专利名称：一种透明质酸与琼脂糖凝胶连接的方法
技术领域：
本发明涉及一种透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接的方法，属于有机化学合成领域。
背景技术：
透明质酸广泛存在于人和动物的结缔组织中。各种测定方法的不断涌现，使透明质酸含 量测定达到精确的程度，清楚地反映出类风湿性关节炎、肝病、某些肿瘤和硬皮病患者样品 内透明质酸均明显增高，尤其透明质酸测定在肝硬化诊断上优于所有常规肝功试验，肝硬化 患者血清中透明质酸较正常人升高10-100倍。国内有人报导在慢性肝病、肝硬化中，透明质 酸增高幅度大于in型前胶原肽和板层素(LamPl),在慢性活动性肝炎组中透明质酸增高大于III 型前胶原肽，在迁延性肝炎中则与对照组无差别。因此，透明质酸测定是一项极有价值的肝 病诊断指标。在人或动物体内，存在多种可与透明质酸特异性结合的蛋白质，主要分布在基质和细胞 膜上，统称为透明质酸结合蛋白。透明质酸结合蛋白可以用来测定人体内透明质酸的含量，主要原理是其反应体系是先将样品和透明质酸结合蛋白(限量)结合，再加入1251标记的透明 质酸，竞争剩余透明质酸结合蛋白，再加入第一抗体，即抗透明质酸结合蛋白，最后加入相 应第二抗体，以使复合物沉淀，测定沉淀放射性计数。透明质酸结合蛋白分布广泛，利用其 与透明质酸的结合特性，可以将其从大量蛋白中分离，再进行凝胶电泳，即可得到纯化的透 明质酸结合蛋白；也可以利用透明质酸-琼脂糖凝胶进行一次性反应。后者所需要的透明质酸 -琼脂糖凝胶需要将透明质酸连接到琼脂糖凝胶上，反应比较复杂， 一般的方法效果不佳。发明内容本发明的目的在于提供一种可以将透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接的方法，步 骤简单，成本较低。本发明的原理是透明质酸分子上含有羧基，可以与己二酸二酰肼的酰肼基进行反应， 反应后还可以保留一个酰肼基，这个酰肼基可以与活化后的琼脂糖凝胶分子上的醛基反应， 相当于将透明质酸通过己二酸二酰肼连接到琼脂糖凝胶上。本发明通过以下技术方案得以实现透明质酸与己二酸二酰肼反应，合成透明质酸-己二酸二酰肼衍生物；使用高碘酸钠对琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行活化，得到含有醛基的琼脂糖凝胶；将透明质酸-己二酸二酰肼衍生物与含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行反应， 最后用硼氢化钠还原，得到透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物。其具体步骤为1、 透明质酸-己二酸二酰肼衍生物的制备将透明质酸溶于双蒸水中，加入10倍透明质 酸质量的己二酸二酰肼，搅拌，用0.1M的HCl调节pH值4.0-5.5，加入5倍透明质酸质量的 L(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用0.1M的HCl调节pH值，使之维持在 4.0-5.5，反应2小时后，用1M的NaOH调节pH值至7.0。将反应后产物用双蒸水透析，透 析4次，每次1升双蒸水透析18小时，透析后冷冻干燥。2、 含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B的制备将琼脂糖凝胶Sepharose 4B用蒸馏水洗 净，加入1/5琼脂糖凝胶Sepharose 4B体积的新配制的0.2M的NaI04，室温搅拌反应5小时， 反应后的凝胶用蒸馏水洗净。3、 透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物的制备将冷冻干燥后的透明质酸-己二酸 二酰肼衍生物加入双蒸水中溶解，溶解后倒入5倍体积的含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B 中，室温搅拌12-16个小时，按1毫克/毫升琼脂糖凝胶Sepharose 4B体积慢慢加入硼氢化钠 粉末，继续搅拌2小时后，用双蒸水洗净。本方法所获得的产物与琼脂糖凝胶Sepharose 4B外观一致，为有弹性的半透明凝胶微球， 可以用于提取透明质酸结合蛋白。本发明的有益效果是反应条件温和，步骤简单，成本低廉。
具体实施方式
结合具体实施例说明本发明。实施例一1、 透明质酸-己二酸二酰肼衍生物的制备称取100毫克透明质酸，溶于50毫升双蒸水 中，加入l克己二酸二酰肼，搅拌，用0.1M的HCl调节pH值5.0，加入0.5克EDC，用0.1M 的HCl调节pH值，使之维持在5。反应2小时后，用1M的NaOH调节pH值至7.0。将反 应后产物用双蒸水透析，透析4次，每次1升双蒸水透析18小时，透析后冷冻干燥。2、 含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B的制备量取50毫升琼脂糖凝胶Sepharose 4B， 用蒸馏水洗净，加入10毫升新配制的0.2M的Na104，室温搅拌反应5小时，反应后的凝胶 用蒸馏水洗净。3、 透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接衍生物的制备称取20毫克冷冻干燥后的透 明质酸-己二酸二酰肼衍生物，加入10毫升双蒸水中，溶解后倒入含有醛基的琼脂糖凝胶 Sepharose 4B 50毫升中，室温搅拌12小时，慢慢加入50毫克硼氢化钠粉末，继续搅拌2小。 实施例二1、 透明质酸-己二酸二酰肼衍生物的制备称取lg透明质酸，溶于500毫升双蒸水中， 加入10克己二酸二酰肼，搅拌，用0.1M的HCl调节pH值5.0，加入5克EDC，用0.1M的 HCl调节pH值，使之维持在5。反应2小时后，用1M的NaOH调节pH值至7.0。将反应后 产物用双蒸水透析，透析4次，每次1升双蒸水透析18小时，透析后冷冻干燥。2、 含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B的制备量取500毫升琼脂糖凝胶Sepharose 4B， 用蒸馏水洗净，加入100毫升新配制的0，2M的Na104，室温搅拌反应5小时，反应后的凝胶 用蒸馏水洗净。3、 透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物的制备称取200毫克冷冻干燥后的透明 质酸-己二酸二酰肼衍生物，加入100毫升双蒸水中，溶解后倒入含有醛基的琼脂糖凝胶 Sepharose 4B 500毫升中，室温搅拌16小时，慢慢加入500亳克硼氢化钠粉末，继续搅拌2 小时后，用双蒸水洗净。
权利要求
1、一种透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接的方法，其特征在于包含以下步骤A透明质酸与己二酸二酰肼合成透明质酸-己二酸二酰肼衍生物；B用高碘酸钠对琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行活化，得到含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B；C将透明质酸-己二酸二酰肼与含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行反应，用硼氢化钠还原，得到透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于透明质酸-己二酸二酰肼衍生物的制备过称是 将透明质酸溶于双蒸水中，加入10倍透明质酸质量的己二酸二酰肼，搅拌，用0.1M的 HC1调节pH值4.0-5.5，加入5倍透明质酸质量的l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐 酸盐，用0.1M的HCl调节pH值，使之维持在4.0-5.5，反应2小时，用lM的NaOH调 节pH值至7.0，将反应后产物用双蒸水透析，透析后冷冻干燥。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征是含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B的制备过称 是将琼脂糖凝胶Sepharose 4B用蒸馏水洗净，加入1/5琼脂糖凝胶Sepharose 4B体积的 新配制的0.2M的Na104，室温搅拌反应5小时，反应后的凝胶用蒸馏水洗净。
4、 根据权利要求1所述的方法，其特征是透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物的制 备将冷冻千燥后的透明质酸-己二酸二酰肼衍生物加入双蒸水中溶解，溶解后倒入5倍 体积的含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B中，室温搅拌12-16个小时，按1毫克/毫升琼 脂糖凝胶Sepharose 4B体积慢慢加入硼氢化钠粉末，继续搅拌2小时后，用双蒸水洗净。
5、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于双蒸水透析过程为透析4次，每次l升双蒸水透 析18小时。
全文摘要
本发明属于有机化学合成领域，涉及一种透明质酸与琼脂糖凝胶连接的方法，其步骤为透明质酸与己二酸二酰肼合成透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，用高碘酸钠对琼脂糖凝胶Sepharose 4B进行活化，得到含有醛基的琼脂糖凝胶，将透明质酸-己二酸二酰肼与含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose 4B用硼氢化钠还原，得到透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose 4B连接物。本发明反应条件温和，步骤简单，成本低廉。
文档编号C08G81/00GK101591441SQ20091006791
公开日2009年12月2日 申请日期2009年2月23日 优先权日2009年2月23日
发明者董全文 申请人:协和生物制药(天津)有限公司