素基质如木材基质的固体部分没有该问题，因为最适提取的木材基质具 有低于0.5%的灰分含量和低于5%的木质素含量。因此，本发明的另一个实施方案提供了 含有酿酒酵母Y-1528的工艺，其中包含碳水化合物混合物的液流与固体木质纤维素材料 混合，由此提供了较低的稠度，即较低稠度的固体，其反过来促进实现发酵液中最终的乙醇 浓度，其>5. 0-6.5%。含有混合液体碳水化合物流的一个方面是一些单糖，例如木糖形式， 会存在于水解纤维性木质纤维素的早期阶段。附带存在的木糖会提供给酵母其代谢和活力 所需要的碳源，这在大多数原纤维生物质原料的水解早期阶段不存在。提供根据该实施方 案的补充的液体碳水化合物流有助于更完全地利用来自包括农业废弃物的木质或非木质 生物质的混合己糖碳水化合物，由此在设计为处理这些类型木质纤维素原料的木质纤维素 生物精炼厂中产生更少的废物和更低的废物处理成本。这也会利于在后期阶段通过天然的 戊糖发酵微生物如树干毕赤酵母(Pichia stipitis)将戊糖碳水化合物发酵为乙醇，树干 毕赤酵母通常受到葡萄糖存在的抑制。该实施方式也可以降低与在SHF或SSF系统中高粘 度的材料必要混合相关的能量成本，同时利于在发酵母液中产生终浓度超过5. 0-6. 5% w/ w的乙醇。另外，该实施方案可以使降低微生物的负载，即降低功效所需要的酵母培养物的 量，因为更高浓度的己糖和戊糖碳水化合物会被酵母代谢利用并维持纤维素固体水解和发 酵早期阶段的活力。 根据该实施方案，高稠度(> 40% )的固体纤维素组分用含有来自于用于提取木 质纤维素原料的溶剂的单糖和低聚糖混合物的含水液流稀释到适于SSF或SHF的稠度( 20%)。适宜的预处理工艺的示例为有机溶剂、蒸汽爆裂、稀酸水解、氨纤维爆裂(ammonia fiber e邓losion) (AFEX)等。另外，在本发明的范围的是，对于适宜的纤维素酶、半纤维素 酶和其它的降解生物质酶混合物，预混合到液体碳水化合物流中，由此进一步利于完全水 解富含低聚糖部分和富含固体纤维性纤维素组分。在SSF工艺中，有效量的适宜微生物接 种物会加入到混合物中，由此提供与糖化工艺并行的发酵装置。适宜的微生物接种物包括 至少一个选自酵母种、真菌种和细菌种的菌株。适宜的酵母的示例为酵母属和毕赤属。适 宜的酵母属的示例为酿酒酵母等。适宜的真菌种的示例为曲霉属和木霉属。适宜的细菌的 示例为大肠杆菌、发酵单胞菌属、梭菌属和棒状杆菌属等，它们是天然的和遗传改造的。在 本发明的范围内的是，提供包括以下菌株的接种物单个菌株或可选地来自单个类型微生 物的多个菌株，或进一步可选地包括来自多个菌种和微生物类型(即，酵母、真菌和细菌) 的菌株的混合物。 在SHF工艺中，糖化会首先进行，接着进行发酵。完全发酵后，蒸馏得到的乙醇发 酵液以收集乙醇。剩余的釜馏液可以被进一步加工以收集(a)残余的木质素，其适合作为 原料或可选地作为产生基于木质素的塑料、粘合剂、抗氧化剂、表面活性剂、包衣材料等的
10原材料，(b)用于转化成饲料蛋白或回收以再用于乙醇生产工艺的酵母细胞，(c)木糖和/
或阿拉伯糖，其用作食品工业的原材料或被微生物发酵或通过化学装置加工为乙醇或其它
有用的化学物质如木糖，同时(d)被喜氧或厌氧处理设备处理的任何残留液体。 本发明用于并行的下游糖化和发酵在上游提取和分裂纤维性木质纤维素原料期
间释放的结构组分的工艺、系统和方法，在以下实施例中更加具体地描述，其为示例性的，
不是旨在限定本发明。 实施例1 Red Ethanol⑧的酿酒酵母菌株的干培养物从PhibroChem(Ridgefield Park, NJ， USA)获得。酿酒酵母菌株Y-1528的培养物获于美国国家农业应用研究中心的美国农业研 究菌种保藏中心(美国伊利诺斯州皮奥里亚)。通过在琼脂板上培养酵母菌株制备酵母 接种物。提供2L的三角瓶，每个瓶子含有600mL的生长培养基，生长培养基含有BioShop Canada Inc. (Burlington, 0N， Canada)供应的1%酵母提取物和1%蛋白胨、2%蔗糖 (Sigma, St. Louis， M0， USA)。用10% v/v HC1将pH调节到5. 5。用从琼脂板挑取的菌落 接种三角瓶，接着将接种的培养基在微好氧条件下在3(TC以250rpm的速率振动培养过夜。
发酵实验在250mL三角瓶中进行，每个三角瓶含有lOOmL的0. 1M柠檬酸缓冲液 (pH 5. 5)。准备两套三角瓶。第一套三角瓶接收(a)47. 5g/L甘露糖和(b)47. 5g/L半乳糖。 第二套三角瓶接收(a)47. 5g/L甘露糖、(b)47. 5g/L半乳糖和(c)47. 5g/L葡萄糖。每个三 角瓶也力口入0. 5ppm的抗生素Lactrol (Lactrol是Phibro Animal Health Corp. ， Fort Lee， NJ， USA的注册商标)。通过向选择的三角瓶中加入3g/L odw的从酵母提取物_蛋白 胨生长培养基收集的酵母细胞一式两份，然后在36t:培养这些接种后的三角瓶，检测各酵 母菌株在这些培养基中的发酵特性。在0、 1 、2、3、 12、20、40和64h取每个三角瓶中的上清 样品分析(a)通过气相色谱(GC)测乙醇含量和(b)通过HPLC测定碳水化合物含量。
该研究结果示于图1中。Red ￡让肌01@酿酒酵母菌株是为工业性的从淀粉到乙醇 工业开发的专门选择的菌株。该菌株对乙醇具有高的耐受性，被设计用于在高的温度下产
生醇类。图l中的数据表明，在高温(即，36t:)下在半乳糖-甘露糖基质和在半乳糖-甘
露糖-葡萄糖基质中，公有领域的酿酒酵母菌株Y-1528的发酵特性与Red ￡让肌01 菌株 相似。接种后12h小时内，这两种酵母菌株都达到最大乙醇浓度约3. 7% w/w的乙醇，这相 当于约76%的总乙醇理论产率。在12h后，上清中不存在可检测浓度的碳水化合物，这表明
这两种酿酒酵母菌株都实现了完全的碳水化合物消耗。
实施例2 使用从白杨木碎片(称为Asp4)产生的阔叶树木浆评价酿酒酵母菌株Y-1528在 SSF系统中的产乙醇特性。Asp4桨液从不列颠哥伦比亚白杨(欧洲山杨)原木的代表样本 制备，将原木采伐。剥皮、裂开、碎片和碾碎为大小为20mmX20mmX3mm的碎片。将碎片贮存在 环境温度下的通气的塑料袋中，直到含水量达到约10%。接着将200g(0. d. w.)的风干碎片 进行在195"下在含有乙醇水溶液(50% ;w/w)的定制高压间歇反应器(Parr Instrument Co. ，Moline， IL， USA)中使用0. 55%硫酸作为催化剂以浆液木材为5 : 1的比例进行有 机溶剂预处理30分钟。经30分钟的熬炼时间后，用水冷却旋管将反应器冷却到环境温度。 接着通过过滤将固体和浆液分开。用温的70% (v/v)乙醇溶液在British粉碎机均化固体 部分，接着用水洗涤。洗涤的固体部分即，浆液用液压挤压以将最终的含水量降低到约50%(w/w)。化学分析最终的Asp4浆液以测定其组成(a)阿拉伯聚糖=0%， (b)半乳聚糖= 0%， (c)葡聚糖=84.87%， (d)木聚糖=5. 71%， (e)甘露聚糖=1. 59%和(f)木质素= 2. 94%。 该研究的反应混合物包括16. 0g的Asp4 〃湿 〃 浆液，用68. 24mL的0. 1M柠檬酸缓 冲液在2. 0L三角瓶中稀释到8% 。 ASP4浆的固体含量是48. 23% ，而葡聚糖含量是为93% 。 向反应混合物补充有O. 5卯m的Lactrol⑧，和2g的包括1. 7g/L的Yeast Nitrogen Base(酵 母氮源)(Prod. No. YNB404 ;BioShop Canada Inc.) 、2. 27g/L尿素(Prod. No. URE002 ; BioShop Canada Inc.)和6.56g/L蛋白胨(Prod. No. PEP403 ;BioShop Canada Inc.)的酵 母营养混合物。加入里氏木霉纤维素酶制剂(Novozym 50013 ;Novozymes， Franklinton， NC， USA)，得到20. 0FPU/g葡聚糖(FPU =滤纸酶活单位)。加入黑曲霉P -葡萄糖苷酶 (Novozym 50010 ;Novozymes)得到40. 0CBU/g葡聚糖(CBU =纤维二糖酶单位，表示为每分 钟转化为葡萄糖的纤维二糖酶的摩尔数)。根据实施例1所述制备的酿酒酵母菌株Y-1528 接种物加入到反应混合物中，浓度为5g/L。三角瓶准备一式三份。每个三角瓶加入十个锆 混合球，接着将三角瓶在36t:在微喜氧条件下以150rpm振动培养。在18h、25h和40h从三 角瓶取样。分别通过GC和HPLC测定取样的反应混合物中的乙醇产量和单糖浓度。图2中 的数据显示，就该反应混合物中最大的乙醇产量而言，SSF反应工艺基本在20小时内完成。
实施例3 向Asp4〃湿〃 浆补充半乳糖和甘露糖对实施例2中所述SSF系统中的酿酒酵母菌 株Y-1528的乙醇产生的效应通过向反应混合物的柠檬酸缓冲液组分中加入半乳糖和甘露 糖母液达到终浓度2. 5g/L的半乳糖和2. 5g/L的甘露糖测定。其它的反应组分即Asp4浆、 养分、酶和酵母接种物与实施例2所述的相同。准备三角瓶一式三份。每个三角瓶加入十 个锆混合球，接着将三角瓶在36t:在微喜氧条件下以150rpm振动培养。在4h、 18h、25h和 40h从三角瓶取样。分别通过GC和HPLC测定取样的反应混合物中的乙醇产量和单糖浓度。 图3中的数据显示，在40小时的SSF反应工艺期间酵母细胞保持活力和活性，表现为在最 初的25h期间葡萄糖浓度减小，接着在随后的取样期间增加，但是甘露糖和半乳糖浓度在 前25h降低，随后保持恒定。大部分的乙醇产生在最初的25h内，但是乙醇产生的速度在研 究期间下降，在每个取样时间记录到了乙醇浓度不断增加。
实施例4 本研究测定了通过将酵母培养在糖培养基中16小时以引发其发酵活性，接着将 活跃发酵的酵母转移到实施例3中所述的SSF系统中进行调节酿酒酵母菌株Y-1528的 效应。包含调节到pH 5. 5的0. 1M柠檬酸缓冲液的调节培养物溶液补充2. 5g/L半乳糖和 2. 5g/L的甘露糖。调节的培养物溶液接种如实施例1所述的5g/L的接种物。调节的培养物 溶液在3(TC在微喜氧条件下以250rpm振动培养16h。接着取出68. 24mL调节的培养物溶液 并添加8. 51mL的新鲜0. 1M柠檬酸缓冲液。添加缓冲液的调节培养物溶液接着被用于制备 实施例3中的补充半乳糖和甘露糖的反应混合物。三角瓶准备一式三份。向每个三角瓶中 加入十个锆混合球(Ten Zirconium mixing balls)，然后在36。C在微喜氧条件下在150rpm 振动下温育三角瓶。在18h、25h和40h对这些三角瓶取样。分别通过GC和HPLC测定取样 的反应混合物中乙醇的产量和单糖的浓度。图4中的数据表明将处理的酵母加到补充半乳 糖和甘露糖的反应混合物中能够使发酵进行达到40小时SSF期的终点(即， 100%完全转化为乙醇)。
实施例5 酿酒酵母菌株Y-1528在实施例2-4所述的三个SSF条件下的乙醇生产特性示于 图5。当该菌株用于36t:下以纤维素浆作为发酵基质的SSF工艺时，其乙醇产量为3. 7% 乙醇(w/w)，在18h计算为84%，在40h计算为86%，这两个数值都是与理论产量相比的值 (图5 ;实施例2)。向发酵基质加入2. 5g/L半乳糖和2. 5g/L甘露糖将乙醇的产量增加到 4.68% (w/w)，经测定，在18h为潜在理论产量的78X，在40h为理论产量的85X (图5 ;实 施例3)。通过在含有两种单糖的培养基中培养，接着加入补充有半乳糖和甘露糖的发酵基 质预处理酵母菌株，进一步将相同时期的SSF系统中的乙醇产量增加到5. 56% (w/w)，该量 计算为18h的理论产量的93%，和40h的理论产量的100% (图5 ;实施例4)。
尽管已经根据示例实施方案对本发明进行了描述，但是本领域技术人员会明白如 何通过混合适宜选择的液体流降低固体部分的粘度，然后在其中混合有效量的适宜微生物 接种物和适宜酶，来更改和修改本文所述的用于并行糖化和发酵从提取的木质纤维素原料 分离的固体和液体部分的这些工艺、系统和方法。鉴于许多改变和变体对本领域技术人员 是显而易见的，本发明的范围被认为只限于所附权利要求。
权利要求
并行糖化和发酵从木质纤维素原料提取的纤维素固体部分的方法，该方法包括步骤将提取的木质纤维素原料分离为纤维素固体部分和液体部分；加工所述的液体部分以从中除去提取的木质素，由此产生一种脱毒的或没有脱毒的液体部分；通过将所述的纤维素固体部分与部分所述脱毒的或没脱毒的液体部分混合来降低分离的纤维素固体部分的粘度；混合粘度降低的纤维素固体部分和(a)有效量的发酵微生物培养物以及(b)有效量的降解纤维素生物质的酶；混合所述的微生物培养物、所述降解生物质的酶和所述粘度降低的纤维素固体部分，以提供包含乙醇的反应混合物；和从所述反应混合物分离乙醇。
2. 根据权利要求l的方法，其中所述脱毒的或没脱毒的液体部分与液体碳水化合物流 混合。
3. 根据权利要求l的方法，其中所述液体碳水化合物流含有葡萄糖、半乳糖、木糖或其 混合物中的一种。
4. 根据权利要求1的方法，其中在与纤维素固体部分混合前，所述脱毒的或没脱毒的 液体部分另外地被加工，以除去乙酸、糠醛和5-羟甲基-2糠醛中的至少一种。
5. 根据权利要求1的方法，其中所述木质纤维素原料选自由以下物质组成的组被子 植物生物质、裸子植物生物质、大田作物生物质、植物性浆和/或果实浆、木材和木材加工 的碎片和废料、可再循环的纸和硬纸板货物。
6. 根据权利要求l的方法，其中发酵微生物培养物是选自由酵母种、真菌种、原生动物 种和细菌种组成的组的菌株。
7. 根据权利要求6的方法，其中发酵微生物培养物是选自由天然菌株和遗传改造的菌 株组成的组的菌株。
8. 根据权利要求7的方法，其中发酵微生物培养物选自酵母属的菌株。
9. 根据权利要求8的方法，其中发酵微生物培养物是酿酒酵母菌株Y-1528。
10. 根据权利要求7的方法，其中发酵微生物培养物是选自由木霉属和曲霉属组成的 组的真菌菌株。
11. 根据权利要求7的方法，其中发酵微生物培养物是选自由发酵单胞菌属、棒状杆菌 属、梭菌属和大肠杆菌组成的组的细菌菌株。
12. 根据权利要求l的方法，其中降解纤维素生物质的酶选自由纤维素酶、P-葡萄糖 苷酶、半纤维素酶、13 -木糖苷酶和它们的混合物组成的组。
13. 根据权利要求l的方法，其中所述方法是间歇工艺。
14. 根据权利要求l的方法，其中所述方法是连续工艺。
15. 根据权利要求l的方法，其中所述方法是半连续工艺或补料分批工艺之一。
16. 并行糖化和发酵从木质纤维素原料提取和分离的纤维素固体部分的方法，该方法 包括步骤通过混合纤维素固体部分与包括至少一种单糖碳水化合物的液流，降低所述分离的纤维素固体部分的粘度；混合粘度降低的纤维素固体部分与(a)有效量的发酵微生物培养物以及(b)有效量的 降解纤维素生物质的酶；混合所述微生物培养物、所述降解生物质的酶和所述粘度降低的纤维素固体部分，以 提供包含乙醇的反应混合物；禾口从所述反应混合物分离乙醇。
17. 根据权利要求16的方法，其中所述液流包括选自由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖 及其混合物组成的组的单糖。
18. 根据权利要求16的方法，其中所述木质纤维素原料选自由以下物质组成的组被 子植物生物质、裸子植物生物质、大田作物生物质、植物性浆和/或果实浆、木材和木材加 工的碎片和废料、可再循环的纸和硬纸板货物。
19. 根据权利要求16的方法，其中发酵微生物培养物是选自由酵母种、真菌种和细菌 种组成的组的菌株。
20. 根据权利要求19的方法，其中发酵微生物培养物是选自由天然菌株和遗传改造的 菌株组成的组的菌株。
21. 根据权利要求20的方法，其中发酵微生物培养物选自酵母属的菌株。
22. 根据权利要求21的方法，其中发酵微生物培养物是酿酒酵母菌株Y-1528。
23. 根据权利要求20的方法，其中发酵微生物培养物是选自由木霉属和曲霉属组成的 真菌菌株。
24. 根据权利要求20的方法，其中发酵微生物培养物是选自由发酵单胞菌属、棒状杆 菌属、梭菌属和大肠杆菌组成的组的细菌菌株。
25. 根据权利要求16的方法，其中降解纤维素生物质的酶选自由纤维素酶、13 -葡萄糖 苷酶、半纤维素酶、13 -木糖苷酶、聚糖酶和它们的混合物组成的组。
26. 根据权利要求16的方法，其中所述方法是间歇工艺。
27. 根据权利要求16的方法，其中所述方法是连续工艺。
28. 根据权利要求16的方法，其中所述方法是半连续工艺。
29. 并行糖化和发酵从木质纤维素原料提取的纤维素固体部分的系统，所述系统包括 多个互联的协作装置，这些装置设计用于可控地传送和接收通过其中的液流供应；接收和加工其中的纤维素固体部分，同时可控地传送液流供应；可控地接收其中的加工的纤维素固体部分流，其中含有并行糖化和发酵工艺，该工艺 设计为从所述加工的纤维素固体部分产生反应产物，和可控制的从中排出反应产物；禾口 将反应产物分离成选择的组分并可控地排出各所述分离的组分。
30. 根据权利要求29的系统，其中所述系统设计为接收和加工其中的多个批次的提取 的纤维素固体部分。
31. 根据权利要求29的系统，其中所述系统设计为连续接收和加工其中的提取的纤维 素固体部分，同时从中并行排出反应产物。
32. 根据权利要求29的系统，其中所述系统设计为从中收集液体组分。
33. 根据权利要求32的系统，其中所述收集的液体组分被进一步加工和制备，以适于再循环为液流供应。
34.根据权利要求33的系统，其中所述提取的纤维素固体部分通过与部分所述再循环 的液流供应混合进行预处理。
全文摘要
本发明涉及并行糖化和发酵从木质纤维素提取的纤维素固体部分的方法。纤维素部分的粘度通过与液体碳水化合物流混合降低。适宜的液体碳水化合物流是事先在木质纤维素原料的加工过程中从固体部分分离的脱木质素的液体部分。可选地，通过与包括一种或多种单糖的液体碳水化合物流混合降低固体部分的粘度。粘度降低的纤维素固体部分接着与发酵的微生物接种体以及纤维素生物质降解酶组合物混杂。混杂的混合物保持在高温的加压的反应容器中，使得能够同时将纤维素固体酶促水解为单糖和将单糖发酵产生乙醇发酵液。将乙醇发酵液蒸馏回收燃料级乙醇和釜馏液，釜馏液可以被进一步加工。
文档编号C08H8/00GK101784668SQ200880103958
公开日2010年7月21日 申请日期2008年7月4日 优先权日2007年7月4日
发明者亚历克斯·伯林, 唐纳德·奥康纳, 爱德华·肯德尔·派伊 申请人:丽格诺新创有限公司