专利名称：：聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及应用。
背景技术：
：基因治疗被科学家寄望成为未来解决疑难病症的重要医疗手段，然而如何将治疗基因片段高效传递至病灶细胞内一直饱受困扰。目前广泛应用于临床的病毒类载体存在着重大的安全隐患，造成了基因治疗历史上首例患者死亡事件以及著名的法国"气泡婴儿"事件。相对于病毒类基因载体的不安全性，人工合成的阳离子聚合物由于其无免疫源性，分子设计多样，尺寸可控并能够连接靶向物质逐渐成为该领域的研究热点。在众多已经报道的聚阳离子载体中，聚乙烯亚胺(PEI)由于其具有独特的"质子海绵效应"能够实现高效的基因传递而倍受关注[参见Boussif0,ZantaM.A,BehrJ.P,etal.Aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinv/vo—polyethylenimine.PAWS,1995;92:7297-7301]。PEI的转染性能强烈依赖于分子量，普遍使用分子量25000的PEI(PEI25k)作为转染载体。PEI的优点在于电荷密度集中，对基因物质有强的复合能力，在低氮磷比(N/P)比即能获得最佳转染效率。但是单纯使用均聚物PEI作为基因载体，往往受限于其不可降解性和高的细胞毒性。聚乙二醇(PEG)因为其优异的抑制非特异性吸附能力和良好生物相容性，在已有的报道中经常被应用于阳离子基因载体的修饰[参见PetersenH,FechnerP.M,FischerD,KisselT.Synthesis,characterization,andbiocompatibilityofpolyethylenimine-graft-poly(ethyleneglycol)blockcopolymers.M/crawo/ecwfes,2002;35:6867-6874]。各种研究表明经PEG修饰后，PEI与基因物质的纳米颗粒复合物能避免自身凝聚，降低颗粒大小，有效拮抗血清对转染的抑制，降低红细胞的聚集。PEG化可以屏蔽复合物颗粒表面的正电荷，增加其在体内高盐环境中的稳定性，降低细胞毒性。聚碳酸酯是一种具有良好生物相容性并可实现生物体内降解的高分子材料，其中一些带有功能化基团的聚碳酸酯已经被广泛报道应用于药物释放载体(参考文献HuX丄，ChenX.S,LiuS,ShiQ,JingX.B.Novelaliphaticpoly(ester-carbonate)withpendantallylestergroupsanditsfolicacidfiinctionalization.Jowma/尸o/y附erSdewce:尸"W爿..尸o/;/附erC7je附/对/^,2007;1852-1861]。)
发明内容为了解决已有技术存在的问题，本发明的目的在于提供聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及应用。所合成的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物为可降解阳离子聚合物，未见文献报道。聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物兼具了聚乙二醇、聚碳酸酯与聚乙烯亚胺的优点，克服了PEI均聚物高毒性、不可降解性的缺点。聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物是具有良好的生物相容性，能够有效地拮抗血清对转染的抑制的高效基因传递载体。本发明提供的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物的结构式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中，PEI为聚乙烯亚胺，结构为线型或者支化，其结构式如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>其中聚合度m、n、a、b和c均等于或者大于l。聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物的制备步骤和条件如下(1)按照聚乙二醇单甲醚(mPEG)与2-甲基-2-苄氧羰基碳酸丙烯酯(MBC)的摩尔配比为1:101:100，将两者投料到干燥的反应器中，以mPEG和MBC的总质量g与甲苯的体积ml的配比为1:550加入无水甲苯，在13(TC共沸除水至少2小时，共沸除水完成后，控温13015(TC蒸出部分甲苯，以mPEG和MBC的总质量g与剩余的甲苯的体积ml的配比为1:220，作为蒸馏结束点；将催化剂二乙基锌以浓度为0.050.5mmol/ml溶解在无水甲苯中，以二乙基锌与MBC单体的摩尔配比1:100300加入二乙基锌/甲苯溶液，控温100130。C搅拌反应至少12小时，反应完成后在正己垸中沉降，过滤，干燥滤饼，得到聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-苄氧羰基碳酸丙烯酯嵌段共聚物(mPEG-6-PMBC);按照mPEG-6-PMBC质量g与四氢呋喃体积ml的配比1:550，将两者混合溶解后一起投料到反应釜中；再按照四氢呋喃与甲醇体积配比为25:1量取甲醇，以催化剂氢氧化钯/碳与mPEG-6-PMBC质量配比1:210称取氢氧化钯/碳均匀悬浮在甲醇中，然后一起投料至反应釜中；充入氮气，加氢至压力0.5，反应完成后，过滤除去氢氧化钯/碳，滤液在乙醚中沉降，过滤，干燥滤饼，得到聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物(mPEG各PMCC);(2)按照mPEG-WPMCC质量g与二甲亚砜体积ml的配比为1:10100，将两者投料到反应器中，搅拌溶解，以mPEG-6-PMCC中的羧基与聚乙烯亚胺的摩尔配比为l:14，将聚乙烯亚胺加入至反应器中，再按照mPEG-6-PMCC中的羧基与l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HC1)的摩尔配比为l:12，将EDC.HC1也加到反应器中，控温203(TC，搅拌反应至少2小时，反应完成后，将反应液装入截留分子量为10005000的透析袋中对去离子水透析至少24小时，将透析后的液体冷冻干燥，得到聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物(mPEG-6-PMCC-g-PEI，简称聚乙二醇-聚碳酸酯接枝聚乙烯亚胺共聚物)。以下介绍聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物在体外转染中作为基因传递载体。其用法的步骤和条件如下(1)细胞的培养细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的培养液中，在37。C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中连续培养；(2)体外转染I无血清转染转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基稀释，按每孔1乂104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37。C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%,转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，加入基因组转染的复合物颗粒以及无血清的DMEM培养基至终体积20(HU/孔，继续培养4小时后，吸弃细胞培养板中的培养液，更换200^1/孔含有体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM培养液，继续培养20小时；II含血清转染转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔(DMEM)培养基稀释，按每孔1乂104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37"C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，加入基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基至终体积200pl/孔，继续培养24小时；(3)体外转染效率的测定取出培养板，吸去培养液，用PBS洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率；(4)细胞毒性测试采用噻唑蓝(MTT)比色法比较评价基因载体材料的细胞毒性；实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM培养基稀释，按每孔lX104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37°(:含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度到达80~90%，将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20pl含质量分数为0.5Q/。MTT的PBS溶液，混合物在37'C继续作用4小时，加入200^d二甲基亚砜溶解MTT甲臢结晶10分钟，然后用酶标仪测试每孔的吸收值，测试波长选用492nm，细胞存活率按下公式计算细胞存活率(e/。h(A^pie/Ac。自i)X100As^^是转染后的细胞样品孔的吸收值，Ac。ntrd是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收值，每组实验重复三次。聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物在体内转染中作为基因传递载体。其用法的步骤和条件如下取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞的细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，随机分为两组，每组9只，分别在瘤内注射含5jiig荧光素酶质粒的基因组转染的复合物颗粒溶液lOOpl;第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果；在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉，麻醉5分钟后，向小鼠体内注入20(Hil荧光素酶底物，IO分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。有益效果所制备的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物是一种聚阳离子基因载体，集成了聚乙二醇、聚碳酸酯和聚乙烯亚胺各自的优点，转染效率高，其在同等条件下对非洲绿猴肾细胞细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为美国Invitrogen生物公司商业转染试剂Lipofectamine2000的14倍，并能够有效地拮抗血清对转染的抑制作用，细胞毒性小，其浓度在不高于200微克/毫升范围内，细胞存活率在80%以上。本发明所制备的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物具有低毒并可生物降解性，因为其所选用的聚乙二醇-聚碳酸酯接枝骨架具有良好的生物相容性，在生理条件下可自行降解、崩溃和代谢，进而被生物体吸收或排出体外，对人体无毒副作用。本发明所合成的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物在基因传递上有很高的使用价值，有广泛的应用前景。图1为对比不同载体材料在系列浓度下的细胞毒性测试结果图。测试细胞选用非洲绿猴肾细胞(Cos-7细胞)，测试浓度为0200微克/毫升，测试材料分别为聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物的代表PPP-11、PPP-14和PPP-17以及PEI25k和商业转染试剂Lipofectamine2000，测试结果以处理后的细胞存活率(％)来表示。具体实施例方式实施例1:聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物的制备分别按照表1所列投料量，称取数均分子量为5000的聚乙二醇单甲醚(mPEG5(KK))与2-甲基-2-节氧羰基碳酸丙烯酯(MBC)，将两者投料到不同的干燥的反应器中，分别加入300ml的无水甲苯130。C共沸除水5小时，共沸除水完成后，控温13(TC蒸出部分甲苯，以剩余的甲苯的体积为50ml作为各自蒸馏结束点；将催化剂二乙基锌以摩尔浓度0.2mmol/ml溶解配置在无水甲苯中，分别按照表l中的二乙基锌投料量加入二乙基锌/甲苯溶液至相应的反应器中，并遵照表1中的聚合温度和聚合时间分别进行各自的搅拌反应，反应完成后分别在正己垸中沉降，过滤，干燥滤饼，得到聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-苄氧羰基碳酸丙烯酯嵌段共聚物(mPEG-6-PMBC);将各自的中间产物mPEG-6-PMBC分别溶解在100ml的四氢呋喃中，并投料到不同的反应釜中，分别称取表1中所示相应投料量的氢氧化钯/碳催化剂，并各自均匀悬浮在30ml甲醇中，投料至相应的反应釜中，充入氮气，再分别依照表1中相应的氢气压力充入氢气，并依照表1所示的氢化温度和氢化时间分别进行各自的搅拌反应，反应完成后，过滤除去氢氧化钯/碳，滤液分别在乙醚中沉降，过滤，干燥滤饼，得到聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物(mPEG-Z)-PMCC)，使用核磁共振谱分析产物数均分子量(Mn)，结果见表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例2:聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物的制备分别按照表2中所列出的mPEG-6-PMCC的种类称取相应的投料量，与表2中所述的相应反应体积的二甲亚砜一起投料到不同的反应器中，搅拌溶解，再依照表2所示的聚乙烯亚胺(PEI)种类和投料摩尔量，分别称取PEI并加入相应的反应器中，再按照表2所示的投料摩尔量，分别称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HC1)也加到相应的反应器中，控温25°C，分别依照表2中反应时间，各自进行搅拌反应，反应完成后，将反应液分别装入截留分子量为3500的透析袋中对去离子水透析72小时，最后分别将透析后的液体冷冻干燥，得到聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物(mPEG-6-PMCC-g-PEI),简称PPP，使用核磁共振谱分析产物数均分子量(Mn)，结果见表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例3:聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物介导荧光素酶质粒对非洲绿猴肾细胞(Cos-7细胞)的体外转染1、Cos-7细胞的培养取Cos-7细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的培养液中，在37'C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中连续培养。2、体外转染(1)无血清转染转染前24小时内，取对数生长期Cos-7细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔1X104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37'C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到8090%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，更换200^0/孔不含有胎牛血清的新鲜DMEM培养液，再选用荧光素酶质粒(pGL3)为报告基因，分别加入PPP-ll/pGL3、PPP-14/pGL3、PPP-17/pGL3、PEI25k/pGL3以及商业化转染试剂Lipofectamine2000/pGL3的复合物颗粒进行转染对比，培养4小时后，吸弃细胞培养板中的培养液，更换200^0/孔含有体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM培养液，继续培养20小时。(2)含血清转染转染前24小时内，取对数生长期Cos-7细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔1X104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37"C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%。转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后，更换200^0/孔含有体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM培养液，再选用荧光素酶质粒(pGL3)为报告基因，分别加入PPP-ll/pGL3、PPP-14/pGL3、PPP-17/pGL3、PEI25k/pGL3以及商业化转染试剂Lipofectamine2000/pGL3的复合物颗粒进行转染对比，继续培养24小时。3、体外转染效率的测定胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，使用照度计测定转染效率，表示为每毫克蛋白的发光单元数(RLU/mgProtein)。表3介导荧光素酶质粒的体外转染效率<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>本发明中的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物是一种非常高效的基因传递载体材料，并且具有拮抗血清对转染的抑制作用。表3分别给出了体外转染实验中PPP-ll、PPP-14、PPP-17、PEI25k与Lipofectamine2000的最佳转染效率，通过对比可以看出本发明中PPP-ll、PPP-14和PPP-17所代表的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物具有更高的转染效率；并且通过转染时有血清与无血清实验结果的对比，可以看出PPP-ll、PPP-14和PPP-17所代表的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物能够有效拮抗血清对转染的抑制作用，相对于无血清转染，PPP-11、PPP-14和PPP-17转染效率(RLU/mgProtein)绝对值在有血清转染时下降为45%、52%、58%，而PEI25k与Lipofectamine2000却分别下降为9%、11%。实施例10:聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物的细胞毒性测试1、Cos-7细胞的培养取Cos-7细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的培养液中，在37'C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中连续培养。2、毒性测试采用MTT的方法比较评价不同浓度PPP-ll、PPP-14、PPP-17、PEI25k和商业转染试剂Lipofectaminem2000的材料细胞毒性。实验前24小时内，取对数生长期的Cos-7细胞，胰酶消化后用DMEM稀释，按每孔1乂104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37'C含体积分数为5。/。二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达至|」80~90%。将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入20pl含质量分数为0.5。/。MTT的PBS溶液。混合物在37。C继续作用4小时，加入200pl二甲基亚砜溶解MTT甲臢结晶10分钟。然后用酶标仪测试每孔的吸收值，测试波长选用492nm。细胞存活率按下公式计算细胞存活率(G/。—(Asampie/Ac。ntr。l)X100As^^是转染后的细胞样品孔的吸收值，Ac。ntr。!是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收值，每组实验重复三次，测试结果见图l。通过图l我们可以看出不同浓度下各种载体材料处理后的细胞存活率。相对于PEI25k和Lipofectamine，2000，本发明中PPP-ll、PPP-14和PPP-17所代表的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物是一种对细胞毒性很小的转染试剂。实施例11:聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物介导体内转染实验取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，随机分为两组，每组9只，分别在瘤内注射含5pg荧光素酶质粒(pGL3)的PPP-14/pGL3、PPP-17/pGL3与Lipofectamine2000/pGL3复合物颗粒溶液10(^1。第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果。在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉。麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200]Lil荧光素酶底物。IO分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。结果表明PPP-14和PPP-17所代表的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物比Lipofectamine2000具有更高的转染效率。权利要求1、聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物，其特征在于，其结构式如下PEI为聚乙烯亚胺，结构为线型或者支化，其结构式如下所示其中聚合度m、n、a、b和c均等于或者大于1。2、如权利要求1所述的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物的制备方法，其特征在于步骤和条件如下(1)按照聚乙二醇单甲醚与2-甲基-2-苄氧羰基碳酸丙烯酯的摩尔配比为l:101:100，将两者投料到干燥的反应器中，以聚乙二醇单甲醚和2-甲基-2-节氧羰基碳酸丙烯酯的总质量g与甲苯的体积ml的配比为1:550加入无水甲苯，在13(TC共沸除水至少2小时，共沸除水完成后，控温130150'C蒸出部分甲苯，以聚乙二醇单甲醚和2-甲基-2-节氧羰基碳酸丙烯酯的总质量g与剩余的甲苯的体积ml的配比为l:220，作为蒸馏结束点；将催化剂二乙基锌以浓度为0.050.5mmol/ml溶解在无水甲苯中，以二乙基锌与2-甲基-2-节氧羰基碳酸丙烯酯单体的摩尔配比1:100300加入二乙基锌/甲苯h2溶液，控温10013(TC搅拌反应至少12小时，反应完成后在正己'烷中沉降，过滤，干燥滤饼，得到聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-节氧羰基碳酸丙烯酯嵌段共聚物；按照聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-苄氧羰基碳酸丙烯酯嵌段共聚物质量g与四氢呋喃体积ml的配比1:550，将两者混合溶解后一起投料到反应釜中；再按照四氢呋喃与甲醇体积配比为25:l量取甲醇，以催化剂氢氧化钯/碳与聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-节氧羰基碳酸丙烯酯质量配比1:210称取氢氧化钯/碳均匀悬浮在甲醇中，然后一起投料至反应釜中；充入氮气，加氢至压力0.52MPa，控温4060°C，搅拌反应2472小时，反应完成后，过滤除去氢氧化钯/碳，滤液在乙醚中沉降，过滤，干燥滤饼，得到聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物；(2)按照聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物质量g与二甲亚砜体积ml的配比为1:10100，将两者投料到反应器中，搅拌溶解，以聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物中的羧基与聚乙烯亚胺的摩尔配比为l:14，将聚乙烯亚胺加入至反应器中，再按照聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯中的羧基与l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔配比为l:12，将l-(3-二甲氨基丙萄-3-乙基碳二亚胺盐酸盐也加到反应器中，控温203(TC，搅拌反应至少2小时，反应完成后，将反应液装入截留分子量为10005000的透析袋中对去离子水透析至少24小时，将透析后的液体冷冻干燥，得到聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物。3、如权利要求1所述的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物的应用，其特征在于，其在体外转染中作为基因传递载体。4、如权利要求3所述的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物在体外转染中作为基因传递载体的用法，其特征在于步骤和条件如下(1)细胞的培养细胞置于含体积分数为10%胎牛血清的培养液中，在37。C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中连续培养；(2)体外转染I无血清转染转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1乂104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37'C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到80~90%，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，加入基因组转染的复合物颗粒以及无血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200^tl/孔，继续培养4小时后，吸弃细胞培养板中的培养液，更换20(^1/孔含有体积分数为10%胎牛血清的新鲜达尔伯克改良伊格尔培养基，继续培养20小时；II含血清转染转染前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔1乂104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37'C含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度达到8090%，转染时，吸弃前一天加注的细胞培养板中的培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，加入基因组转染的复合物颗粒以及含有体积分数为10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基至终体积200^1/孔，继续培养24小时；(3)体外转染效率的测定取出培养板，吸去培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，加入细胞裂解液裂解，然后加入荧光素酶底物，用照度计测定转染效率；(4)细胞毒性测试采用噻唑蓝比色法比较评价基因载体材料的细胞毒性；实验前24小时内，取对数生长期细胞，胰酶消化后用达尔伯克改良伊格尔培养基稀释，按每孔lX104细胞的密度接种于96孔培养板，置于37°0含体积分数为5%二氧化碳的孵箱中继续培养至汇合度到达80~90%，将不同浓度的材料与细胞共同培养24小时后，每孔分别加入2(^1含质量分数为0.5%噻唑蓝的磷酸盐缓冲液，混合物在37'C继续作用4小时，加入200pl二甲基亚砜溶解噻唑蓝甲臢结晶10分钟，然后用酶标仪测试每孔的吸收值，测试波长选用492nm，细胞存活率按下公式计算.-细胞存活率(c/。MAsampie/Ac。:^)X100Asan^是转染后的细胞样品孔的吸收值，Ac。ntr。i是不与复合物溶液作用的细胞样品孔的吸收值，每组实验重复三次。5、如权利要求1所述的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物的应用，其特征在于，其在体内转染中作为基因传递载体。6、如权利要求5所述的聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物在体内转染中作为基因传递载体的用法，其特征在于步骤和条件如下取5周的巴比赛裸鼠，在腹侧皮下接种人宫颈癌上皮细胞的细胞株，待肿瘤直径长至0.4cm后，随机分为两组，每组9只，分别在瘤内注射含5pg荧光素酶质粒的基因组转染的复合物颗粒溶液100^1，第二天重复注射一次，注射后48小时，用精诺真活体成像仪观测体内转染效果，在进行活体成像观察之前，将小鼠麻醉，麻醉5分钟后，向小鼠体内注入200^il荧光素酶底物，IO分钟后，用活体成像系统观察体内转染效果。全文摘要本发明涉及聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及应用。将聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯嵌段共聚物中的羧基与聚乙烯亚胺中的氨基通过水溶性碳二亚胺直接缩合形成接枝共聚物。所述的共聚物是一种聚阳离子基因载体，集成了聚乙二醇、聚碳酸酯和聚乙烯亚胺的优点，转染效率高，其在同等条件下对非洲绿猴肾细胞介导荧光素酶质粒的转染效率最高为美国Invitrogen生物公司转染试剂Lipofectamine<sup>TM</sup>2000的14倍，并能够有效地拮抗血清对转染的抑制作用，细胞毒性小，其浓度在不高于200微克/毫升范围内，细胞存活率在80％以上。文档编号C08G81/00GK101638484SQ20091006742公开日2010年2月3日申请日期2009年8月24日优先权日2009年8月24日发明者景遐斌,琳林,田华雨,郭兆培,杰陈,磊陈,陈学思,黄宇彬申请人:中国科学院长春应用化学研究所