专利名称：γ-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，并提供该Y -聚谷氨酸-天冬氨 酸复合物的制备方法及用途，属于生物医药技术领域。
背景技术：
Y-聚谷氨酸是一种由枯草杆菌自身合成并分泌到细胞外的线型高分子量 聚合物，由谷氨酸的a-氨基和Y-羧基縮合而成。自1937年Ivanovics等人首 次发现以来，Y-聚谷氨酸因其组成单一，结构稳定，良好的生物相容性和生物 可降解性，广泛应用于农业、环保和医药等各个领域，农田灌溉的保水剂，环 保工业的絮凝剂，以及制药行业的药物载体均有聚谷氨酸的相关报道。
Y -聚谷氨酸分子侧链上存在大量游离的羧基，易于一些药物结合生成稳定 的复合物，因其在体内可以被溶酶体降解内源性谷氨酸，并释放出药物，且不 易产生积蓄和毒副作用，已被广泛应用于缓释以及靶向药物载体。作为生物可 降解的高分子聚合物，Y -聚谷氨酸主要用于药物释放和送达载体及非永久性植 入装置，它除了可以满足一般物理、化学性能要求之外，还可以满足生物相容 性要求，如美国华盛顿州细胞治疗公司开发的抗肿瘤药物——聚谷氨酸-紫杉醇 [PG-TXL (CT22103)]，该产品以聚谷氨酸作为药物载体可增强药物输送到肿瘤部 位的能力，起到更好的疗效，并且比紫杉醇更能抗肿瘤细胞的耐药。又如 200610024353. 0公开了Y-聚谷氨酸-顺铂复合物、制备及用途，该复合物以微 生物发酵制备的Y-聚谷氨酸作为药物载体，显著改善了药物的水溶性，延长了 药物的作用时间，降低了药物的毒副作用。
目前作为药物载体用的Y -聚谷氨酸的来源主要有两种， 一种是通过化学合 成获得的，该方法合成步骤复杂，成本高，产量低，不利于产业化；另一种是 由微生物发酵合成的，该方法利用微生物自身的表达系统大量合成聚谷氨酸， 制备工艺简单，成本低，产量高，越来越多的被采纳，本发明所提供的Y-聚谷 氨酸均是通过微生物发酵方法合成的。但是，以Y-聚谷氨酸作为药物载体往往
有以下缺点首先，以线性的单氨基酸聚合物作为药物载体由于活性基团排列 紧密，载药量往往不高；其次，单氨基酸聚合物材料进入生物体内后，由于降解位点单一，降解和吸收的速度较慢，易造成聚合物在生物体内的累积；另外， 谷氨酸分子的水溶性极好，在提高药物相容性的同时，在药物的控释方面还有 不足。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的分子结构。 本发明提供的y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物是指天冬氨酸与y -聚谷氨酸共价 结合的聚合物，其中的键合是通过y-聚谷氨酸的羧基基团与天冬氨酸的氨基基 团之间在多肽縮合剂作用下形成酰胺键来实现的，其通式为^x
n=50 1000的正整数 m=l/10 n n的正整数 y -PGA为y -聚谷氨酸 ASP为天冬氨酸
X为可以与羧基反应的活性基团，包括但不局限于氨基，羟基，巯基。
本发明所提供的y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其特征在于复合物中y -聚谷氨酸比天冬氨酸分子个数比为1:1 10:1，优选为2:1 5:1，进一步优选 为2:1。
本发明所提供的y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其分子量为12KDa 120KDa，优选为24KDa 72KDa，进一歩优选为48KDa 72KDa。
本发明所提供的y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其特征在于，所述X可以 是抗肿瘤药物顺式二氯二胺合铂CDDP，该y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物即y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物， 其通式为^~CDDP
n=50 1000的正整数 m二l/10 n n的正整数
5Y-PGA为Y-聚谷氨酸 ASP为天冬氨酸 CDDP为顺式二氯二胺合铂
本发明目的之二在于提供Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备方法。该方 法包括
(a) 由微生物发酵的方法得到大分子Y-聚谷氨酸钠盐；
(b) 配制1 3%大分子y -聚谷氨酸钠盐溶液，调节pH到2. 0 3. 0，通过高温 高压降解的方法提供一种小分子Y -聚谷氨酸钠盐的水溶液；
(C)将小分子Y-聚谷氨酸钠盐转化为质子化形式的小分子Y-聚谷氨酸，并通 过冷冻干燥的方式得到白色粉末结晶；
(d) 使Y-聚谷氨酸与羧基被保护的天冬氨酸溶于反应溶剂，在多肽縮合剂作 用下，通过所述羧基被保护的天冬氨酸的氨基和Y-聚谷氨酸的a -羧基之间形 成的酰胺键，将天冬氨酸结合到Y-聚谷氨酸上；
(e) 将反应混合物转入三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中脱去天冬氨酸羧基的保 护基团，并以乙醚终止脱保护反应；
(O透析除去杂质和未反应的小分子物质，收集质子化形式的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物。
本发明提供的大分子Y-聚谷氨酸钠盐是由微生物发酵合成的，其分子量为 100KDa 2000KDa。
本发明提供的小分子Y -聚谷氨酸钠盐是由大分子降解而来，包括Y -聚谷 氨酸钠盐形式和Y-聚谷氨酸形式两种，其分子量为10KDa 100KDa，优选为 20KDa 60KDa，进一步优选为40KDa 60KDa。
本发明提供的质子化形式的小分子Y-聚谷氨酸是由小分子Y -聚谷氨酸钠 盐形式转化而来的，配制1 3%大分子Y-聚谷氨酸钠盐溶液，分别以酸透析 48h，去离子水透析24h，收集沉淀，冷冻干燥得到白色粉末结品，测定pH 6. 0 7.0，钠的重量％不超过7000卯m。
本发明所提供的的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其分子量为12KDa 120KDa，优选为24KDa 72KDa，进一步优选为48KDa 72KDa。
6本发明所提供的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备方法，其特征在于， 歩骤(d)所述的Y-聚谷氨酸与天冬氨酸的摩尔比为0.2: 1 5: 1，反应温度
0°C 70°C，反应时间0. 5 5h。
本发明提供的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备方法，其特征在于，所
述溶剂可以是蒸馏水或是惰性有机溶剂，其中所述惰性有机溶剂可以是二甲基
亚砜(DMS0)， N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，优选为二甲基亚砜(DMS0)。
本发明提供的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物是在多肽縮合剂作用下发生反
应，形成酰胺键的，这种縮合剂可以是1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
盐酸盐(EDAC)， N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)， 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基
碳二亚胺(EDC)， N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)，优选为l-乙基-(3-二
甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)。
本发明目的之三在于提供该药物载体Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的用
途。本发明所提供的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物可以与分子结构上含有羧基
反应基团的药物结合，充当药物的高分子载体。
本发明所提供的可以与Y-聚谷氨酸-天冬氨酸结合的药物，是指分子结构
上含有羧基反应基团的药物，这种反应基团包括但不局限于氨基、羟基或巯基，
优选为氨基。
本发明所提供的可以与Y -聚谷氨酸-天冬氨酸结合的药物可以是多肽类药 物，蛋白质类药物，或水溶性较差的芳香族类药物，包括但不局限于胰岛素， 胸腺肽，降钙素，生长激素，干扰素，生长因子，杉醇，喜树碱，藤黄酸，烷 诺酮。
本发明提供的一种Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备方法，是将Y -聚谷 氨酸-天冬氨酸复合物和顺铂混合后，溶解于去离子水中，调节PH 7.0 8.0， 搅拌48 h使其充分反应，经透析纯化得到如下式的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合 物，即Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物。
本发明提供Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其优点在于在微生物发酵制 备的Y -聚谷氨酸小分子的基础上进行改造，通过Y -聚谷氨酸的羧基基团与天 冬氨酸的氨基基团以酰胺键结合形成Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，丰富了作为药物载体的氨基酸的种类，减少了药物载体的用量，增加了药物载体上活性 基团的数目，改善了以线性的单氨基酸聚合物作为药物载体活性基团排列紧密 的缺陷，减少了聚合物在生物体内的累积，改善了药物的控释效果。
图1为本发明得到的y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物利用AVANCE 500MHZ核磁共 振仪测定的'H核磁共振图谱。
图2为从存活率角度考察y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物在正常昆明小鼠体内毒 性实验图。
图3为y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物与y-聚谷氨酸-顺铂复合物载药量 比较分析图。
图4为y -聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物中顺铂的体外释放曲线。
图5为y _聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物作用乳腺癌细胞Bcap37 48小时的细
胞毒性实验图。
图6为从存活率角度考察y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物在正常昆明小鼠 体内毒性实验图。
图7为从体重变化角度考察y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物在正常昆明小
鼠体内毒性实验图。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明进行详细说明 实施例1 y-聚谷氨酸的制备方法 (1)大分子y-聚谷氨酸钠盐的制备
菌种活化取芽孢杆菌(Bacillus licheniformisATCC9945a)菌种一环， 接入斜面培养基，37。C斜面活化llh。斜面培养基蛋白胨10g/l，氯化钠5g/1， 酵母膏5g/1，琼脂20g/l。
种子培养将lml冻存菌种接入种子培养基，37°C， 210r/min，震荡培养 llh。种子培养基蛋白胨10g/l，氯化钠5g/l，酵母膏5g/l。
发酵培养以4%接种量接种上述芽孢杆菌(Bacillus licheniformis ATCC 9945a)， 37°C， 210 r/min，摇瓶培养72h。发酵培养基麦芽糖50g/l，酵母膏10g/l，谷氨酸钠30g/l， NaCl 10 g/l， KH2P04 5 g/l,MgS04 7H20 0 . 5 g/l， 装液量200ml/1000ml摇瓶，115°C、 0. IMPa灭菌20min。
发酵结束后，发酵液加蒸馏水稀释4倍，用盐酸调发酵液pH至2.0 3.0， 12000 r/min、 30min离心去除菌体沉淀，然后将调节上清液pH至7. 0 8. 0， 再加入3倍体积冰冷的无水乙醇，搅拌得到Y-聚谷氨酸沉淀，干燥沉淀得到Y -聚谷氨酸粗产品，将沉淀重新溶解在蒸馏水中，超滤除去不溶物，然后反复透 析(截留分子量MW: 10000)除去杂质和小分子物质，最后将溶液冷冻干燥得 到白色粉末状物质，此白色物质即为Y-聚谷氨酸大分子的钠盐，产量可达到 30 g/1。
(2)小分子Y-聚谷氨酸钠盐的制备
称取实施例1 (1)中获得的大分子Y-聚谷氨酸钠白色粉末，配成2%的大 分子y -聚谷氨酸钠溶液。取2%的大分子y -聚谷氨酸溶液100 ml ，调pH至2. 0 3.0，于12lt、 0. lMPa条件下作用15min，立即冰浴冷却，调pH至7. 0 8. 0 终止反应，用0.45 nm微孔滤膜过滤除去不溶性大分子颗粒，以蒸馏水作为透 析液透析48h (截留分子量MW: 10000，每隔8小时换一次透析液)，将透析后 样品用0.22 um微孔滤膜过滤除去杂质，最后将样品冷冻干燥得到白色粉末状 物质，通过1%琼脂糖凝胶电泳和凝胶渗透色谱法鉴定降解产物的分子量。通过 琼脂糖凝胶电泳可以看出，本发明的小分子Y-聚谷氨酸分子量随降解时间的延 长而减小，降解15 min后分子量在20KDa 60KDa之间；取降解15 min的样品， 由凝胶渗透色谱测定本发明小分子Y-聚谷氨酸分子量在15KDa 40KDa。 实施例2质子化形式的小分子Y-聚谷氨酸的制备
称取实施例1 (2)中获得的小分子Y-聚谷氨酸钠盐(1 g)，溶解在100 ml 去离子水中后，转入透析带(截留分子量MW: 10000)，在4"C下以0.01N盐酸 作为透析液透析48h，再以去离子水作为透析液透析24h，透析过程中，Y-聚 谷氨酸从溶液中沉淀出来，透析结束后，反应混合物在12000 r/min条件下离 心10min，移去上面的水层，收集沉淀，测定pH为7.0 8.0，冷冻干燥直至得 到恒重，Y-聚谷氨酸从钠盐形式到质子化形式的转化产率为72%。由ICP测定， 钠的重量％不超过7000卯m。实施例3 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备 反应方案1:
取以上实施例2所述制备的Y-聚谷氨酸(Y-PGA， lg)，溶解在无水二甲
基亚砜溶液(DMS0， 50ml)中，先后加入羧基被Otbu保护的天冬氨酸(2.82g) 和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC， 1.5 g)，反应混合物 在室温下搅拌4h，加入3倍体积的三氟乙酸(TFA)和二氯甲垸(DCM)的混合 液(v/V = 19:1)，室温搅拌2h，脱去天冬氨酸羧基的保护基团，随后加入15 倍体积的无水乙醚以终止脱保护反应，此时Y -聚谷氨酸-天冬氨酸反应产物沉 淀出来，12000 r/min离心15 min，收集沉淀，透析以除去杂质和未结合天冬 氨酸，然后将产物冷冻干燥，得到L27gY-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物白色粉 末结晶，该复合物的分子量为48KDa 72KDa，经氨基酸及多肽分析仪(HITACHI L8800)测定，通过此方案获得的y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其中y-聚谷 氨酸比天冬氨酸分子个数比约为2:1，也就相当于『2，结构通式为
〔Y國PGA^4ASP)sr"X
n=200 600的正整数 m=l/2 n的正整数 Y -PGA为Y -聚谷氨酸 ASP为天冬氨酸
X为可以与羧基反应的活性基团，包括但不局限于氨基，羟基，巯基。 反应方案2:
取以上实施例2所述制备的Y-PGA (1 g)，溶解在DMSO (50 ml)中，先 后加入羧基被Otbu保护的天冬氨酸(14.1 g)和EDAC (1.5 g)，反应混合物 在室温下搅拌4h，加入3倍体积的TFA和DCM的混合液(v/v = 19:1)，室温 搅拌2h，脱去天冬氨酸羧基的保护基团，随后加入15倍体积的无水乙醚以终 止脱保护反应，此时Y-聚谷氨酸-天冬氨酸反应产物沉淀出来，12000 r/min 离心15min，收集沉淀，透析以除去杂质和未结合天冬氨酸，然后将产物冷冻 干燥，得到1.66gY-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物白色粉末结晶，该复合物的分
10子量为48KDa 72KDa，经氨基酸及多肽分析仪(HITACHI L8800)测定，通过 此方案获得的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其中Y-聚谷氨酸比天冬氨酸分子 个数比约为1.8:1，也就相当于iif1.8，结构通式为
〔y國pgA")Hasp)^x
n=200 600的正整数 m=l/1.8 n的正整数
y -PGA为y -聚谷氨酸 ASP为天冬氨酸
X为可以与羧基反应的活性基团，包括但不局限于氨基，羟基，巯基。 反应方案3:
取以上实施例2所述制备的Y-PGA (1 g),其他实验条件与反应方案1和反应 方案2相同，先后加入羧基被0tbu保护的天冬氨酸(0. 564 g)和EDAC (1. 5 g)， 经反应后，最后将产物冷冻干燥，得到1.02gY-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物白 色粉末结品，该复合物的分子量为48KDa 72KDa，经氨基酸及多肽分析仪 (HITACHI L8800)测定，通过此方案获得的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其 中Y-聚谷氨酸比天冬氨酸分子个数比约为10:1，也就相当于nFlO，其结构通
式为
[y隱pga ")h""(aSp)^~X
n=200 600的正整数 m=l/10 n的正整数
y -PGA为y -聚谷氨酸 ASP为天冬氨酸
X为可以与羧基反应的活性基团，包括但不局限于氨基，羟基，巯基。 反应方案4:
取以上实施例2所述制备的Y-PGA (lg)，其他实验条件与反应方案l， 2 和3相同，先后加入羧基被Otbu保护的天冬氨酸(1.128g)和EDAC (1.5g)，经反应后，最后将产物冷冻干燥，得到O. 71gY-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物白 色粉末结晶，该复合物的分子量为48KDa 72KDa，经氨基酸及多肽分析仪 (HITACHI L8800)测定，通过此方案获得的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其 中Y-聚谷氨酸比天冬氨酸分子个数比约为5:1，也就相当于hf5，其结构通式 为
n=200 600的正整数 m=l/5 n的正整数 y -PGA为y -聚谷氨酸 ASP为天冬氨酸
X为可以与羧基反应的活性基团，包括但不局限于氨基，羟基，巯基。 反应方案5:
取以上实施例1 (2)所述制备的Y-聚谷氨酸钠盐，以上述四种反应方案 中相同的比例，以蒸馏水作为溶剂，以相同的实验方案，可以得到相似的实验结果。
反应方案6:
取以上实施例2所述制备的Y-聚谷氨酸(Y-PGA， lg)，溶解在无水二甲 基亚砜溶液(DMSO， 50ml)中，先后加入羧基被Otbu保护的天冬氨酸(2. 82 g) 和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC， 1.5 g)，反应混合物在室温下搅拌4h，加入 3倍体积的三氟乙酸(TFA)和二氯甲垸(DCM)的混合液(v/v= 19:1)，室温 搅拌2h，脱去天冬氨酸羧基的保护基团，随后加入15倍体积的无水乙醚以终 止脱保护反应，此时Y-聚谷氨酸-天冬氨酸反应产物沉淀出来，12000 r/min 离心15min，收集沉淀，透析以除去杂质和未结合天冬氨酸，然后将产物冷冻 干燥，得到Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物白色粉末结晶。 反应方案7:
取以上实施例2所述制备的Y-聚谷氨酸(Y-PGA， lg)，溶解在无水二甲 基亚砜溶液(DMSO， 50 ml)中，先后加入羧基被Otbu保护的天冬氨酸(2. 82 g)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC，L5 g)，反应混合物在室温下 搅拌4h，加入3倍体积的三氟乙酸(TFA)和二氯甲垸(DCM)的混合液(v/v = 19:1)，室温搅拌2h，脱去天冬氨酸羧基的保护基团，随后加入15倍体积的无 水乙醚以终止脱保护反应，此时y-聚谷氨酸-天冬氨酸反应产物沉淀出来， 12000 r/min离心15 min，收集沉淀，透析以除去杂质和未结合天冬氨酸，然 后将产物冷冻干燥，得到y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物白色粉末结晶。 反应方案8:
取以上实施例2所述制备的y-聚谷氨酸(y-PGA, lg)，溶解在无水二甲 基亚砜溶液(DMSO， 50ml)中，先后加入羧基被Otbu保护的天冬氨酸(2. 82 g) 和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS， 1.5 g)，反应混合物在室温下搅拌4h， 加入3倍体积的三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷(DCM)的混合液(v/v = 19:1)， 室温搅拌2h，脱去天冬氨酸羧基的保护基团，随后加入15倍体积的无水乙醚 以终止脱保护反应，此时y-聚谷氨酸-天冬氨酸反应产物沉淀出来，12000 r/min离心15 min，收集沉淀，透析以除去杂质和未结合天冬氨酸，然后将产 物冷冻干燥，得到y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物白色粉末结晶。 实施例4 y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物体内毒性
雌性昆明小鼠共30只，体重22 25g，随机分成三组，每组10只，分别 注射生理盐水，y-聚谷氨酸和y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，给药方法为尾静 脉注射，采取单次注射方式，注射剂量为2 g/kg，每天记录小鼠的存活情况(图 2)，结果表明￥-聚谷氨酸组小鼠存活率为50%，而y-聚谷氨酸-天冬氨酸复 合物组小鼠在20天后存活率仍大于90%,表明y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物比 原来y -聚谷氨酸的毒性更低。
实施例5 y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物的制备及载药量分析 (1) y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物的制备
称取顺铂20 mg和y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物35 mg，溶于5 ml去离子 水中，调溶液pH至7. 0 8. 0，于37°C避光搅拌反应48h，然后用去离子水透 析48h除去未结合的游离顺铂，将透析后样品冷冻干燥，得y-聚谷氨酸-天冬 氨酸-顺铂复合物白色粉末结晶。(2) Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物中顺铂含量的测定
将(1 )中的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物白色粉末结晶折合顺铂3 12 Ug溶于O. 6ml双蒸水中，与O. 6ml邻苯二胺(0PDA)的N,N-二甲基甲酰胺(面F)溶液(1.2mg/ml)混合，经沸水浴反应10min，立即在703 nm处测定其紫外吸收值，复合物中顺铂含量有标准工作曲线法标定。
(3) Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物载药量分析
分别称取顺铂20 mg和y -聚谷氨酸35 mg;顺铂20 mg和y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物35 mg，按照(1)中的方法制备Y-聚谷氨酸-顺铂复合物和Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物白色粉末结晶。 以(2)中的方法进行顺铂含量的测定(图3)，结果表明Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的载药量是原来Y-聚谷氨酸的近一倍。
实施例6 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物冻干粉针的制备
取相当于顺铂1 g的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物，加适量注射用水溶解，加入甘露醇0.8g搅拌均匀，以盐酸调节pH5.0，加入0.5%针用活性炭，6(TC保温20min，脱炭后，滤液加灭菌注射用水至40ml，无菌条件下，用0. 22lim微孔滤膜过滤，分装于10ml西林瓶中，每瓶lml冷冻干燥，出箱，轧盖即可。
实施例7 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物粉针制备
取相当于顺铂1 g的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物结晶粉末，加入注射用葡萄糖粉末0. 8 g，混合均匀，无菌分装于西林瓶中，每瓶相当于顺铂2 mg，
悉、封礼盖o
实施例8 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物中顺铂的体外释放曲线
以实施例5 (2)中定量方法定量后的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物转入透析带，分别以去离子水和磷酸盐缓冲液作为透析液透析，于2h， 5h， 8h，12h， 24h， 48h， 72h在透析液中取样，测定透析液中顺铂的含量，绘制成Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物中顺铂的体外释放曲线，图4。结果表明Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物在蒸馏水中很稳定，在72h内，溶液未出现沉淀现象和顺铂的释放，但是在PBS中，Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物中的
14顺铂被逐渐释放出来，其特征为在最初的12h内极速释放，达到60%，随后
的时间内呈现缓慢释放的趋势，在72h时释放率为72%。
实施例9 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物对肿瘤细胞的体外细胞毒性
(1) Y _聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物对人乳腺癌细胞Bcap37体外细胞毒性对数生长期的人乳腺癌细胞Bcap37接种于96孔培养板中，将游离顺铂和
Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物分别溶于DMEM培养基中(含10y。胎牛血清)，针头滤器过滤灭菌，加入上述培养基IOO yl于96孔细胞培养板，每孔含细胞约1X1(T个，使其成一定浓度梯度，y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物折合顺铂浓度为1 160 ug/ml，每个浓度做4个复孔，以未加药组作为对照组。将上述细胞于二氧化碳培养箱中分别培养24h， 48h， 72h后，每孔加入20ul浓度为5 mg/ml的MTT缓冲液，继续培养4h,小心吸出细胞培养板孔中的上清液，每孔加入200 u 1 二甲基亚砜，轻轻震摇10min，于酶标仪上测定其在490nm处的光吸收值。
每个浓度的4个复孔的吸光值以对照组吸光值的均值为标准计算出平均值(作为细胞存活率)后，对药物浓度作图，从实验结果发现Y-PGA-ASP-CDDP保留了抗肿瘤生物学活性，在同等剂量条件下，Y-PGA-ASP-CDDP要比游离的CDDP的体外细胞毒性低，这是因为Y -PGA-ASP-CDDP具有缓释的生物学特点。
(2) Y -聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物对人肝癌细胞BEL7404体外细胞毒性取对数生长期人肝癌细胞，将Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物溶于
DMFJ1培养基中(含10%胎牛血清)，Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物折合顺铂浓度为1 160 "g/ml，以上述相同的实验方案进行实验，可以得到相似的实验结果。
实施例10 Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物的体内毒性
雌性昆明小鼠共50只，体重22 25g，随机分成五组，每组10只，分别注射生理里盐水；游离顺铂4mg/kg、 12mg/kg， Y-聚谷氨酸-天冬氨酸-顺铂复合物4mg/kg、 12mg/kg，给药方法为尾静脉注射，共给药三次，分别于第0、3、 6天给药，每天记录小鼠的存活情况和体重变化情况，结果见图6和图7。
从图6是从正常小鼠存活率的角度来考察药物的体内毒性，以12 mg/kg
15剂量。结果表明游离CDDP对正常小鼠的毒性非常大，4天后小鼠死亡90%;而y -PGA-ASP-CDDP对小鼠几乎没有毒性，小鼠存活率大于90%。
图7是从正常小鼠体重变化的角度来考察药物的体内毒性，以12 mg/kg剂量。结果表明游离CDDP组小鼠的体重在原有基础上急剧下降并最终全部死亡；而y-PGA-ASP-CDDP组小鼠体重基本保持稳定，后期更是有逐渐增加的现象，表明其对小鼠的毒性较低。
权利要求
1、一种γ-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其特征通式为n＝50～1000的正整数m＝1/10n～n的正整数γ-PGA为γ-聚谷氨酸ASP为天冬氨酸X为可以与羧基反应的活性基团，包括但不局限于氨基，羟基，巯基。
2、 权利要求1所述的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物是指天冬氨酸与Y -聚谷氨酸共价结合的聚合物，其中的键合是通过Y -聚谷氨酸的羧基基团与天冬氨酸的氨基基团之间在多肽縮合剂作用下形成酰胺键来实现的。
3、 权利要求l所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其特征在于复合物中Y-聚谷氨酸比天冬氨酸分子个数比为1:1 10:1，优选为2:1 5:1，进一步优选为2:1。
4、 权利要求1所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其分子量为12KDa 120KDa，优选为24KDa 72KDa，进一歩优选为48KDa 72KDa。
5、 权利要求l所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其特征在于，所述X可以是顺式二氯二胺合铂CDDP。
6、 权利要求l所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备方法，该方法包括(a) 由微生物发酵的方法得到大分子Y-聚谷氨酸钠盐；(b) 配制1 3%大分子Y-聚谷氨酸钠盐溶液，调节pH到2. 0 3. 0，通过高温高压降解的方法提供一种小分子Y -聚谷氨酸钠盐的水溶液；(c) 将小分子Y-聚谷氨酸钠盐转化为质子化形式的小分子Y-聚谷氨酸，并通过冷冻干燥的方式得到白色粉末结晶；(d) 使Y-聚谷氨酸与羧基被保护的天冬氨酸溶于反应溶剂，在多肽縮合剂的作用下，通过所述羧基被保护的天冬氨酸的氨基和Y-聚谷氨酸的a -羧基之间形成的酰胺键，将天冬氨酸结合到Y-聚谷氨酸上；(e) 将反应混合物转入三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中脱去天冬氨酸羧基的保护基团，并以乙醚终止脱保护反应；(f)透析除去杂质和未反应的小分子物质，收集质子化形式的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物。
7、 权利要求6所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备方法，所述步骤(d)中所用的溶剂可以是蒸馏水或是惰性有机溶剂，其中所述惰性有机溶剂可以是二甲基亚砜(DMS0)， N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，优选为二甲基亚砜(DMS0)。
8、 权利要求6所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备方法，其特征在于，歩骤(d)所述的Y-聚谷氨酸与天冬氨酸的摩尔比为0.2: 1 5: 1，反应温度(TC 70"C，反应时间0. 5 5小时。
9、 权利要求5所述的Y -聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备方法，该方法包括权利要求6所述的歩骤(a)-(f)，和步骤(g)，其中，歩骤(g)将Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物与顺铂混合，溶解于去离子水中，调节pH至7.0 8.0，搅拌48h使其充分反应，经透析纯化得到权利要求5所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物。
10、 权利要求1所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物作为药物载体的用途。
11、 权利要求1或5所述的Y-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物在制备预防或治疗肿瘤疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种γ-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物，其特征通式为上式，n＝50～1000的正整数，m＝1/10n～n的正整数，γ-PGA为γ-聚谷氨酸，ASP为天冬氨酸，X为可以与羧基反应的活性基团，包括但不局限于氨基，羟基，巯基。本发明还公开了γ-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物的制备方法。本发明还公开了γ-聚谷氨酸-天冬氨酸复合物作为药物载体的用途，以及在制备预防或治疗肿瘤疾病药物中的应用。
文档编号C08G69/48GK101463131SQ200910045189
公开日2009年6月24日 申请日期2009年1月12日 优先权日2009年1月12日
发明者震 冯, 吴自荣, 李文娟, 薛晓敏, 静 黄 申请人:华东师范大学