蛇莓多糖及其制备方法和用途的制作方法

专利名称：蛇莓多糖及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从植物中提取的多糖，该多糖的制备方法和用途，属于生物制 药领域。
背景技术：
水痘带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus,简称VZV )属于疱疹病毒科， a疱渗病毒亚科，水痘病毒属，其基因组序列与同属于a疱瘆病毒亚科的单纯 疱疹病毒1型(Herpes Simplex Virus 1， HSV-1 )及单纯疱疹病毒2型(Herpes Simplex Virus 2, HSV-2 )极为相近。水痘-带状疱瘆病毒(VZV)为DNA双链病 毒，长度约为125000个碱基对，可以引起水痘和带状疱渗两种疾病。其原发感 染为水痘，潜伏再度激活则引起带状疱疹。水痘大多见于1-10岁的儿童，潜 伏期在2-3周，起病较急，会出现发热、头痛、全身倦怠等前驱症状。水痘 病变主要在表皮棘细胞，个别病例病变可累及肺、食管、胃、小肠、肝、肾 上腺、胰等处，引起局部充血、出血、炎细胞侵润及局灶性坏死。带状疱瘆 多发于成年人和老年人，成因是水痘-带状疱疹病毒(VZV)原发感染后病毒进 入皮肤的感觉神经末梢，持久地潜伏于脊髓神经后根或脑神经节的神经元中。 在多种诱发因素刺激的作用下，如发热、恶性肿瘤、使用免疫抑制剂、外伤、 过劳等，神经节内的病毒可被激活，沿周围神经波及皮肤，诱发带状疱瘆(Herpes Zoster, HZ)，且伴随后遗神经痛(Postherpetic neuralgia, PHN)。
疱疹净(Idoxuridine， IDU)是第一个进行临床治疗带状疱疹(HZ)的有 效抗病毒药物，为胸腺嘧啶核苷的结构类似物，在细胞内可以置换病毒DNA中 胸腺嘧嚏核苷，形成异常核酸而抑制水痘-带状疱麥病毒复制。阿糖胞苷 (Cytarabine)、阿糖腺苷(Vidarabine )也被用于疱疹病毒的治疗。以上三种药物早期曾被用于疱疹病毒的治疗，因受到高毒低活性的局限，目前已经被阿
昔洛韦(Aciclovir，ACV)替代，阿昔洛韦是治疗此种疾病的首选药物，但是它
生物利用度低，长期使用可引起皮炎，并可造成耐药性。因此，又陆续发展出
了一系列与阿昔洛韦抗病毒机制相近的药物，其作用机制均是通过病毒DNA编 码的胸苷激酶(Thymidine kinase, TK)被磷酸化为含磷酸基的活性分子，进 一步通过宿主细胞内细胞激酶(Cellular kinase)作用而生成二磷酸活性分子 及三磷酸活性分子。三磷酸活性分子通过与病毒DM聚合酶的底物dGTP竟争， 从而终止病毒DNA的合成，可竞争性抑制病毒DNA聚合酶，阻断DAN合成、病 毒复制。此类药物中抗带状疱渗病毒的代表药物有喷昔洛韦(Penciclovir， PCV)、泛昔洛韦(Famciclovir, FCV)、昔多福韦(Cidofovir)。尽管这些药物 作为抗病毒药已广泛应用于临床,但是受药物副作用的影响以及病毒抗药株的 出现，急需研制新型的、毒副作用低且高效的抗病毒药物。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供一种从植物中提取的、具 有抗水痘带状疱瘆病毒活性的多糖，该多糖安全、无毒、对病毒表现出明显的 抑制作用，可以作为抗水痘带状疱疹病毒的候选药物。
本发明涉及的植物是蛇莓Duchesnea indica (Andr.) Focke，为蔷薇科蛇莓 属植物，又名地莓、三叶莓、野杨梅等，药用干燥全草，或鲜用。民间用以治 疗带状疱疹、白喉、肠炎、痢疾、烫伤等。《本草纲目》记载"此物就地引 细蔓，节节生根，每枝三叶，叶有齿刻，四五月开小黄花，五出，结实鲜红， 状似复盆，而面与蒂则不同也，其根甚细。"《属本草》、《本草衍义》、《植 物名实图考》等传统医药书籍中均有记载。蛇莓适应力强，在我国辽宁以南地 区广泛分布。蛇莓性耐寒，喜生于阴湿环境，常生于沟边潮湿草地。对土壤要求不严。蛇莓全草多缠绕成团，被白色毛茸，具匍匐茎，叶互生。三出复叶，
基生叶的叶柄长6-10cm,小叶多鮍缩，完整者倒卵形，长l. 5-4cm,宽l-3cm， 基部偏斜，边缘有钝齿，表面黄绿色，上面近无毛，下面被疏毛。花单生于叶 腋，具长柄。聚合果棕红色，痩果小，花萼宿存。气微，味微涩。显微鉴定 叶表面观上表皮细胞类多角形，下表皮细胞略波状弯曲，垂周壁念珠状增厚。 下表皮非腺毛及腺毛较上表皮为多，非腺毛单细胞，长166-900 pm，基部直径 18-38 jum，壁厚6-12um,表面有螺状紋理；腺毛头部2细胞，直径25-32 jum; 柄部2-3细胞。气孔不定式或不等式，副卫细胞4-5个。叶肉细胞有的含草酸 钙簇晶。蛇莓全草外敷或取汁外涂，治疗带状疱疹的效果比阿昔洛韦或聚肌胞 注射液更为显著(芦启兴《蛇莓治疗带状疱瘆疗效观察》)。
本发明所提供的多糖来源于蛇莓，以中药蛇莓为原料，水洛9-12小时后回 收提取液；将所得提取液在2000-8G00rpm下离心8-12min后去除沉淀，减压浓 缩，以75%醇浓度醇沉，得到蛇莓多糖，命名为DIP。 一种存在于蛇莓多糖DIP 中的中性多糖，是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖构成， 命名为DIPn其制备方法包括如下步骤
(1) 将所述蛇莓多糖DIP用水配成1%~20%溶液，离心去杂质，按DIP溶液 氯仿正丁醇(V/V) 10~50:5:1进行萃取，振摇，静置分层，保留水 相层，重复操作2-10次；
(2) 减压浓缩上层水相溶液，醇沉，去除沉淀后干燥得脱蛋白后的蛇莓多糖 DIP;
(3) 称取脱蛋白后蛇莓多糖DIP，用水配成0.5~5%溶液，离心去杂质，离 子交换柱层析，恒流上样，结東后，用水洗脱，洗至苯酚-硫酸法检测 无阳性反应后，收集洗脱液；(4 )将所述步骤(3 )中的洗脱液减压浓缩至原来体积的1/2 ~ 1/15,加入2 ~ 6倍体积无水乙醇，室温静置2-24h，倾出上清液，离心，沉淀加无水 乙醇洗涤脱水，离心，重复上述过程2次，加热干燥，得到中性多糖 DIP"
一种存在于蛇莓多糖DIP中的酸性多糖，是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖 醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖构成，命名 为DIP"其制备方法包括如下步骤
(1) 将所述蛇莓多糖DIP用水配成1% ~ 20%溶液，离心去杂质，按DIP溶液 氯仿正丁醇(V/V) 10~50:5:1进行萃取，振摇，静置分层，保留水 相层，重复搡作2 10次；
(2) 减压浓缩上层水相溶液，醇沉，去除沉淀后千燥得脱蛋白后的蛇莓多 糖DIP;
(3) 称取脱蛋白后蛇莓多糖DIP,用水配成0. 5~5%溶液，离心去杂质，离
子交换柱层析，恒流上样，结東后，用水洗脱，洗至苯酚-硫酸法检测 无阳性反应后，用0-2.0 mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，按洗脱曲 线收集糖集中部分，将收集的组分减压浓缩至原来体积的1/2-1/15， 过滤，除中性盐后得到洗脱液；
H)将所述步骤(3)中的洗脱液减压浓缩至原来体积的1/2-1/15,加入 2-6倍体积无水乙醇，室温静置2 24h，倾出上清液，离心，沉淀加 无水乙醇洗涤脱水，离心，重复上述过程2次，加热干燥，得到酸性 多糖DIP2。
一种存在于酸性多糖DIP2中的活性单体成分多糖，其结构为含有甘露糖、 鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、磷酸基和氨基的酸性杂多糖，命名为DIP3。，分子量为198万，其制备方法包括如下步骤
(1) 称取中药蛇莓，将其溶于5-25倍体积水中，水洛3 6小时后回收提 取液，过滤后得滤液，另将滤渣溶于5~25倍体积、pH7~13的NaOH 溶液中，继续加热水洛3 6小时，过滤后得滤液；混合上述两次滤液 得水煮提取液；
(2) 将所述水煮提取液浓縮至原体积的1/2-1/15,冷却后离心去除沉淀， 上清溶液加入乙醇，使乙醇终浓度为0%~50%,得到活性单体成分多糖 DIP3。粗品；
(3) 将活性单体成分多糖DIP3。粗品配成5~20mg/ml水溶液，加入活化后的 碱性阴离子交换树脂脱色，树脂用量控制在溶液体积的5~20倍，加热 振摇，去除色素后水溶液浓缩，醇沉，过夜，醇沉产物用无水乙醇洗涤 加离心反复3次，加热烘干，得到除色素后的DIP3。；
(4) 称取除色素后的DIP3。，用水配成0. 5~5%溶液，离心去杂质，离子交换 柱层析，恒流上样，结東后，用水洗脱，洗至苯酚-硫酸法检测无阳性 反应后，用0~2. Omol/LNaCl溶液线性梯度洗脱，按洗脱曲线收集糖 集中部分，将收集的组分减压浓缩至原体积的1/2 ~ 1/15，过滤，除中 性盐；
(5) 将经过离子交换柱层析的DlP3a进行分子筛柱层析，分部收集，用硫酸
苯酴法检测，合并糖峰主要部分，冷冻干燥，得到DIP3。精品。
一种存在于酸性多糖DIP2中的活性单体成分多糖，其结构为含有鼠李糖、 葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、磷酸基和氨基的酸性杂多糖，命名为DIP6。， 分子量为3.4万，其制备方法，包括如下步骤(1) 称取中药蛇莓，将其溶于5 25倍体积水中，水浴3 6小时后回收提 取液，过滤后得滤液，另将滤渣溶于5~25倍体积、pH7~13的NaOH 溶液中，继续加热水洛3 6小时，过滤后得滤液；混合上述两次滤液 得水煮提取液；
(2) 将所述水煮提取液浓缩至原体积的1/2-1/15，冷却后离心去除沉淀， 上清溶液加入乙醇，使乙醇终浓度为50%~90%，得到活性单体成分多 糖DIP6。粗品；
(3) 将活性单体成分多糖DIPm粗品配成5 ~ 20mg/ml水溶液，加入活化后的 碱性阴离子交换树脂脱色，树脂用量控制在溶液体积的5~20倍，去除 色素后水溶液浓缩，醇沉，过夜，醇沉产物用无水乙醇洗涤加离心反复 3次，加热烘干，得到除色素后的DIPm;
(4) 称取除色素后的DIP6。，用水配成O. 5~5%溶液，离心去杂质，离子交换 柱层析，恒流上样，结東后，用水洗脱，洗至苯酚-硫酸法检测无阳性 反应后，用0~2. Omol/LNaCl溶液线性梯度洗脱，按洗脱曲线收集糖 集中部分，将收集的组分减压浓缩至原体积的1/2-1/15,过滤，除中
性盐；
(5) 将经过离子交换柱层析的DIPw进行分子筛柱层析，分部收集，用硫酸 苯酚法检测，合并糖峰主要部分，冷冻干燥，得到DIPm精品。
同时，对上述的多糖DIPm和多糖DIP6。的纯度和分子量采用高效液相色谱(HPLC) 检测。选取Agilent高效液相层析系统，色谱柱为Shodex公司KS-805柱，示 差折光检测器检测，分析软件为Agilent Data Analysis,流动相为乐百氏纯净 水，柱温10 50。C，流速0. 1~ 3. Oml/min,最大柱压20 ~ 10Qbar。称取适量标 准糖TIO、 T40、 T70、 T500、 T2000,配成0. 01 ~ 20mg/ml的样品，每个样品进
li样20 200ul，根据标准糖分子量的对数为纵坐标，出峰时间为横坐标做标准曲 线。称取适量DIP3。、DIP6。，配成0. 01~20mg/ml的样品，每个样品进样20 ~ 200ul ，
根据出峰情况判断待测样品的纯度，同时将出峰时间带入标准曲线，计算分子 量。对上述制得的多糖DIPi，多糖DIP2，多糖DIPn和多糖DIP6。结构的鉴定是应 用1-苯基-3-甲基吡唑啉啁(PMP)柱前衍生化高效液相色谱法、核磁共振氢谱 。H画R)、核磁共振碳谱(13C NMR)、红外光谱(IR)、紫外(UV)及甲基化分
析得出。
本发明的另一个目的是提供以上蛇莓多糖在制备抗水痘-带状疱疹病毒的
药物中的用途。通过建立水痘-带状疱疹病毒(vzv)感染人胚肺成纤维细胞
(HELF)的模型，由多糖抑制水痘带状疱瘆病毒(VZV)感染的实验结果表明， 本发明对水痘-带状疱疹病毒(VZV)活性有明显抑制作用。与传统的抗病毒药物 阿昔洛韦(ACV)相比，DIP,DIP!,DIP2,DIP3。和DIP6。半效浓度ECs。更低，抗带状 疱渗病毒(VZV)活性更强。
本发明的来源是蔷薇科的蛇莓属植物蛇莓，该植物易繁殖，适应生长地域 广泛，栽培技术简单，因此，植物来源丰富。本发明利用生物技术从蛇莓全草 中提取分离出具有明显抗带状疱疹病毒活性的总多糖DIP、总多糖DIP其中的中 性多糖DIP!和酸性多糖DIP2、以及酸性多糖DIP2中两种主要活性单体成分多糖 DIP3。和多糖DIPm,方法便于操作，安全、无毒、对病毒表现出明显的抑制作用， 可以作为活性成分添加进抗水痘带状疱瘆病毒药物中，是优质的抗病毒候选药 物。


图1为多糖DIP3。的HPLC谱图。 图2为多糖DIPe。的HPLC谱图。
12图3为多糖DIP3。的紫外(UV)谱图。
图4为多糖DIP6。的紫外0JV)谱图。 图5为多糖DIP3。的红外(IR)谱图 图6为多糖DIP3。的红外(IR)谱图。 图7为多糖DIP3。的'H蘭R谱图。 图8为多糖DIP3。的'H丽R谱图。 图9为多糖DIP3。的"CNMR谱图。 图IO为多糖Dm。的13CNMR谱图。
图11为多糖DIP,的PMP柱前衍生化高效液相色谱法谱图。 图12为多糖DIP2的PMP柱前衍生化高效液相色谱法谱图。 图13为多糖DIP3。的PMP柱前衍生化高效液相色谱法谱图。 图14为多糖DIP3。的PMP柱前衍生化髙效液相色谱法谱图。 图15为多糖DIP, DIP!, DIP2, DIP3。， DIP。。与ACV比较的ECs。和TI。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
制备并鉴定蛇莓多糖DIP:
将干燥并粉碎的蛇莓全草用水溶胀过夜后，10(TC水浴10小时，每lh搅拌一 次，回收提取液，6000rpm离心10min去除沉淀，减压浓缩，75%醇浓度醇沉，得 DIP。细胞病变抑制实验(详细方法请参照实施例八)证明DIP即为抗病毒活性 物质。釆用a-萘酚-硫酸显色反应，鉴定所得溶液呈橙色，为多糖特征反应， 证明所得的主要成分为多糖。
实施例二制备蛇莓多糖中的中性多糖DIP,:
将蛇莓多糖DIP用水配成1%溶液，离心去杂质，按DIP溶液氯仿正丁 醇(V/V) 25:5:1进行萃取，振摇10min，静置分层，保留水相层，重复操作5 次。减压浓缩上层水相溶液，醇沉。用DEAE-52离子交换柱以IO倍水浸泡溶涨 过夜，换水漂洗1 2次，然后依次用0, 5mol/L HC1、 0. 5mol/L NaOH、 0. 5mol/L HC1活化，真空脱气，装柱平衡。称取脱蛋白后的DIP,用水配成O. 5%溶液，离 心去杂质，用恒流泵上样，上样流速为lml/min。上样结東后，用水洗脱，洗至 苯酚-硫酸法检测无阳性反应后，收集水洗脱液，减压浓缩至原来体积的1/10, 加入3倍体积无水乙醇，室温静置8h。倾出上清液，液固部分以8000rpm离心 lOmin,沉淀加无水乙醇洗涤脱水，800Grpm离心10min，重复上述过程2次， 6(TC真空干燥8h,得到中性多糖DIP,。
实施例三
制备蛇莓多糖中的酸性多糖DIP2:
将蛇莓多糖DIP用水配成1%溶液，离心去杂质，按DIP溶液氯仿正丁 醇(V/V) 25:5:1进行萃取，振摇10min,静置分层，保留水相层，重复操作5 次。减压浓缩上层水相溶液，醇沉。用DEAE-52离子交换柱以IO倍水浸泡溶涨 过夜，换水漂洗1 2次，然后依次用0.5fflol/LHCl、 0. 5raol/LNa0H、 0. 5mol/L HC1活化，真空脱气，装柱平衡。称取脱蛋白后的DIP适量，用水配成0.5%溶 液，离心去杂质，用恒流泵上样，上样流速为lml/min。上样结東后，用水洗脱， 洗至苯酴-硫酸法检测无阳性反应后，用0-2. Omol/LNaCl溶液线性梯度洗脱， 自动部分收集器分管收集，3ml/管，控制滴速0.5ml/min。按洗脱曲线收集糖集 中部分，将收集的组分减压浓缩至原来体积的1/10,过滤，透析。透析过的溶 液减压浓缩至原来体积的1/10，加入3倍体积无水乙醇，室温静置8h。倾出上清液，液固部分8000rpm离心10min,沉淀加无水乙醇洗涤脱水，8000rpm离 心10min,重复上述过程2次，6(TC真空干燥8h,得到酸性多糖DIP2。
实施例四
制备多糖DIP2中的酸性杂多糖DIP3。
称取蛇莓全草lOOg溶于1500ml水中，85°C水浴中搅拌加热3h，纱布过滤， 得滤液。另精确调pH9的NaOH溶液1500ml继续85'C水洛中浸泡搅拌加热3h, 过滤溶渣最后共得水煮提取液。将水煮提取液浓縮至1/1G,冷却后有不溶物用 4000rpm离心10min，上清溶液加入乙醇，使乙醇终浓度为30%，得DIPm粗品。 DIP3。粗品配成5mg/ml水溶液，分别加入活化后的弱碱性阴离子交换树脂 (D311,D301R, 96C， 330,D318,900，717)，每100ml溶液中加入8g树脂，摇床 220r/m震摇8h，温度为3(TC。去除色素后水溶液浓缩，醇沉，过夜。然后将脱 色后的醇沉产物用无水乙醇洗涤，8000rpm离心10min,洗涤加离心反复3次， 烘箱烘干，得除色素后DIP3。粗品。用DEAE-52离子交换柱以IO倍水浸泡溶涨过 夜，换水漂洗1 ~ 2次，然后依次用0. 5raol/L HC1、 0. 5mol/L NaOH、 0. 5mol/L HC1 活化处理，真空脱气，装柱平衡。称取DIP3。粗品适量，用水配成2.5%溶液，离 心去杂质，用恒流泵上样，上样流速为lmi/min。上样结束后，用水洗脱，洗至 苯酚-硫酸法检测无阳性反应后，用0~2. 0 mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，自 动部分收集器分部收集，3ml/管，控制滴速0.5ml/min。按洗脱曲线收集糖集中 部分，将收集的组分减压浓縮至原来体积的1/10,过滤。浓縮液上SEPHADEXG25 填料，水洗脱，流速为0. 5ml/min，3ral/管，用苯酚硫酸法测定糖峰的起始，用 AgNO"容液测定NaCl的出峰管数，收集糖峰部分。将分子筛填料(Sephacryl-300, S印hacry1-400， SEPHADEX G-200, SEPHADEX G-300 )溶涨过夜，与pH13的NaOH 溶液(V: V )1: 1混合，撹匀放置lh,用蒸馏水洗至中性，装柱备用。将经过DEAE-52离子交换柱分离的DIP3。进行分子筛柱层析，分部收集，硫酸苯酚法检测，合并 糖峰主要部分，冷冻干燥，得到酸性杂多糖DIP3。精品。
实施例五
制备多糖DIP2中的酸性杂多糖DIP6。
称取蛇莓全草100g溶于1500ml水中，85°C水浴中搅拌加热3h，纱布过 滤，得滤液。另精确调PH9的NaOH溶液1500ml继续85。C水浴中浸泡搅拌加热 3h,过滤溶渣最后共得水煮提取液。将水煮提取液浓缩至1/10，冷却后有不溶 物，4000rpm离心10min,上清溶液依次加入乙醇，使乙醇终浓度为60%,得DIP6。 粗品。DIP6。粗品配成5mg/ml水溶液，分别加入活化后的弱碱性阴离子交换树脂 (D311,D301R, 96C， 330，D318，900，717)，每100ml溶液中加入8g树脂，摇床 220r/m震摇8h，温度为3(TC。去除色素后水溶液浓缩，醇沉，过夜。然后将脱 色后的醇沉产物用无水乙醇洗涤，8000rpm离心10min，洗涤加离心反复3次， 烘箱烘干，得除色素后DIP60。 DEAE-52离子交换柱以数十倍水浸泡溶涨过夜， 中途换水漂洗1 ~ 2次，然后依次用0. 5mol/L HC1、 0. 5mol/L NaOH、 0. 5mol/L HC1 活化处理，真空脱气，装柱平衡。称取DIP6。粗品适量，用水配成2.5%溶液，离 心去杂质，用恒流泵上样，上样流速为lml/min。上样结束后，用水洗脱，洗至 苯酴-硫酸法检测无阳性反应后，用0-2.0 mol/LNaCl溶液线性梯度洗脱，自 动部分收集器分部收集，3ml/管，控制滴速O. 5ml/min。按洗脱曲线收集糖集中 部分，将收集的组分减压浓缩至原来体积的1/10，过滤。浓缩液上SEPHADEXG25 填料，水洗脱，流速为0.5ml/min，3ml/管，用苯酚硫酸法测定糖峰的起始，用 AgN03溶液测定NaCl的出峰管数，收集糖峰部分。将分子筛填料(Sephacry1-300， S印hacryl-400， SEPHADEX G-200, SEPHADEX G-300 )溶涨过夜，与pH13的NaOH 溶液(V:V) 1:1混合，搅句放置lh,用蒸馏水洗至中性，装柱备用。将经过离
16子交换柱(DEAE-52)分离的DIP6。进行分子筛柱层析，分部收集，硫酸苯酚法检 测，合并糖峰主要部分，冷冻干燥，得到酸性杂多糖DIP6。精品。
实施例六
检测多糖DIP3。和多糖DIPw的纯度和分子量
对上述的多糖DIP3 和多糖DIP6。的纯度和分子量采用高效液相色谱(HPLC ) 检测。称取DIP;。、DIP6。，配成10nig/ml的样品，每个样品进样25ul，选取Agilent 髙效液相层析系统，色谱柱为Shodex公司KS-805柱，示差折光检测器检测， 分析软件为Agilent Data Analysis,流动相为乐百氏纯净水，柱温30'C，流速 LOml/min，最大柱压50bar。根据出峰情况判断待测样品的纯度，同时将出峰 时间带入标准曲线，计算分子量。计算后得DIP3。的分子量为198万，见图l; DIPw的分子量为3. 4万，见图2。 实施例七
检测所得多糖的结构
取多糖DIP3。，多糖DIP6 ，各3ml,配制成0. 1%溶液，紫外下全波长扫描(见 图3，图4)。取多糖DIPm，多糖DIP,各3mg,加溴化钾压片，Nicolet Impact 410红外光谱仪下扫描，见图5和图6。吸取100ul的浓度为4~5mg/ml的多糖 DIPi、多糖DIP,、多糖DIP3。和多糖DIPw样品溶液于具塞刻度试管中，通过1-苯基-3-甲基吡唑啉啁(PMP)柱前衍生，采用反相高效液相色谱/紫外检测器分 离检测。取多糖DIP3。，多糖DIP6。，各50mg，溶于氘代水(020)， 3(TC于Varian300 兆核磁共振仪上分析。DIP3。的核磁共振氢谱('HNMR)、核磁共振碳谱(13CNMR) 见图7和图8; DIPw的核磁共振氢谱('HNMR)、核磁共振碳谱(13C NMR )见图9 和图IO。检测结果多糖DIP,为含甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿 拉伯糖的中性多糖，见图ll。多糖DIP2为含甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半说明书第13/13页
乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖的酸性多糖，见图12。 DIP3。的结构为含甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和磷酸基、氨 基的酸性杂多糖，见图13。 DIP6。的结构为含鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、 半乳糖和磷酸基、氨基的酸性杂多糖，见图14。 实施例八
待96孔板中的人胚肺成纤维细胞(Human Embryo Lung Fibroblast, HELP) 长成单层后，每孔加入100TCID5。的水痘-带状疱瘆病毒(Varicella-Zoster Virus，VZV)液，感染l小时后，弃去病毒液。每块细胞板每孔分别加入蛇莓多 糖DIP，中性多糖DIPi，酸性多糖DIP2，酸性多糖DIP3。，酸性多糖DIP6。溶液，以 药物最大无毒浓度为最高浓度，用无血清MEM培养基对样品溶液做连续的2倍 稀释，每个稀释度3孔；同时设置阳性(ACV)、阴性对照。将96孔板于37'C二 氧化碳细胞培养箱中培养，每日记录细胞病变(Cytopathic effect, CPE)程 度，按Reed-Muench公式计算各样品的药物安全指标EC5。及治疗指数TI(T士S， n=3)。结果见表l。由此得出蛇莓多糖DIP、 DIP,、 DIP2、 DIPs。和DIPm抗水痘 -带状疱疹病毒(VZV)的药效优于传统抗病毒药物阿昔洛韦(Aciclovir,ACV)， 同时DIP2、 DIP3。和DIP6。的治疗指数(TI)高于阿昔洛韦(ACV)。
ACVDIPDIP,DIP2DIP30DIP60
￡C5。 (ug/ml) TI13,76±0.76 25.665.69±0.50 23.385.35±0.31 21.774.78±0.39 52.112.71±0.32 183.463.66±0.62 118.76
表l.多糖DIP、 DIP、DIP2、 DIP3。、 DIP6。和ACV的ECs。和TI对照
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效 变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
权利要求
1. 蛇莓多糖，是由以下方法制备得到以中药蛇莓为原料，水浴9～12小时后回收提取液；将所得提取液在2000～8000rpm下离心8～12min后去除沉淀，减压浓缩，以75％醇浓度醇沉，得到蛇莓多糖，命名为DIP。
2. 根据权利要求1所述的蛇莓多糖中的中性多糖，是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖构成，命名为DIP"
3. 根据权利要求2所述的中性多糖的制备方法，包括如下步骤(1) 将所述蛇莓多糖DIP用水配成1%~20%溶液，离心去杂质，按DIP溶液氯仿正丁醇(V/V) 10-50:5:1进行萃取，振摇，静置分层，保留水相层，重复搡作2 10次；(2) 减压浓缩上层水相溶液，醇沉，去除沉淀后干燥得脱蛋白后的蛇莓多糖DIP;(3) 称取脱蛋白后蛇莓多糖DIP,用水配成0. 5~5%溶液，离心去杂质，离子交换柱层析，恒流上样，结束后，用水洗脱，洗至苯酚-硫酸法检测无阳性反应后，收集洗脱液；(4 )将所述步骤(3 )中的洗脱液减压浓缩至原来体积的1/2 ~ 1/15，加入2 ~6倍体积无水乙醇，室温静置2-24h,倾出上清液，离心，沉淀加无水乙醇洗涤脱水，离心，重复上述过程2次，加热干燥，得到中性多糖DIP丄。
4. 根据权利要求1所述的蛇莓多糖中的酸性多糖，是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖构成，命名为DIP2。
5. 根据权利要求4所述的酸性多糖的制备方法，包括如下步骤(1 )将所述蛇莓多糖DIP用水配成1% ~ 20%溶液，离心去杂质，按DIP溶液 氯仿正丁醇(V/V) 10-50:5:1进行萃取，振摇，静置分层，保留水 相层，重复操作2-10次；(2) 减压浓缩上层水相溶液，醇沉，去除沉淀后干燥得脱蛋白后的蛇莓多 糖DIP;(3) 称取脱蛋白后蛇莓多糖DIP,用水配成0. 5~5%溶液，离心去杂质，离 子交换柱层析，恒流上样，结東后，用水洗脱，洗至苯酚_硫酸法检测 无阳性反应后，用0-2.0 mol/L NaCl溶液线性梯度洗脱，按洗脱曲 线收集糖集中部分，将收集的组分减压浓縮至原来体积的1/2-1/15, 过滤，除中性盐后得到洗脱液；(4) 将所述步骤(3)中的洗脱液减压浓缩至原来体积的1/2 ~ 1/15,加入 2 6倍体积无水乙醇，室温静置2 2化，倾出上清液，离心，沉淀加 无水乙醇洗涤脱水，离心，重复上述过程2次，加热干燥，得到酸性 多糖DIP2。
6. 根据权利要求4所述的酸性多糖DIP2中的活性单体成分多糖，其结构为含有 甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、磷酸基和氨基的酸性杂多 糖，命名为DIP3。，分子量为198万。
7. 根据权利要求6所述的活性单体成分多糖的制备方法，包括如下步骤(1) 称取中药蛇莓，将其溶于5 25倍体积水中，水洛3-6小时后回收提 取液，过滤后得滤液，另将滤渣溶于5~25倍体积、pH7 13的NaOH 溶液中，继续加热水洛3-6小时，过滤后得滤液；混合上述两次滤液 得水煮提取液；(2) 将所述水煮提取液浓缩至原体积的1/2 ~ 1/15，冷却后离心去除沉淀，上清溶液加入乙醇，使乙醇终浓度为0%~50%，得到活性单体成分多糖DIP3。粗品；(3 )将活性单体成分多糖DIP^粗品配成5 ~ 20mg/ml水溶液，加入活化后的 碱性阴离子交换树脂脱色，树脂用量控制在溶液体积的5~20倍，，去 除色素后水溶液浓縮，醇沉，过夜，醇沉产物用无水乙醇洗涤加离心反 复3次，加热烘干，得到除色素后的DIP3。；(4) 称取除色素后的DIP3。，用水配成0. 5~5%溶液，离心去杂质，离子交换 柱层析，恒流上样，结東后，用水洗脱，洗至苯酚-硫酸法检测无阳性 反应后，用0~2. Omol/LNaCl溶液线性梯度洗脱，按洗脱曲线收集糖 集中部分，将收集的组分减压浓缩至原体积的1/2-1/15,过滤，除中 性盐；(5) 将经过离子交换柱层析的DIP3。进行分子筛柱层析，分部收集，用硫酸 苯酚法检测，合并糖峰主要部分，冷冻干燥，得到DIP3。精品。
8. 根据权利要求4所述的酸性多糖DIP2的活性单体成分多糖，其结构为含有鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、磷酸基和氨基的酸性杂多糖，命 名为DIPw,分子量为3.4万。
9. 根据权利要求8所述的活性单体成分多糖的制备方法，包括如下步骤(1) 称取中药蛇莓，将其溶于5 25倍体积水中，水浴3~6小时后回收提 取液，过滤后得滤液，另将滤渣溶于5~25倍体积、pH7~13的NaOH 溶液中，继续加热水浴3 6小时，过滤后得滤液；混合上述两次滤液 得水煮提取液；(2) 将所述水煮提取液浓缩至原体积的1/2 ~ 1/15，冷却后离心去除沉淀， 上清溶液加入乙醇，使乙醇终浓度为50%~90%,得到活性单体成分多糖DIPm粗品；(3) 将活性单体成分多糖DIP6。粗品配成5~20mg/ml水溶液，加入活化后的 碱性阴离子交换树脂脱色，树脂用量控制在溶液体积的5~20倍，去除 色素后水溶液浓缩，醇沉，过夜，醇沉产物用无水乙醇洗涤加离心反复 3次，加热烘干，得到除色素后的DIPs。；(4) 称取除色素后的DIP6。，用水配成0. 5~5%溶液，离心去杂质，离子交换 柱层析，恒流上样，结束后，用水洗脱，洗至苯酚-硫酸法检测无阳性 反应后，用0~2. Omol/LNaCl溶液线性梯度洗脱，按洗脱曲线收集糖 集中部分，将收集的组分减压浓缩至原体积的1/2-1/15，过滤，除中 性盐；(5) 将经过离子交换柱层析的DIP6。进行分子筛柱层析，分部收集，用硫酸 苯酴法检测，合并糖峰主要部分，冷冻干燥，得到DIPm精品。
10.蛇莓多糖在制备抗水痘-带状疱渗病毒的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及从植物中提取的多糖、该多糖的制备方法和用途，属于生物制药领域。本发明中多糖的制备是从蛇莓全草中提取分离出具有明显抗水痘-带状疱疹病毒活性的总多糖DIP、总多糖DIP其中的中性多糖DIP₁和酸性多糖DIP₂、以及酸性多糖DIP₂中两种主要活性单体成分多糖DIP₃₀和多糖DIP₆₀。原料蛇莓全草来源广泛，易再生；制备方法便于操作，重复性高。该多糖对水痘-带状疱疹病毒表现出明显的抑制作用，并且安全、无毒、稳定，是优质的抗病毒候选药物。
文档编号C08B37/00GK101486771SQ20091002485
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月27日 优先权日2009年2月27日
发明者安 周, 婧 王, 陈建华 申请人:中国药科大学