专利名称：纤维素酶水解木质纤维素的方法
技术领域：
本发明属于木质纤维素水解领域，尤其是利用纤维素酶水解木质纤维素的领域。
技术背景传统能源的紧缺引起燃料乙醇产业迅速崛起，以玉米、小麦等粮食作物为原料生产燃料 酒精易引发粮食短缺，为此各国政府开始积极鼓励通过农业废弃物如秸秆、蔗渣等木质纤维 素原料生产燃料乙醇。该技术主要通过对原料进行预处理、纤维素酶水解及酒精发酵获得产 品。其中纤维素酶水解木质纤维素是该技术中的关键步骤，属于较为复杂的异相生物化学反 应体系。该领域目前的研究热点主要集中在提高酶利用率、维持酶活力、减少微生物污染等， 最终目的都在于提高糖化率及纤维素转化率，目前普通酶解的纤维素转化率一般在50%左右， 经非离子表面活性剂增强后可升高到75%左右。事实上，纤维素酶在反应底物中木质素表面 的吸附会造成部份酶的失效，通过添加非离子型的表面活性剂可以抑制酶的无效吸附，改善 物质在两相间的扩散性质，迅速提高反应速率，但反应一段时间后，其在底物及酶分子表面 的吸附达到平衡，使反应面更新速度下降，体系逐渐处于相对不灵活状态。超声的作用可迅 速去除已反应表面剩余的固态颗粒，更新反应面，增强传质，促进反应，但超声产生的极端 理化条件容易导致蛋白质变性，使酶失活。当反应条件(如表面活性剂的用量，超声强度， 超声方式，超声时间等)控制合理，表面活性剂和超声的联合可产生互补效应，明显改善反 应效果。发明内容为了克服上述纤维素酶在水解木质纤维素过程存在的问题，本发明提供一种以聚乙二醇 作为添加剂并采用间歇超声处理的纤维素酶水解木质纤维素的方法，通过聚乙二醇的加入， 以及超声的作用，克服水解过程纤维素酶的无效吸附，提高反应活性点更新速度及反应物的 接触频率，抑制酶失活，减少酶用量，增强体系反应能力，提高纤维素转化率。本发明主要通过以下的方法实现将木质纤维素分散于柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液中，添加聚乙二醇和纤维素酶，反应15 35h后，按每20 30min间歇性施加功率为20 80W的超声，每次超声处理时间1 10s，总 超声时间为2 10min;其中每1L缓冲溶液添加木质纤维素20 60g，聚乙二醇1.0 5.0g， 纤维素酶0.2 1.0g。反应温度控制在45 55°C。其中超声功率优选20 60W，每次超声处理的时间优选2 8s，总超声的时间优选3 8min，聚乙二醇用量优选L5 4.5g/L，木质纤维素30 50 g/L，纤维素酶0.4 0.8 g/L。上述水解反应的木质纤维素由植物纤维通过下述方法预处理得到植物纤维烘干并粉碎至60 80目，分散在碱液中蒸煮处理2 6h，过滤，并用水洗涤至 滤液pH为5 7，烘干即得。其中碱液可以选择氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液等，植物纤维可以是玉米秸秆、甘蔗 渣、稻草秸秆、木屑或竹粉等，反应固液比为l: 10g/mL。本发明通过在纤维素酶水解木质纤维素的体系中加入聚乙二醇，改善物质在两相间的扩 散性质，提高初期反应速率，同时为了防止因吸附作用所导致的反应活性的降低，在反应进 行一段时间后如进行2 10小时后，对反应体系进行间歇性的超声处理， 一方面，适当强度 的超声可破坏表面活性剂吸附层，加速反应表面的更新，增强传质，促进反应。另一方面， 表面活性剂以胶束形式与酶的疏水位点相结合，通过屏蔽变性蛋白质间的疏水作用来抑制其 聚集并辅助复性，因此一定程度上可保护受超声影响的酶，同时可以稳定超声波引起的超声 空化、表面不稳定、微冲流等现象。因此通过上述聚乙二醇和超声的协同作用，可以在较为 温和的条件下使纤维素转化率提高到80%以上。实施例中所述的DNS法和HPLC法的具体原理如下DNS法纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一 定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就 可测定纤维素酶的活力。HPLC法是用高效液相法检测还原糖。由于还原糖在紫外无吸收，所以选择示差折光检测器。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。 实施例1玉米秸秆粉碎至60 80目，以固液比为l: 10g/mL，分散在1.0% NaOH溶液中，蒸煮 处理2h，趁热过滤，并用水洗涤至滤液pH为5 7，烘干备酶解使用。甘蔗渣粉碎至60 80目，以固液比为l: 10 g/mL，分散在1.0% KOH溶液屮，蒸煮处 理3h，趁热过滤，并用水洗涤至滤液pH为5 7，烘干备酶解使用。稻草秸秆粉碎至60 80目，以固液比为l: 10g/mL，分散在0.9% NaOH溶液中，蒸煮 处理5h，趁热过滤，并用水洗涤至滤液pH为5 7，烘干备酶解使用。实施例2取玉米秸秆预处理得到的木质纤维素40g/L，分散于pH为5. 0的0. lmol/L柠檬酸—柠 檬酸钠缓冲溶液，摇匀后添加0.6g/L纤维素酶开始水解。反应60小时后，以DNS法和HPLC测滤液中总还原糖及葡萄糖含量，总还原糖得率为328mg/g干料，最终纤维素转化率为55.8 %。实施例3取玉米秸秆预处理得到的木质纤维素40g/L，分散于pH为5. 0的0. lmol/L柠檬酸一柠 檬酸钠缓冲溶液，加入2.0g/L聚乙二醇4000，摇匀，50。C静置2小时后添加0.6g/L纤维素 酶开始水解。反应60小时后，以DNS法和HPLC测滤液中总还原糖及葡萄糖含量，总还原糖 得率为398mg/g干料，最终纤维素转化率为72. 1%。实施例4:取稻草秸秆预处理得到的木质纤维素50g/L，分散于pH为5. 0的0. lmol/L柠檬酸一柠 檬酸钠缓冲溶液，摇匀后添加0. 8g/L纤维素酶开始水解。反应15小时后，每间歇20min，施 加功率30W的超声波处理3s，总超声时间6min，以DNS法和HPLC测滤液中总还原糖及葡萄 糖含量，总还原糖得率为357mg/g干料，最终纤维素转化率为63.2%。实施例5取玉米秸秆预处理得到的木质纤维素40g/L，分散于pH为5. 0的0. lniol/L柠檬酸一柠 檬酸钠缓冲溶液，加入2. Og/L聚乙二醇4000,摇匀后5(TC静置2小时后添加0. 8g/L纤维素 酶开始水解。反应15小时后，每间歇20min，施加功率30W的超声波处理3s,总超声时间 6min，以DNS法和HPLC测滤液中总还原糖及葡萄糖含量，总还原糖得率为447mg/g干料，最 终纤维素转化率为80.8%。实施例6取甘蔗渣预处理得到的木质纤维素40g/L，分散于pH为5. 0的0. lmol/L柠檬酸一柠檬 酸钠缓冲溶液，加入3. Og/L聚乙二醇4000，摇匀后48。C静置2小时后添加0. 8g/L纤维素酶 开始水解。反应15小时后，每间歇20min,施加功率40W的超声波处理3s,总超声时间6min， 以DNS法和HPLC测滤液中总还原糖及葡萄糖含量，总还原糖得率为510mg/g干料，最终纤维 素转化率为84.6%。实施例7取稻草秸秆预处理得到的木质纤维素50g/L，分散于pH为5. 0的0. lniol/L柠檬酸一柠 檬酸钠缓冲溶液，加入2.5g/L聚乙二醇4000，摇匀后50。C静置2小时后添加0.54g/L纤维 素酶开始水解。反应15小时后，每间歇20min，施加功率30W的超声波处理3s，总超声时间 6min，以DNS法和HPLC测滤液中总还原糖及葡萄糖含量，总还原糖得率为421mg/g干料，最终纤维素转化率为77.8%。 实施例8取玉米秸秆预处理得到的木质纤维素50g/L，分散于pH为5. 0的0. lmol./L柠檬酸一柠 檬酸钠缓冲溶液，加入3. 0g/L聚乙二醇4000，摇匀后5(TC静置2小时后添加0. 8g/L纤维素 酶开始水解。反应15小时后，每间歇20min，施加功率40W的超声波处理2s，总超声时间 4niin，以DNS法和HPLC测滤液中总还原糖及葡萄糖含量，总还原糖得率为545mg/g干料，最 终纤维素转化率为85.3%。实施例9取稻草秸秆预处理得到的木质纤维素45g/L，分散于pH为5. 0的0. lmol/L柠檬酸一柠 檬酸钠缓冲溶液，加入3. 5g,/L聚乙二醇4000，摇匀后52。C静置2小时后添加0. 8g/L纤维素 酶开始水解。反应15小吋后，每间歇20min，施加功率50W的超声波处理2s，总超声时间 4min，以DNS法和HPLC测滤液中总还原糖及葡萄糖含量，总还原糖得率为497mg/g千料，最 终纤维素转化率为81.8%。由上述实施例可得，申.纯用纤维素酶进行水解处理，木质纤维素的转化率很低，大概只 要55%左右，如实施例2只有55.8%，单独添加聚乙二醇或者单独进行超声处理后，纤维素 酶水解的效果有所提高，如实施例3是在聚乙二醇的作用下进行水解，转化率达到72. 1%， 实施例4是在超声作用下进行水解，转化率达到63.2%。将间歇性超声处理处理和聚乙二醇 结合起来以后，水解的效果明显提升，如实施例8，最高可以达到85.3%的转化率。
权利要求
1. 一种纤维素酶水解木质纤维素的方法，其特征在于将木质纤维素分散于柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液中，添加聚乙二醇和纤维素酶，反应15～35h后，按每20～30min间歇性施加功率为20～80W的超声，每次超声处理时间1～10s，总超声时间为2～10min；其中每1L缓冲溶液添加木质纤维素20～60g，聚乙二醇1.0～5.0g，纤维素酶0.2～1.0g。反应温度控制在45～55℃。
2. 根据权利要求1所述的一种纤维素酶水解木质纤维素的方法，其特征在于所述的超声功 率为20 60W。
3. 根据权利要求1所述的一种纤维素酶水解木质纤维素的方法，其特征在于每次超声处理的时间为2 8秒。
4. 根据权利要求1所述的一种纤维素酶水解木质纤维素的方法，其特征在于总超声时间为3 8分钟
5. 根据权利要求1 4所述的任一一种纤维素酶水解木质纤维素的方法，其特征在于所述 的木质纤维素由下述方法预处理得到植物纤维烘干后粉碎至60 80目，在碱液中蒸煮处理2 6小时，过滤，并用水洗涤 至滤液pH为5 7，烘干即得。
6. 根据权利要求5所述的一种纤维素酶水解木质纤维素的方法，其特征在于所述的碱液为 氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
7. 根据权利要求5所述的一种纤维素酶水解木质纤维素的方法，其特征在于所述的植物纤 维可以是玉米秸秆、甘蔗渣、稻草秸秆、木屑或竹粉。
8. 根据权利要求5所述的一种纤维素酶水解木质纤维素的方法，其特征在于所述的植物纤维和碱液的固液比为l: 10g/mL。
全文摘要
本发明公开了一种纤维素酶水解木质纤维素的方法，通过将木质纤维素分散于柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液中，加入聚乙二醇和纤维素酶，在间歇性超声作用下进行反应，实现对木质纤维素的水解，本发明的技术方案克服了单纯加入聚乙二醇对酶的吸附以及单纯使用超声造成酶的失活影响，有效提高了纤维素酶水解木质纤维素的效率。
文档编号C08B15/00GK101544699SQ200910039240
公开日2009年9月30日 申请日期2009年5月5日 优先权日2009年5月5日
发明者伟 刘, 浩 庞, 兵 廖, 计红果 申请人:中国科学院广州化学研究所