专利名称：生物粘附型聚乙二醇衍生物及其在药学中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药用高分子辅料合成和药物制剂领域，具体涉及一种生物粘附型聚乙二醇衍 生物。本发明还公开了这种材料的制备方法及应用。
背景技术：
生物粘附是指天然或是人造的材料与机体的粘膜表面产生的粘连作用。人机体中很多部 位，如口腔、鼻腔、胃肠道、眼部、阴道等的表面均覆盖有粘膜层，要实现药物通过这些粘 膜部位的递送，首先就必须保证药物能与粘膜部位产生较长时间的接触，从而保证药物通过 给药部位的组织屏障并被吸收传输到靶器官。机体组织的粘膜可分泌粘液，其主要成分为粘 蛋白、糖蛋白、类脂等，只有粘附材料的分子链段与黏液层的黏性链段产生紧密作用，才能 产生生物粘附现象。然而大部分粘附材料只是通过简单的静电作用、范德华力、氢键作用等 与粘性片段作用，作用不够紧密，加上粘膜部位自身的保护和屏障作用，大部分粘附材料及 其与药物递送载体或是药物的结合物，在机体粘膜部位的滞留时间都是有限的。
胶体给药组合物可实现药物的缓控释，提高对难溶性药物的包裹，以及实现药物的耙向 递送等。但是由于粘膜表面纤毛的清除机制，胶体给药组合物不能与粘膜表面产生长时间的 紧密接触，粘膜层滞留时间较短，因此不能实现药物在机体粘膜部位的有效递送。通过对胶 体给药组合物的表面进行修饰，有可能改变其表面特性，从而增加其与粘膜层的作用。
聚乙二醇类材料常用作胶体给药组合物的表面修饰材料，其可有效的防止胶体微粒被巨 噬系统所识别，延长胶体微粒在血循环系统中的时间，实现其长循环及靶向性。聚乙二醇烷 基酯和聚乙二醇烷基醚是由聚乙二醇分别与长链的脂肪酸或脂肪醇縮合而成的聚乙二醇烷基 酯类或醚类衍生物，其结构中同时具有疏水的烷基端和亲水的聚乙二醇链段，有较好的亲水 亲油性。
发明内容
本发明公开了一种具有生物粘附性的聚乙二醇醚类或是酯类的衍生物。利用本发明的衍 生物对胶体给药组合物的表面进行修饰后，使胶体给药组合物具有良好的生物粘附性能，从 而延长胶体给药组合物在机体粘膜部位的滞留时间。
本发明的生物粘附型聚乙二醇类衍生物的结构式如下式I或II-<formula>formula see original document page 4</formula>
其中Ri或R2代表Cn.n的垸基；n代表3-200的整数尺3代表:
SH或
上述式I或式II的生物粘附型聚乙二醇类衍生物，其中R,优选代表十七垸基。R2优选代 表十二烷基、十四垸基、十六垸基或十八烷基。N优选代表10、 12、 20、 40、 50或100。
本发明的生物粘附型聚乙二醇衍生物可作为胶体给药组合物的修饰载体，使胶体给药组合 物具有粘膜粘附性能，大大提高其粘膜部位给药的生物利用度。该胶体给药组合物主要优选 包括脂质体、脂质纳米粒、纳米脂质载体、乳剂等。本发明的生物粘附型聚乙二醇衍生物 可和胶体给药组合物组合用于眼部、口腔、胃肠道、阴道、鼻粘膜等粘膜部位的给药。
本发明的聚乙二醇衍生物的制备方法简单、副产物少，条件温和，包括下列的步骤采
用对硝基苯基氯甲酸酯活化聚乙二醇垸基酯类或是烷基醚类衍生物的端羟基，然后在碱性的 条件下与提供氨基基团的具有端基硫羟基的物质进行氨解反应，形成以酰胺键相连的具有粘 膜粘附功能的聚乙二醇衍生物。其中所述提供氨基基团的具有端基硫羟基的物质为半胱氨酸、 半胱胺或高半胱氨酸。
更为优选的制备方法如下 1.聚乙二醇衍生物的端羟基活化
将4-硝基苯基氯甲酸酯和聚乙二醇烷基酯或聚乙二醇垸基醚溶于无水二氯甲烷中，加入
三乙胺调节溶液至碱性，密闭常温磁力搅拌反应过夜。滤去反应中的三乙胺盐酸沉淀，旋转 蒸发除去溶剂。所得产物经乙酸乙酯和乙醚两次重结晶，真空干燥得到端羟基活化的聚乙二 醇类衍生物。
合成路线如下<formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>
其中Ri、 R2或n的定义同前。 2.巯基化聚乙二醇衍生物的制备
在端羟基活化后的聚乙二醇衍生物的水溶液中，加入半胱氨酸、半胱胺或高半胱氨酸，调 节pH为6-9，室温避光反应l-4小时后，用醋酸缓冲液透析24小时，冻干后即得到巯基化的 聚乙二醇烷基醚或是聚乙二醇烷基酯。
合成路线如下
<formula>formula see original document page 5</formula>
其中Rb R2、 R3或n的定义同前。 将本发明的生物粘附型聚乙二醇衍生物溶于水，与胶体微粒温孵5-20min，即可制得粒径 为20-400nm的生物粘附型胶体给药组合物。所谓的胶体给药组合物包括脂质体、脂质纳米粒、 脂质纳米载体、乳剂等。
本发明的生物粘附型聚乙二醇衍生物可与胶体给药组合物组合，使疏水的烷基端插入胶 体微粒的内核，而亲水性的带有端基硫醇基的聚乙二醇长链自由伸展于胶体微粒的表面，从 而有利于实现胶体微粒的粘膜粘附。例如，对脂质纳米载体进行修饰后，可使不具有生物粘 附性能的脂质纳米载体微粒，具有生物粘附性。
一、 游离巯基的含量测定
根据文献报道(Eur. J. Pharm. Biopharm. 2003， 55 (2): 185-190)游离巯基的含量与聚合物 的粘附性密切相关，游离巯基的含量越大则聚合物的粘附性也越强。
采用Ellman's试剂法测定所制生物粘附型聚乙二醇衍生物的游离巯基含量。本发明的聚 乙二醇垸基酯类衍生物的巯基含量大于800mmol/mo1聚合物，本发明的聚乙二醇烷基醚类衍 生物的巯基含量大于450 mmol/mo1聚合物。
二、 生物粘附型聚乙二醇衍生物的粘附性能评价
根据文献报道(Adv. Drug Deliv. Rev. 2005, 57(11):1583-1594)，只有生物粘附型材料的溶 液与粘蛋白溶液混合时，才会改变粘蛋白颗粒的表面性质。
用磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制粘蛋白溶液，用超声细胞破碎仪将粘蛋白的颗粒粒径减少至1微米以下，4000rpm离心后取上清液，过0.8微米的醋酸纤维素滤膜后备用。
将本发明的生物粘附型聚乙二醇衍生物配制成不同浓度的溶液，等体积与上述粘蛋白溶 液混合，考察粘蛋白颗粒粒径和zeta电位的变化，以评价粘蛋白颗粒的表面性质的改变。结 果显示本发明的生物粘附型聚乙二醇衍生物显著的改变了粘蛋白颗粒的表面性质(尸O.05)，其 具有生物粘附性。见图l (其中左图和右图分别是粘蛋白颗粒的粒径和电位变化图)。
三、 生物粘附型聚乙二醇衍生物修饰的脂质纳米粒的粘附性评价
根据文献(Eur.J.Pharm.Biopharm. 2003,56 (2):207-214)，采用粘度法对修饰后的纳米粒 的生物粘附性能进行评价。只有具有生物粘附性能的材料或载体才会使粘蛋白溶液(mucin) 的粘度显著上升。将粘蛋白配制成8%浓度的溶液，采用黏度计测定其粘度的初始值。将等体 积的脂质纳米粒(NLC )和本发明生物粘附型聚乙二醇衍生物修饰后的脂质纳米粒(Cys-NLC ) 分别加入其中，平衡20分钟后，于室温下测定混合后溶液的粘度。结果显示，与普通脂质纳
米粒与粘蛋白溶液混合后溶液的粘度较初始粘度没有显著的变化，但是经过本发明生物粘附 型聚乙二醇衍生物修饰后的脂质纳米粒与粘蛋白溶液混合后显著的提高了粘蛋白溶液的粘度 说明经过本发明所制的聚乙二醇衍生物的修饰，所得到的修饰后的脂质纳米粒具有 生物粘附性。结果见图2所示。
四、 生物粘附型脂质纳米粒在粘膜部位的粘附性评价 通过考察生物粘附型脂质纳米粒在眼部粘膜部位滞留的时间，来评价其在体内粘膜部位
的生物粘附性。采用环孢素A作为模型药物制成环孢素A生物粘附型脂质纳米粒滴眼剂，滴 入家兔眼中，测定环孢素A在泪液中的浓度，以评价修饰后的脂质纳米粒携带药物在眼前滞 留的时间。结果表明，本发明所制的生物粘附型脂质纳米粒(Cys-NLC)较之普通的脂质纳 米粒(NLC)，可显著提高药物在眼部粘膜部位的滞留时间(户<0.05)，生物粘附型脂质纳米粒 在6小时仍能测到较高的药物浓度，但是普通脂质纳米粒4小时就测不到药物浓度，说明本 发明所制的修饰后的脂质纳米粒具有较好的生物粘附性能。结果见图3所示。
将本发明的生物粘附型脂质纳米粒经大鼠鼻粘膜给药后，测定血液中药物的浓度，发现 本发明所制生物粘附型脂质纳米粒的血药浓度曲线下面积(AUC)比普通脂质纳米粒的血浓 曲线下面积(AUC)提高了 3-5倍，说明由于增加了药物在鼻粘膜部位的滞留，使药物在吸 收部位停留的时间延长，从而使药物的生物利用度得到提高。
图1是本发明的生物粘附型聚乙二醇衍生物对粘蛋白颗粒表面性质的影响 图2是本发明的生物粘附型脂质纳米粒对粘蛋白溶液粘度的影响图3是本发明的生物粘附型脂质纳米粒眼部粘膜的滞留行为评价
具体实施例方式
实施例1
生物粘附型聚乙二醇40脂肪酸酯的制备
精密称取4-硝基苯基氯甲酸酯2g，聚乙二醇脂肪酸酯12g，将以上两种物质分别溶于无 水二氯甲垸中，并在聚乙二醇脂肪酸酯的无水二氯甲垸溶液中加入三乙胺l ml。将含有三乙 胺的聚乙二醇脂肪酸酯无水二氯甲烷溶液缓慢加入到搅拌状态下的4-硝基苯基氯甲酸酯的无 水二氯甲烷溶液中，密闭常温磁力搅拌反应过夜。抽滤除去反应液中生成的三乙胺盐酸盐沉 淀。用旋转蒸发仪蒸干溶剂二氯甲烷和未反应的三乙胺。所得粗品用无水乙醚沉淀并洗涤， 抽滤除去无水乙醚，沉淀用乙酸乙酯:乙醚(l:l)混合溶剂重结晶。所得产品置真空干燥器干 燥，抽去残留溶剂，得白色粉末7,2g。
将端基活化的聚乙二醇脂肪酸酯溶于醋酸缓冲液中，按摩尔比1:2加入半胱氨酸，调节 pH至8，室温避光反应2小时，用0.1M的醋酸缓冲液透析24小时，所得样品冻干后，置于 4。C冰箱，密封保存。
iH-NMR (300 MHz, CDC13): 36.2 (m， C(O)NH)， 53.56-3.69 (m, 0陽CH2CHrO)为聚乙二醇脂 肪酸酯中PEG链的特征吸收，S1.24 (m， CH2)为聚乙二醇脂肪酸酯中饱和的脂肪链，S2.28-2.33 (m, 4H, C(0)CH2)， S4.18-4.3 (m， 2H,CH2OCO)， 53.0 (m, 2H， C(O) CH2)。巯基含量结果表明 每摩尔聚合物修饰有827.893±25.56 (Jmol的巯基。该聚合物的结构式如下所示
o
实施例2
生物粘附型聚乙二醇100脂肪酸酯的制备
精密称取4-硝基苯基氯甲酸酯2g,聚乙二醇100脂肪酸酯15g,将以上两种物质分别溶 于无水二氯甲垸中，并在聚乙二醇100脂肪酸酯的无水二氯甲烷溶液中加入三乙胺lml。将 含有三乙胺的聚乙二醇脂肪酸酯无水二氯甲垸溶液缓慢加入到搅拌状态下的4-硝基苯基氯甲 酸酯的无水二氯甲烷溶液中，密闭常温磁力搅拌反应过夜。抽滤除去反应液中生成的三乙胺 盐酸盐沉淀。用旋转蒸发仪蒸干溶剂二氯甲垸和未反应的三乙胺。所得粗品用无水乙醚沉淀并洗涤，抽滤除去无水乙醚，沉淀用乙酸乙酯:乙醚(l:l)混合溶剂重结晶。所得产品置真空 干燥器干燥，抽去残留溶剂，得白色粉末8g。
将端基活化的聚乙二醇脂肪酸酯溶于醋酸缓冲液中，按摩尔比1:3加入半胱氨酸，调节 pH至8，室温避光反应2小时，用0.1M的醋酸缓冲液透析24小时，所得样品冻干后，置于 4。C冰箱，密封保存。
力-NMR (300 MHz, CDC13): S6.2(m, C(O)NH)， S3.56-3.69(m, 0-CH2CH2-0)为聚乙二醇脂 肪醇醚中PEG链的特征吸收，51.24 (m， CH2)为聚乙二醇脂肪醇醚中饱和的脂肪链，S2.28-2.33 (m, 4H, C(0)CH2)， S4.18-4.3 (m， 2H, CH2OCO)。巯基含量结果表明每摩尔聚合物修饰有878.4 ± 15.78 lJmol的巯基。该聚合物的结构式如下所示
o
OH
SH
实施例3
生物粘附型聚乙二醇20硬脂基醚的制备
精密称取4-硝基苯基氯甲酸酯2g，聚乙二醇脂肪醇醚20g，将以上两种物质分别溶于无 水二氯甲烷中，并在聚乙二醇脂肪醇醚的无水二氯甲垸溶液中加入三乙胺l ml。将含有三乙 胺的聚乙二醇脂肪醇醚无水二氯甲垸溶液缓慢加入到搅拌状态下的4-硝基苯基氯甲酸酯的无 水二氯甲垸溶液中，密闭常温磁力搅拌反应过夜。抽滤除去反应液中生成的三乙胺盐酸盐沉 淀。用旋转蒸发仪蒸干溶剂二氯甲垸和未反应的三乙胺。所得粗品用无水乙醚沉淀并洗涤， 抽滤除去无水乙醚，沉淀用乙酸乙酯:乙醚(l:l)混合溶剂重结晶。所得产品置真空干燥器干 燥，抽去残留溶剂，得白色粉末9,2g。
将端基活化的聚乙二醇脂肪醇醚溶于醋酸缓冲液中，按摩尔比1:2加入半胱氨酸，调节pH 至8，室温避光反应2小时，用0.1M的醋酸缓冲液透析24小时，所得样品冻干后，置于4。C 冰箱，密封保存。
^曙NMR (300 MHz, CDC13): S6.2(m, C(O)NH)， S3.56-3.69(m, 0-012。112-0)为聚乙二醇脂 肪醇醚中PEG链的特征吸收，31.24(111,(:112)为聚乙二醇脂肪醇醚中饱和的脂肪链。巯基含量 结果表明摩尔聚合物修饰有489.6±43.15 (Jmol的巯基。该聚合物的结构式如下所示<formula>formula see original document page 9</formula>实施例4
生物粘附型脂质纳米粒的制备
采用环孢素A作为模型药物，制备生物粘附型脂质纳米粒。具体如下将甘油酯400mg 和辛酸/葵酸甘油酯200mg，环孢素A 50 mg在80°C水溶熔融，100 mg吐温80和lOOmg聚 乙二醇硬脂酸酯溶于7 mL的水中加热到80 。C，把水相滴加到熔融的油脂中，搅拌5min形 成初乳。初乳于400W超声10分钟，趁热过0.45 tim微孔滤膜后，滴入2%的生物粘附型聚 乙二醇40脂肪酸酯(实施例l方法制得)3mL， 80。C温孵搅拌5分钟，冰浴冷却。
采用Ellman，s测得所制生物粘附型脂质纳米粒的巯基含量为2.33mmol/L。评价其在眼部 粘膜的滞留行为，发现6小时后仍然能够检测到较高的环孢素A的浓度，说明其生物粘附性 较好。
将所制生物粘附型脂质纳米粒经大鼠鼻粘膜给药后，测定血液中环孢素A的浓度，发现 本发明所制生物粘附型脂质纳米粒的血药浓度曲线下面积(AUC)比普通脂质纳米粒的血浓 曲线下面积(AUC)提高了5倍，说明由于增加了药物在鼻粘膜部位的滞留，使药物在吸收 部位停留的时间延长，从而使药物的生物利用度得到提高。
权利要求
1、通式I或II表示的生物粘附型聚乙二醇衍生物其中R1或R2代表C11-17的烷基；n代表3-200的整数；R3代表或
2、 权利要求1的生物粘附型聚乙二醇衍生物，其中Ri代表十七垸基。
3、 权利要求1的生物粘附型聚乙二醇衍生物，其中R2代表十二垸基、十四垸基、十六烷基 或十八烷基。
4、 权利要求1的生物粘附型聚乙二醇衍生物，其中n代表10、 12、 20、 40、 50或100。
5、 权利要求1至4中任一项的生物粘附型聚乙二醇衍生物的制备方法，包括采用对硝基苯 基氯甲酸酯活化聚乙二醇衍生物的端羟基，然后在碱性条件下与提供氨基基团的具有端基 硫羟基的物质进行氨解反应，形成以酰胺键相连的具有生物粘附功能的聚乙二醇衍生物， 其中提供氨基基团的具有端基硫羟基的物质为半胱氨酸、半胱胺或高半胱氨酸。
6、 一种药物组合物，其中含有权利要求1至4中任一项的生物粘附型聚乙二醇衍生物及胶体 给药组合物。
7、 权利要求6的药物组合物，其中胶体给药组合物为脂质纳米粒、纳米脂质载体、乳剂或脂 质体。
8、 权利要求1至4中任一项的生物粘附型聚乙二醇衍生物用于增加药物组合物生物粘附性的 用途。
全文摘要
本发明涉及药用高分子辅料合成和药物制剂领域，具体涉及一种结构式I或结构式II的生物粘附型聚乙二醇衍生物。本发明的生物粘附型聚乙二醇衍生物可作为胶体给药组合物的修饰载体，使胶体给药组合物具有粘膜粘附性能，大大提高其粘膜部位给药的生物利用度。本发明还公开了这种材料的制备方法及应用。
文档编号C08G65/48GK101544756SQ20091003106
公开日2009年9月30日 申请日期2009年4月23日 优先权日2009年4月23日
发明者孙敏捷, 平其能, 洁 沈, 宇 王, 邓艳平 申请人:中国药科大学