专利名称：一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法，尤其是利用秦巴山区天然资源
的秦巴绞股蓝中草药中提取、分离、纯化一种中性多糖的方法。
背景技术：
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本 植物，具有增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、抗氧化等作用，且安全无毒。目前，全世界已 知绞股蓝植物有13种，我国占11种，其中7种为我国独有，占全部种数的53. 8% 。绞股蓝 主要分布在亚洲一些国家，在我国应属陕西绞股蓝资源最为丰富，主要分布在以秦巴山区 为中心的37个县市，安康、平利等县市目前已成为我国绞股蓝最大的生产基地，所产绞股 蓝品种最为优良。 近年研究发现绞股蓝多糖是绞股蓝的有效活性成分之一，具有增强免疫、抗肿瘤、 抗氧化、降血糖、抗疲劳等药理作用。目前国内外对绞股蓝多糖的研究普遍停留在粗多糖水 平，主要集中在粗多糖提取和生物活性等方面的研究。中国专利公开号CN1098298A所述 的绞股蓝多糖的提取技术，得到的多糖含有蛋白质、色素等其他成分。中国专利公开号CN 1490338A所用技术，虽然进行了除蛋白处理过程，但是缺少脱色等程序，此方法得到的绞股 蓝多糖也只是粗品，含有大量色素等其他成分。目前尚未分离纯化得到均一的绞股蓝多糖 组分。
发明内容
要解决的技术问题 为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种在绞股蓝中制备中性多糖的方
法，可以制备得到均一的绞股蓝多糖组分。 技术方案 —种在绞股蓝中制备中性多糖的方法，其特征在于中性多糖的制备由3步实现 先自绞股蓝中制备得到粗多糖，然后制得精制多糖，由精制多糖制备得到中性多糖；具体步 骤如下 步骤1 :将95%乙醇加入到水分干燥的绞股蓝中，在50±2°C的温度下搅拌1小 时，然后过滤收集滤渣；再将滤渣采用95%乙醇在50士2t:回流搅拌1小时后过滤收集滤 渣；再将滤渣采用95%乙醇在50士2t:回流搅拌1小时后过滤收集滤渣；将滤渣自然风 干后加入6-10倍相对滤渣质量重的蒸馏水，在90-95 t:下搅拌10-12h，过滤收集滤液，重 复2-3次；将上述每次收集得到的滤液合并，在5(TC下抽真空减压浓縮，在流动水中透析 48h ; 步骤2 :向步骤l得到的透析袋的溶液加入4倍体积的乙醇，在4t:下保存10-12h ; 然后用高速离心机在5000rpm离心10min，收集其中的沉淀物，依次采用乙醇、丙酮和乙醚 进行洗涤，再40-45t:真空干燥6h，得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖；
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步骤3 :将粗多糖加双蒸水配成浓度为5%的水溶液，用lmol/L HC1调节pH为 5. 5，加入粗多糖质量1/20的木瓜蛋白酶在65t:恒温下搅拌3h后加热至IO(TC终止酶反 应； 步骤4 :加入双蒸水将步骤3得到的溶液稀释至0. 5%，滴加浓氨水将pH值调至 8. 0，于5(TC边搅拌边逐渐加入30% H202，搅拌3 5小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色， 停止搅拌在5(TC下抽真空减压浓縮； 步骤5 :向步骤4得到的浓縮液加入其体积1/5的sevag试剂，震荡20min，放入高 速离心机中在5000rpm离心15min ;离心完后收集上清液，再加入其体积1/5sevag试剂，重 复5次；将得到的上清液用蒸馏水透析48h，收集透析袋中的溶液，加入其4倍体积的乙醇， 在4t:放置10-12h ;放入高速离心机中在5000rpm离心10min，离心完后收集沉淀，依次分 别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤，冷冻干燥12h，得到白色绞股蓝精制多糖；
步骤6 :将精制绞股蓝多糖lg溶于50mL双蒸水，5000rpm离心15min，取上清，上 DEAE-52 cellulose柱，上样量为交换容量的10% 20% ; 步骤7 :将上述的离子交换柱依次用双蒸水、0 lmol/L NaCl溶液线性梯度洗脱， 收集合并第一流出物的蒸馏水洗脱液，在5(TC下减压浓縮，蒸馏水透析48h，冷冻干燥得到 绞股蓝中性多糖。
有益效果 本发明提出的一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法，是一种从绞股蓝中提取、分 离、纯化的中性多糖的制备方法。本发明利用多糖、糖蛋白溶于水的特性，用水提法浸提，并 用乙醇分级沉淀法分离，最后用阴离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化多糖。
图1秦巴绞股蓝精制多糖的DEAE-52 cellulose柱层析
图2 GPMPA的S印hadex G-100凝胶柱层析
图3 9种单糖标准品糖腈衍生物GC图
图4 GPMPA糖腈衍生物GC图
具体实施例方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述
本实施例中采用秦巴绞股蓝制备中性多糖。
实施例1 称取干燥绞股蓝500g，加入2500mL95%乙醇，在50°C的温度下搅拌1小时，然后 过滤收集滤渣；再将滤渣采用95%乙醇在5(TC回流搅拌1小时后过滤收集滤渣；再将滤渣 采用95%乙醇在5(TC回流搅拌1小时后过滤收集滤渣；将滤渣自然风干后加入3000mL的 蒸馏水，在95t:下搅拌10h，过滤收集滤液，重复3次；将上述每次收集得到的滤液合并，在 5(TC下抽真空减压浓縮至1L，在流动水中透析48h ; 向透析后的溶液加入4倍体积的乙醇，在4。C下保存12h ;然后用高速离心机在 5000rpm离心10min，收集其中的沉淀物，依次采用乙醇、丙酮和乙醚进行洗涤，在4(TC真空 干燥6h，得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖；
称取10g秦巴绞股蓝粗多糖，加200mL去离子水配成5X粗多糖溶液，，用lmo1/ LHC1调节pH为5. 5，加入0. 5g木瓜蛋白酶，65。C恒温搅拌3h后加热至IO(TC，保持6min， 灭活，终止酶反应； 加入1800mL双蒸水将溶液稀释至0. 5% ，滴加浓氨水将pH值调至8. 0，于5(TC边 搅拌边逐渐加入30% 11202，搅拌3小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色，停止搅拌，用醋酸 调节pH值至7. O，在5(TC下抽真空减压浓縮至500mL ; 向浓縮液加入100mL sevag试剂，震荡20min，放入高速离心机中在5000rpm离心 15min ;离心完后收集上清液，再加入其体积1/5 sevag试剂，重复5次；将得到的上清液用 蒸馏水透析48h，收集透析袋中的溶液，加入其4倍体积的乙醇，在4t:放置12h ;放入高速 离心机中在5000rpm离心10min，离心完后收集沉淀，依次分别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤，冷 冻干燥12h，得到白色绞股蓝精制多糖； 将精制绞股蓝多糖lg溶于50mL双蒸水，5000rpm离心15min，取上清，上DEAE-52 cellulose柱，上样量为交换容量的10% 20% ; 将上述的离子交换柱依次用双蒸水、0 lmol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集合
并第一流出物的蒸馏水洗脱液，在5(TC下减压浓縮，蒸馏水透析48h，冷冻干燥得到绞股蓝
中性多糖。 实施例2 称取干燥绞股蓝20kg，加入120L蒸馏水，投入提取罐中，在95。C下搅拌10h，过滤 收集滤液，重复2次；将上述每次收集得到的滤液合并，在50°C下抽真空减压浓縮至40L，在 流动水中透析48h ; 向透析后的溶液加入4倍体积的工业乙醇，在fC下保存10h ;然后用高速离心机 在5000rpm离心10min，收集其中的沉淀物，依次采用乙醇、丙酮和乙醚进行洗涤，在45°C真 空干燥6h，得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖； 称取10g秦巴绞股蓝粗多糖，加200mL去离子水配成5X粗多糖溶液，用lmo1/ LHC1调节pH为5. 5，加入0. 5g木瓜蛋白酶，65。C恒温搅拌3h后加热至IO(TC，保持6min， 灭活，终止酶反应； 加入1800mL双蒸水将溶液稀释至0. 5% ，滴加浓氨水将pH值调至8. 0，于5(TC边 搅拌边逐渐加入30% 11202，搅拌3小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色，停止搅拌，用醋酸 调节pH值至7. O，在5(TC下抽真空减压浓縮至500mL ; 向浓縮液加入100mL sevag试剂，震荡20min，放入高速离心机中在5000rpm离心 15min ;离心完后收集上清液，再加入其体积1/5 sevag试剂，重复5次；将得到的上清液用 蒸馏水透析48h，收集透析袋中的溶液，加入其4倍体积的乙醇，在4t:放置12h ;放入高速 离心机中在5000rpm离心10min，离心完后收集沉淀，依次分别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤，冷 冻干燥12h，得到白色绞股蓝精制多糖； 将精制绞股蓝多糖lg溶于50mL双蒸水，5000rpm离心15min，取上清，上DEAE-52 cellulose柱，上样量为交换容量的10% 20% ; 将上述的离子交换柱依次用双蒸水、0 lmol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集合 并第一流出物的蒸馏水洗脱液，在5(TC下减压浓縮，蒸馏水透析48h，冷冻干燥得到得到本 发明的秦巴绞股蓝中性多糖GPMPA，如图l所示。
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实施例制备的秦巴绞股蓝中性多糖GPMPA的理化性质
1.纯度测定 S印hadex G-100填料在IO(TC溶胀5h后，用1. 0mol/L NaoH溶液处理，以蒸馏水 洗至中性后装柱(柱尺寸为1.6cmX50cm)。装柱后用蒸馏水平衡48h。将GPMPA 50mg溶 于5mL双蒸水，离心，取上清，过柱，用0. lmol/L NaCl溶液洗脱，流速O. 5mL/min，自动部分 收集器收集(3mL/Tube)，苯酚-硫酸法跟踪检测，将主峰收集合并，绘制洗脱管数与吸光度 的关系曲线。GPMPA的S印hadex G-100凝胶柱层析洗脱曲线为单一对称峰，表明该样品纯 度较高，如图2所示。
2.光谱分析 紫外光谱取GPMPA适量，去离子水溶解，配制成浓度为lmg/mL的溶液，在 200-400nm范围内扫描。GPMPA的紫外光谱在260nm和280nm处无吸收峰，表明不含核酸和 蛋白质。 红外光谱取GPMPA适量，溴化钾压片，4000-400cm—1区间扫描。IR光谱解析如下 3407 (0-H) ， 2920 (C_H) ， 1638 (C = 0) ， 1452 (C_0) 。 GPMPA在866cm—1处出现吸收峰，是妣喃 环的特征吸收，说明GPMPA是吡喃糖。
3.单糖组成测定 称取20mg固体糖样、10mg盐酸羟胺和5mg内标(肌醇六乙酸酯)，加入2mL吡啶， 放入9(TC水浴中加热反应30min并振荡。取出后冷至室温，加入lmL乙酸酐，在9(TC下继 续反应30min进行乙酰化，反应产物直接进行气相色谱分析。 用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法对9种单糖标准品及GPMPA进行GC分析(安捷 伦6890)，气相色谱分析条件如下 色谱柱石英毛细管柱DB-1701 ;氢火焰离子化检测器(FID);柱温ll(TC， 3min — 20°C /min — 210。C，30min ;气化室温度280。C ;监测器温度280。C ;H2流速:40mL/ min ;空气流速400mL/min ;N2流速1. OmL/min。 气相色谱分析结果如图4所示，对照单糖标准品色谱图(图3)可知，GPMPA由鼠李 糖(9. 9% )、阿拉伯糖(15. 73% )、甘露糖(8. 31% )、葡萄糖(40. 34% )、半乳糖(25. 72% ) 组成。
权利要求
一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法，其特征在于中性多糖的制备由3步实现先自绞股蓝中制备得到粗多糖，然后制得精制多糖，由精制多糖制备得到中性多糖；具体步骤如下步骤1将95％乙醇加入到水分干燥的绞股蓝中，在50±2℃的温度下搅拌1小时，然后过滤收集滤渣；再将滤渣采用95％乙醇在50±2℃回流搅拌1小时后过滤收集滤渣；再将滤渣采用95％乙醇在50±2℃回流搅拌1小时后过滤收集滤渣；将滤渣自然风干后加入6-10倍相对滤渣质量重的蒸馏水，在90-95℃下搅拌10-12h，过滤收集滤液，重复2-3次；将上述每次收集得到的滤液合并，在50℃下抽真空减压浓缩，在流动水中透析48h；步骤2向步骤1得到的透析袋的溶液加入4倍体积的乙醇，在4℃下保存10-12h；然后用高速离心机在5000rpm离心10min，收集其中的沉淀物，依次采用乙醇、丙酮和乙醚进行洗涤，在40-45℃真空干燥6h，得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖；步骤3将粗多糖加双蒸水配成浓度为5％的水溶液，用1mol/L HCl调节pH为5.5，加入粗多糖质量1/20的木瓜蛋白酶在65℃恒温下搅拌3h后加热至100℃终止酶反应；步骤4加入双蒸水将步骤3得到的溶液稀释至0.5％，滴加浓氨水将pH值调至8.0，于50℃边搅拌边逐渐加入30％H2O2，搅拌3～5小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色，停止搅拌在50℃下抽真空减压浓缩；步骤5向步骤4得到的浓缩液加入其体积1/5的sevag试剂，震荡20min，放入高速离心机中在5000rpm离心15min；离心完后收集上清液，再加入其体积1/5sevag试剂，重复5次；将得到的上清液用蒸馏水透析48h，收集透析袋中的溶液，加入其4倍体积的乙醇，在4℃放置10-12h；放入高速离心机中在5000rpm离心10min，离心完后收集沉淀，依次分别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤，冷冻干燥12h，得到白色绞股蓝精制多糖；步骤6将精制绞股蓝多糖1g溶于50mL双蒸水，5000rpm离心15min，取上清，上DEAE-52 cellulose柱，上样量为交换容量的10％～20％；步骤7将上述的离子交换柱依次用双蒸水、0～1mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，收集合并第一流出物的蒸馏水洗脱液，在50℃下减压浓缩，蒸馏水透析48h，冷冻干燥得到绞股蓝中性多糖。
2. 根据权利要求l所述的在绞股蓝中制备中性多糖的方法，其特征在于所述的步骤l 和步骤2采用以下步骤替代步骤1 :取干燥绞股蓝，加6-10倍重量的蒸馏水，在90-95 °C的温度下搅拌于提取 10-12h，2-3次；离心后去残渣，合并前2 3次提取的上清液，浓縮；步骤2 :向步骤1所得的提取液中加入4体积的工业乙醇，4t:放置；离心收集沉淀，依次分别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤，真空干燥，得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖。
全文摘要
本发明涉及一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法，其特征在于中性多糖的制备由3步实现先加入乙醇提取绞股蓝浓缩液真空干燥，得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖；将绞股蓝粗多糖溶于水，加入木瓜蛋白酶反应、离心，收集上清液，透析，加入乙醇沉淀多糖，离心收集多糖，冷冻干燥，得到白色绞股蓝精制多糖；将绞股蓝精制多糖溶于水，上阴离子交换柱，依次用蒸馏水、NaCl溶液梯度洗脱，再上凝胶柱，用NaCl溶液洗脱，收集主峰，经透析后冷冻干燥得到绞股蓝中性多糖GPMPA，它是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的吡喃糖。
文档编号C08B37/00GK101717452SQ20091002391
公开日2010年6月2日 申请日期2009年9月14日 优先权日2009年9月14日
发明者尚晓娅, 徐春兰, 牛卫宁, 钞愈, 钦传光 申请人:西北工业大学