一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法

文档序号:3697113阅读:414来源:国知局
专利名称:一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法
技术领域
本发明涉及一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法,尤其是利用秦巴山区天然资源
的秦巴绞股蓝中草药中提取、分离、纯化一种中性多糖的方法。
背景技术
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Makino)为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本 植物,具有增强免疫、抗肿瘤、降血压、降血脂、抗氧化等作用,且安全无毒。目前,全世界已 知绞股蓝植物有13种,我国占11种,其中7种为我国独有,占全部种数的53. 8% 。绞股蓝 主要分布在亚洲一些国家,在我国应属陕西绞股蓝资源最为丰富,主要分布在以秦巴山区 为中心的37个县市,安康、平利等县市目前已成为我国绞股蓝最大的生产基地,所产绞股 蓝品种最为优良。 近年研究发现绞股蓝多糖是绞股蓝的有效活性成分之一,具有增强免疫、抗肿瘤、 抗氧化、降血糖、抗疲劳等药理作用。目前国内外对绞股蓝多糖的研究普遍停留在粗多糖水 平,主要集中在粗多糖提取和生物活性等方面的研究。中国专利公开号CN1098298A所述 的绞股蓝多糖的提取技术,得到的多糖含有蛋白质、色素等其他成分。中国专利公开号CN 1490338A所用技术,虽然进行了除蛋白处理过程,但是缺少脱色等程序,此方法得到的绞股 蓝多糖也只是粗品,含有大量色素等其他成分。目前尚未分离纯化得到均一的绞股蓝多糖 组分。

发明内容
要解决的技术问题 为了避免现有技术的不足之处,本发明提出一种在绞股蓝中制备中性多糖的方
法,可以制备得到均一的绞股蓝多糖组分。 技术方案 —种在绞股蓝中制备中性多糖的方法,其特征在于中性多糖的制备由3步实现 先自绞股蓝中制备得到粗多糖,然后制得精制多糖,由精制多糖制备得到中性多糖;具体步 骤如下 步骤1 :将95%乙醇加入到水分干燥的绞股蓝中,在50±2°C的温度下搅拌1小 时,然后过滤收集滤渣;再将滤渣采用95%乙醇在50士2t:回流搅拌1小时后过滤收集滤 渣;再将滤渣采用95%乙醇在50士2t:回流搅拌1小时后过滤收集滤渣;将滤渣自然风 干后加入6-10倍相对滤渣质量重的蒸馏水,在90-95 t:下搅拌10-12h,过滤收集滤液,重 复2-3次;将上述每次收集得到的滤液合并,在5(TC下抽真空减压浓縮,在流动水中透析 48h ; 步骤2 :向步骤l得到的透析袋的溶液加入4倍体积的乙醇,在4t:下保存10-12h ; 然后用高速离心机在5000rpm离心10min,收集其中的沉淀物,依次采用乙醇、丙酮和乙醚 进行洗涤,再40-45t:真空干燥6h,得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖;
3
步骤3 :将粗多糖加双蒸水配成浓度为5%的水溶液,用lmol/L HC1调节pH为 5. 5,加入粗多糖质量1/20的木瓜蛋白酶在65t:恒温下搅拌3h后加热至IO(TC终止酶反 应; 步骤4 :加入双蒸水将步骤3得到的溶液稀释至0. 5%,滴加浓氨水将pH值调至 8. 0,于5(TC边搅拌边逐渐加入30% H202,搅拌3 5小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色, 停止搅拌在5(TC下抽真空减压浓縮; 步骤5 :向步骤4得到的浓縮液加入其体积1/5的sevag试剂,震荡20min,放入高 速离心机中在5000rpm离心15min ;离心完后收集上清液,再加入其体积1/5sevag试剂,重 复5次;将得到的上清液用蒸馏水透析48h,收集透析袋中的溶液,加入其4倍体积的乙醇, 在4t:放置10-12h ;放入高速离心机中在5000rpm离心10min,离心完后收集沉淀,依次分 别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤,冷冻干燥12h,得到白色绞股蓝精制多糖;
步骤6 :将精制绞股蓝多糖lg溶于50mL双蒸水,5000rpm离心15min,取上清,上 DEAE-52 cellulose柱,上样量为交换容量的10% 20% ; 步骤7 :将上述的离子交换柱依次用双蒸水、0 lmol/L NaCl溶液线性梯度洗脱, 收集合并第一流出物的蒸馏水洗脱液,在5(TC下减压浓縮,蒸馏水透析48h,冷冻干燥得到 绞股蓝中性多糖。
有益效果 本发明提出的一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法,是一种从绞股蓝中提取、分 离、纯化的中性多糖的制备方法。本发明利用多糖、糖蛋白溶于水的特性,用水提法浸提,并 用乙醇分级沉淀法分离,最后用阴离子交换柱层析和凝胶柱层析纯化多糖。


图1秦巴绞股蓝精制多糖的DEAE-52 cellulose柱层析
图2 GPMPA的S印hadex G-100凝胶柱层析
图3 9种单糖标准品糖腈衍生物GC图
图4 GPMPA糖腈衍生物GC图
具体实施例方式
现结合实施例、附图对本发明作进一步描述
本实施例中采用秦巴绞股蓝制备中性多糖。
实施例1 称取干燥绞股蓝500g,加入2500mL95%乙醇,在50°C的温度下搅拌1小时,然后 过滤收集滤渣;再将滤渣采用95%乙醇在5(TC回流搅拌1小时后过滤收集滤渣;再将滤渣 采用95%乙醇在5(TC回流搅拌1小时后过滤收集滤渣;将滤渣自然风干后加入3000mL的 蒸馏水,在95t:下搅拌10h,过滤收集滤液,重复3次;将上述每次收集得到的滤液合并,在 5(TC下抽真空减压浓縮至1L,在流动水中透析48h ; 向透析后的溶液加入4倍体积的乙醇,在4。C下保存12h ;然后用高速离心机在 5000rpm离心10min,收集其中的沉淀物,依次采用乙醇、丙酮和乙醚进行洗涤,在4(TC真空 干燥6h,得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖;
称取10g秦巴绞股蓝粗多糖,加200mL去离子水配成5X粗多糖溶液,,用lmo1/ LHC1调节pH为5. 5,加入0. 5g木瓜蛋白酶,65。C恒温搅拌3h后加热至IO(TC,保持6min, 灭活,终止酶反应; 加入1800mL双蒸水将溶液稀释至0. 5% ,滴加浓氨水将pH值调至8. 0,于5(TC边 搅拌边逐渐加入30% 11202,搅拌3小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色,停止搅拌,用醋酸 调节pH值至7. O,在5(TC下抽真空减压浓縮至500mL ; 向浓縮液加入100mL sevag试剂,震荡20min,放入高速离心机中在5000rpm离心 15min ;离心完后收集上清液,再加入其体积1/5 sevag试剂,重复5次;将得到的上清液用 蒸馏水透析48h,收集透析袋中的溶液,加入其4倍体积的乙醇,在4t:放置12h ;放入高速 离心机中在5000rpm离心10min,离心完后收集沉淀,依次分别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤,冷 冻干燥12h,得到白色绞股蓝精制多糖; 将精制绞股蓝多糖lg溶于50mL双蒸水,5000rpm离心15min,取上清,上DEAE-52 cellulose柱,上样量为交换容量的10% 20% ; 将上述的离子交换柱依次用双蒸水、0 lmol/L NaCl溶液线性梯度洗脱,收集合
并第一流出物的蒸馏水洗脱液,在5(TC下减压浓縮,蒸馏水透析48h,冷冻干燥得到绞股蓝
中性多糖。 实施例2 称取干燥绞股蓝20kg,加入120L蒸馏水,投入提取罐中,在95。C下搅拌10h,过滤 收集滤液,重复2次;将上述每次收集得到的滤液合并,在50°C下抽真空减压浓縮至40L,在 流动水中透析48h ; 向透析后的溶液加入4倍体积的工业乙醇,在fC下保存10h ;然后用高速离心机 在5000rpm离心10min,收集其中的沉淀物,依次采用乙醇、丙酮和乙醚进行洗涤,在45°C真 空干燥6h,得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖; 称取10g秦巴绞股蓝粗多糖,加200mL去离子水配成5X粗多糖溶液,用lmo1/ LHC1调节pH为5. 5,加入0. 5g木瓜蛋白酶,65。C恒温搅拌3h后加热至IO(TC,保持6min, 灭活,终止酶反应; 加入1800mL双蒸水将溶液稀释至0. 5% ,滴加浓氨水将pH值调至8. 0,于5(TC边 搅拌边逐渐加入30% 11202,搅拌3小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色,停止搅拌,用醋酸 调节pH值至7. O,在5(TC下抽真空减压浓縮至500mL ; 向浓縮液加入100mL sevag试剂,震荡20min,放入高速离心机中在5000rpm离心 15min ;离心完后收集上清液,再加入其体积1/5 sevag试剂,重复5次;将得到的上清液用 蒸馏水透析48h,收集透析袋中的溶液,加入其4倍体积的乙醇,在4t:放置12h ;放入高速 离心机中在5000rpm离心10min,离心完后收集沉淀,依次分别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤,冷 冻干燥12h,得到白色绞股蓝精制多糖; 将精制绞股蓝多糖lg溶于50mL双蒸水,5000rpm离心15min,取上清,上DEAE-52 cellulose柱,上样量为交换容量的10% 20% ; 将上述的离子交换柱依次用双蒸水、0 lmol/L NaCl溶液线性梯度洗脱,收集合 并第一流出物的蒸馏水洗脱液,在5(TC下减压浓縮,蒸馏水透析48h,冷冻干燥得到得到本 发明的秦巴绞股蓝中性多糖GPMPA,如图l所示。
5
实施例制备的秦巴绞股蓝中性多糖GPMPA的理化性质
1.纯度测定 S印hadex G-100填料在IO(TC溶胀5h后,用1. 0mol/L NaoH溶液处理,以蒸馏水 洗至中性后装柱(柱尺寸为1.6cmX50cm)。装柱后用蒸馏水平衡48h。将GPMPA 50mg溶 于5mL双蒸水,离心,取上清,过柱,用0. lmol/L NaCl溶液洗脱,流速O. 5mL/min,自动部分 收集器收集(3mL/Tube),苯酚-硫酸法跟踪检测,将主峰收集合并,绘制洗脱管数与吸光度 的关系曲线。GPMPA的S印hadex G-100凝胶柱层析洗脱曲线为单一对称峰,表明该样品纯 度较高,如图2所示。
2.光谱分析 紫外光谱取GPMPA适量,去离子水溶解,配制成浓度为lmg/mL的溶液,在 200-400nm范围内扫描。GPMPA的紫外光谱在260nm和280nm处无吸收峰,表明不含核酸和 蛋白质。 红外光谱取GPMPA适量,溴化钾压片,4000-400cm—1区间扫描。IR光谱解析如下 3407 (0-H) , 2920 (C_H) , 1638 (C = 0) , 1452 (C_0) 。 GPMPA在866cm—1处出现吸收峰,是妣喃 环的特征吸收,说明GPMPA是吡喃糖。
3.单糖组成测定 称取20mg固体糖样、10mg盐酸羟胺和5mg内标(肌醇六乙酸酯),加入2mL吡啶, 放入9(TC水浴中加热反应30min并振荡。取出后冷至室温,加入lmL乙酸酐,在9(TC下继 续反应30min进行乙酰化,反应产物直接进行气相色谱分析。 用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法对9种单糖标准品及GPMPA进行GC分析(安捷 伦6890),气相色谱分析条件如下 色谱柱石英毛细管柱DB-1701 ;氢火焰离子化检测器(FID);柱温ll(TC, 3min — 20°C /min — 210。C,30min ;气化室温度280。C ;监测器温度280。C ;H2流速:40mL/ min ;空气流速400mL/min ;N2流速1. OmL/min。 气相色谱分析结果如图4所示,对照单糖标准品色谱图(图3)可知,GPMPA由鼠李 糖(9. 9% )、阿拉伯糖(15. 73% )、甘露糖(8. 31% )、葡萄糖(40. 34% )、半乳糖(25. 72% ) 组成。
权利要求
一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法,其特征在于中性多糖的制备由3步实现先自绞股蓝中制备得到粗多糖,然后制得精制多糖,由精制多糖制备得到中性多糖;具体步骤如下步骤1将95%乙醇加入到水分干燥的绞股蓝中,在50±2℃的温度下搅拌1小时,然后过滤收集滤渣;再将滤渣采用95%乙醇在50±2℃回流搅拌1小时后过滤收集滤渣;再将滤渣采用95%乙醇在50±2℃回流搅拌1小时后过滤收集滤渣;将滤渣自然风干后加入6-10倍相对滤渣质量重的蒸馏水,在90-95℃下搅拌10-12h,过滤收集滤液,重复2-3次;将上述每次收集得到的滤液合并,在50℃下抽真空减压浓缩,在流动水中透析48h;步骤2向步骤1得到的透析袋的溶液加入4倍体积的乙醇,在4℃下保存10-12h;然后用高速离心机在5000rpm离心10min,收集其中的沉淀物,依次采用乙醇、丙酮和乙醚进行洗涤,在40-45℃真空干燥6h,得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖;步骤3将粗多糖加双蒸水配成浓度为5%的水溶液,用1mol/L HCl调节pH为5.5,加入粗多糖质量1/20的木瓜蛋白酶在65℃恒温下搅拌3h后加热至100℃终止酶反应;步骤4加入双蒸水将步骤3得到的溶液稀释至0.5%,滴加浓氨水将pH值调至8.0,于50℃边搅拌边逐渐加入30%H2O2,搅拌3~5小时至溶液颜色变为较透明的淡黄色,停止搅拌在50℃下抽真空减压浓缩;步骤5向步骤4得到的浓缩液加入其体积1/5的sevag试剂,震荡20min,放入高速离心机中在5000rpm离心15min;离心完后收集上清液,再加入其体积1/5sevag试剂,重复5次;将得到的上清液用蒸馏水透析48h,收集透析袋中的溶液,加入其4倍体积的乙醇,在4℃放置10-12h;放入高速离心机中在5000rpm离心10min,离心完后收集沉淀,依次分别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤,冷冻干燥12h,得到白色绞股蓝精制多糖;步骤6将精制绞股蓝多糖1g溶于50mL双蒸水,5000rpm离心15min,取上清,上DEAE-52 cellulose柱,上样量为交换容量的10%~20%;步骤7将上述的离子交换柱依次用双蒸水、0~1mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱,收集合并第一流出物的蒸馏水洗脱液,在50℃下减压浓缩,蒸馏水透析48h,冷冻干燥得到绞股蓝中性多糖。
2. 根据权利要求l所述的在绞股蓝中制备中性多糖的方法,其特征在于所述的步骤l 和步骤2采用以下步骤替代步骤1 :取干燥绞股蓝,加6-10倍重量的蒸馏水,在90-95 °C的温度下搅拌于提取 10-12h,2-3次;离心后去残渣,合并前2 3次提取的上清液,浓縮;步骤2 :向步骤1所得的提取液中加入4体积的工业乙醇,4t:放置;离心收集沉淀,依次分别用乙醇、丙酮和乙醚洗涤,真空干燥,得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖。
全文摘要
本发明涉及一种在绞股蓝中制备中性多糖的方法,其特征在于中性多糖的制备由3步实现先加入乙醇提取绞股蓝浓缩液真空干燥,得到棕褐色秦巴绞股蓝粗多糖;将绞股蓝粗多糖溶于水,加入木瓜蛋白酶反应、离心,收集上清液,透析,加入乙醇沉淀多糖,离心收集多糖,冷冻干燥,得到白色绞股蓝精制多糖;将绞股蓝精制多糖溶于水,上阴离子交换柱,依次用蒸馏水、NaCl溶液梯度洗脱,再上凝胶柱,用NaCl溶液洗脱,收集主峰,经透析后冷冻干燥得到绞股蓝中性多糖GPMPA,它是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的吡喃糖。
文档编号C08B37/00GK101717452SQ20091002391
公开日2010年6月2日 申请日期2009年9月14日 优先权日2009年9月14日
发明者尚晓娅, 徐春兰, 牛卫宁, 钞愈, 钦传光 申请人:西北工业大学
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1