专利名称：包含非荷电性亲水性嵌段以及侧链的一部分引入了疏水性基团的阳离子性聚氨基酸嵌段 ...的制作方法
技术领域：
本发明 涉及嵌段共聚物，以及由该共聚物和核酸分子形成的复合体，尤其涉及胶 束型粒子，所述嵌段共聚物包含亲水性聚合物链嵌段以及侧链的一部分引入了疏水性基团 的阳离子性聚氨基酸链嵌段。
背景技术：
以小干扰RNA(SiRNA)、反义寡聚核苷酸为代表的具有生理活性的核酸医药品，被 期待用作针对癌症、病毒性疾病等的新一代治疗药。但是，这些核酸本质上在生物体内不稳 定，并且生物利用率低，因此目前其应用受到限制。为了将核酸医药品应用于更广泛疾病的 治疗，需要能够全身给药的有效且安全的核酸传递系统(参照下述非专利文献1和2)。已 知病毒载体可高效地将核酸传递至靶部位，但因免疫原性、致癌性等而使其临床应用受到 限制(参照下述非专利文献3和4)。因此，由阳离子性聚合物、阳离子性脂质构成的非病毒 载体逐渐受到关注(参照下述非专利文献5和6)。阳离子性聚合物通过静电相互作用与核酸形成复合体，但正因此而在能够有效传 递至靶的粒径的控制和在血液中的稳定性方面存在问题，因此提出了在阳离子性聚合物上 结合聚乙二醇(PEG)等生物体亲和性高的水溶性高分子的方法(参照下述专利文献1、专利 文献2、专利文献3、非专利文献7及8)。这些复合体形成具有含PEG的亲水性壳体与结合 有核酸的芯体的芯-壳型粒子，因而能够控制粒径，但有报告说这种复合体在用于静脉给 药时，会迅速从血液中消除(参照下述非专利文献9和10)，因而期待更加稳定的复合体。概括来说，专利文献1记载了例如将包含亲水性片段和荷电性片段的嵌段共聚物 作为荷电分子即DNA的靶传递用载体，但由该共聚物所形成的核酸复合体有时存在如上所 述的血液中的稳定性问题。专利文献2为了改善上述问题，具体而言，为了使水性溶剂中的 由该嵌段共聚物的多个分子所形成的高分子胶束稳定等，而在该嵌段共聚物的荷电片段中 引入巯基，以使该聚合物分子间形成二硫键。并且，专利文献3中提供了例如通过聚-L-赖 氨酸的侧链的ε-氨基，而引入作为亲水基的PEG链与作为疏水性基团的棕榈酰基而得的 接枝聚合物。另一方面，提出了将作为侧链的疏水性基团即胆固醇，接枝在一端引入了 PEG链 的阳离子性聚合物(例如，PEG化的聚(N-甲基二乙烷胺癸二酸酯、N-methyl diethanamine sebacate))上，以使聚合物胶束稳定的方法(参照下述非专利文献11)。该文献中虽未报 道对血中滞留性的评价，但认为粒子会因疏水性基团的引入而受到一定程度的稳定。但是， 配制该聚合物需要采用非常严格的条件(120°C、24小时)，并且发生聚合物的分解，因此认 为难以稳定控制聚合物的分子量、以及PEG和胆固醇的引入率。此外，该方法中，必须在pH 值为4. 6的酸性条件下配制与核酸的复合体，而DNA在这样的酸性条件下不稳定(参照下 述非专利文献12)。从这些方面出发，在使用该聚合物时可能会产生制剂方面的问题。此 夕卜，该文献所使用的PEG的分子量最大为2000，并且聚合物中的PEG含量为1. 8 8. 2%。认为在该条件下，亲水性壳体的形成不充分，与DNA的复合体的粒径为200nm以上，较大，并 且粒子的ζ电位(zeta potential)反映了芯体的性质，显示为负值或者正值。该性质成 为实现高血中滞留性的障碍(参照下述非专利文献6以及13 17，其也包含与该技术领域 相关的其它信息)。专利文献1 日本特开平8-188541号公报专利文献2 日本特开2001-146556号公报专利文献3 :W0 99/61512
非专利文献1 :C. D. Novina, et al.，Nature, 2004，430，161-164.非专利文献 2 Pun, et al. , Journal of Cellular Biochemistry, 2006,98, 14-35.非专利文献3 :R. G. Crystal，et al.，Science，1995，270，404-410.非专利文献4 :S. K. Tripathy，et al. , Nature Medicine，19962，545-550.非专利文献 5:A.de Fougerolles, et al. , Nature Review Drug Discovery, 2007，6，443-453.:S. Akhtar, et al. , Journal of Clinical Investigation, 2007, 117,3623-3632.非专利文献 7 :R.M· Schiffelers，et al.，Nucleic Acids Research, 2004, 32, el49.非专利文献 8 :S. Hu-Lieskovan, et al.，Cancel Research, 2005，65，8984-8992.非专利文献9 :H. K. de Wolf, et al. , International Journal of Pharmaceutics, 2007,331,167-175.:J. D. Heidel,et al. ,proceedings of the National Academy of Sciences,2007，104，5715-5721.非专利文献11 Y. Wang，et al. , Biomaterials, 2007, 28, 5358-5368.非专利文献 12 :Ε· Walter，et al. , Journal of Controlled Release, 1999,61, 361-374.非专利文献 13 :C. Nicolazzi，et al. , Journal of Controlled Release, 2003， 88,429-443.# 专禾I」JC ^ 14 :B. Thompson, et al. , Bioconjugate Chemistry, 2005,16, 608-614.非专利文献 15 :D. Oupicky, et al.，Gene Therapy, 2001,8, 713-724.非 专利 文献 16 :Y. Takakura, et al.，International Journal of Pharmaceutics,1994，105，19-29.非专禾丨J文献 17 :Y. Yamasaki, et al.，Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics，2002，301，467—477.
发明内容
如上所述，至今仍在对病毒载体以外的核酸的载体进行各种各样的研究开发或 努力。但是，仍然存在对能够有效用作医疗用材料并且能够将核酸有效传递至目标的载体(vectors或carriers)的需要。例如，非专利文献11中所记载的PEG化的聚(N-甲基 二乙烷胺癸二酸酯)-共聚-((胆固醇基氧代羰基酰胺乙基)甲基双(亚乙基)溴化铵癸 二 酸酉旨((cholesteryloxocarbonylamidoethyl)methylbis (ethylene) ammonium bromide sebacate))所形成的胶束型粒子具有一定的稳定性，但是，从提供能够容易确立医药品用 材料所要求的材料均质性、以及药品本身的均质性的体系的观点出发，进一步的改良受到 期待。本发 明的一部分发明人等，按照上述专利文献2的记载，明确了通过在该共聚物 分子间形成二硫键(形成共价键)，可大幅提高由共聚物所形成的高分子胶束(或者胶束型 粒子)的稳定性。但是，为了实现材料的多样性，本发明人等探索了更多不同的核酸传递用 材料。结果发现，专利文献2所记载的包含非荷电性亲水性聚合物链嵌段以及阳离子性 聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物，与非专利文献11所记载的共聚物之间的结构虽有本质区 另|J，但在聚氨基酸重复单元(unit)的侧链的一部分引入疏水性基团进行修饰的嵌段共聚 物，能够赋予高分子胶束以下情况以上的优点，即，在上述嵌段共聚物分子的聚合物主链之 间进行二硫键结合的情况。由此，本发明提供嵌段共聚物，其是包含非荷电性亲水性聚合物链嵌段以及阳离 子性聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物，亲水性聚合物链嵌段通过共价键而结合在该聚氨基酸 链嵌段的主链的任意一方的末端，并且，疏水性基团通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌 段中氨基酸单元的10%以上、70%以下的侧链上。另外，本发明还提供上述共聚物与核酸的复合体。
图1是实施例2中合成的PPLCl的1H NMR的谱图。应予说明，图中a为来自聚乙 二醇的亚甲基的峰，b为来自胆固醇基中的甲基的峰。图2是实施例2中合成的PPLSl的1H NMR的谱图。应予说明，图中a为来自聚乙 二醇的亚甲基的峰，b为来自硬脂酰基中的甲基的峰。图3是使用PPLCl PPLC4以及PEG-P (Lys)的各聚合物和siRNA，得到的在各N/ P比下形成的粒子溶液的电泳结果的照片(其中，N/P比为0是指仅siRNA进行了电泳的泳 道)。图4是表示通过动态光散射法测定的使用PPLCl PPLC4以及PEG-P (Lys)的各 聚合物和siRNA形成的聚集物的多分散度(PDI)的图。图5是表示通过动态光散射法测定的使用PPLCl PPLC4以及PEG-P (Lys)的各 聚合物和siRNA形成的聚集物的累积量粒径(diameter)的图。图6是表示通过动态光散射法测定的使用PPLC2以N/P比为6而与siRNA形成的 粒径分布的直方图。图7表示由PPLC2与siRNA构成的聚集体的ζ电位(zeta potential)的测定结 果的图。图8表示对使用PPLC2以N/P比为6而配制的粒子、使用PPLSl与siRNA以N/P 比为6而配制的粒子、以及未粒子化的siRNA(空白(naked))在给药后1小时的血中滞留性进行评价的结果的9表示对使用PPLCl 4以及PEG-PLys以N/P比为6而配制的粒子、以及未粒 子化的siRNA(空白)在给药后2小时的血中滞留性进行评价的结果的图。图10表示对使用PPLZ以N/P比为8而配制的粒子、使用PPLZb以N/P比为8而 配制的粒子、以及未粒子化的siRNA(空白)在给药后2小时的血中滞留性进行评价的结果 的图。图11表示对使用PPLC2以N/P比为6而配制的粒子、以及未粒子化的siRNA(空 白)在给药后15分钟 4小时的血中滞留性进行评价的结果的图。
具体实施例方式本发明所使用的用语或者技术用语，如没有特别说明则可以理解为具有该技术领 域所使用的常用含义。非荷电性亲水性聚合物链嵌段，来自于包含聚乙二醇(或者聚(氧乙烯))的水溶 性聚合物。聚氨基酸链嵌段可以来自于选自聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚高精氨酸、 或聚组氨酸中的聚合物。上述非荷电性亲水性聚合物链嵌段的分子量，只要嵌段共聚物可 形成内包药物的高分子胶束，则没有特殊限定，但约为2500 200，OOODa，优选为5，000 20，OOODa,更优选为8，000 15，OOODa，氧乙烯的重复单元的数量为55 4，500的整数，优 选为110 450，更优选为180 340的整数。作为嵌段共聚物的另一种嵌段的聚氨基酸链嵌段，可以包含来自于选自聚赖氨 酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚高精氨酸、或聚组氨酸中的聚合物的重复单元，或者可以由该重 复单元组成。这些嵌段是该重复单元为10 100的整数，优选为20 80的整数，更优 选为20 60的整数。该聚氨基酸链嵌段的氨基酸残基中，相当于全部重复单元数量(η 表示整数)的10% 70%数量的氨基酸残基，将疏水性基团担载于其侧链上。担载疏水 性基团的氨基酸残基在聚氨基酸嵌段中可以任意配置，例如可以列举无序或者随机配置 的情况、以及作为嵌段配置的情况(即，由聚乙二醇嵌段、担载疏水性基团的聚氨基酸的 嵌段以及不担载疏水性基团的聚氨基酸的嵌段所形成的三嵌段的情况)。作为疏水性基 团，可列举留醇衍生物的残基或者C4_24烃基。留醇是指以环戊酮氢菲环(cyclopentanone hydrophenanthrene ring)为基础的天然、半合成或者合成的化合物，例如，作为天然的甾 醇没有限定，但可列举胆固醇、胆留烷醇、二氢胆留醇、胆酸等；作为其半合成或合成的化合 物，可以是它们的天然物的例如合成前体(根据需要，在存在的情况下，包含一定的官能基 团、部分或全部羟基被该技术领域公知的羟基保护基保护、或者羧基被羧基保护基保护的 化合物)。另外，留醇衍生物是指在不影响本发明目的的范围内，可以在环戊酮氢菲环中引 入Ch2烷基、卤原子例如氯、溴、氟，该环系统可以为饱和、部分非饱和等。留醇衍生物的残 基优选为胆固醇、胆留烷醇、二羟基胆留醇的3位羟基的氢原子被除去后的基团。进一步优 选为胆固醇的3位羟基的氢原子被除去后的基团。C4_24烃基所谓的烃基是指，由碳原子和 氢原子构成，直链或支链的C4_24，优选为C12_24烷基；直链或支链的C4_24，优选为C12_24烯基； 直链或支链的C4_24，优选为C12_24炔基；C4_24，优选为C12_24的笼状化合物，例如金刚烷基等；以 及芳基烷基，芳基是苯基或者萘基，烷基为C1 C5，例如可列举苄基等。但优选为，直链或 支链的C4_2(1，更优选为C12_2(1烷基；直链或支链的C4_2(1，优选为C12_2(1烯基；以及苄基。应予说明，上述烯基和炔基上可含有多个不饱和键。作为这种嵌段共聚物的更具体的例子，可列举通式I或II所表示的共聚物。
权利要求
嵌段共聚物，其是含有非荷电性亲水性聚合物链嵌段以及阳离子性聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物，其中，亲水性聚合物链嵌段通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段的主链的任意一方的末端，并且，疏水性基团通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段中的氨基酸单元的10％以上、70％以下的侧链上。
2.权利要求1所述的嵌段共聚物，其中，非荷电性亲水性聚合物链嵌段，来自于包含聚 乙二醇(或聚(氧乙烯))的水溶性聚合物；聚氨基酸链嵌段来自于选自聚赖氨酸、聚鸟氨 酸、聚精氨酸、聚高精氨酸、聚组氨酸中的聚合物，并且疏水性基团为留醇衍生物残基或者 C4-24烃基。
3.权利要求1所述的嵌段共聚物，由通式I或通式II所表示， A-(OCH2CH2)m -L- [ (COCHNH) χ / (COCHNH)y ] —Ζ
4.权利要求3所述的嵌段共聚物，其中，留醇衍生物残基来自选自胆固醇、胆留烷醇、 二羟基胆留醇、胆酸中的化合物。
5.权利要求3所述的嵌段共聚物，其中，烃基选自C12_2(l烷基。
6.权利要求3所述的嵌段共聚物，其中，烃基选自苯基、萘基和包含苯基和C1 C5的 焼基的方基焼基。
7.核酸与权利要求1 6中任一项所述的嵌段共聚物的复合体。
8.权利要求7所述的复合体，其中，核酸选自寡聚或多聚双链RNA、寡聚或多聚双链 DNA、寡聚或多聚单链DNA、以及寡聚或多聚单链RNA。
9.权利要求8所述的复合体，其中，核酸选自质粒DNA、siRNA、微RNA、反义核酸、诱饵 核酸、适体以及核酶。
10.权利要求7 9中任一项所述的复合体，其具有芯_壳型高分子胶束结构，芯部内 包有核酸。
11.权利要求7 10中任一项所述的复合体，其特征在于含有嵌段共聚物和核酸，以 使“嵌段共聚物中的阳离子残基的摩尔浓度”/ “核酸中的磷酸基的摩尔浓度”定义的N/P 比为1 50。
12.权利要求7 11中任一项所述的复合体，其是平均粒径为10 300nm的粒子。
全文摘要
本发明公开了嵌段共聚物，其是含有非荷电性亲水性聚合物链嵌段以及阳离子性聚氨基酸链嵌段的嵌段共聚物。该嵌段共聚物中，亲水性聚合物链嵌段通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段的主链的任意一方的末端，并且，疏水性基团通过共价键而结合在该聚氨基酸链嵌段中的氨基酸单元的10％以上、70％以下的侧链上。本发明提供该共聚物与作为小分子核酸的siRNA形成的在生理条件下稳定的聚集体。
文档编号C08L89/00GK101970541SQ200980108470
公开日2011年2月9日 申请日期2009年3月6日 优先权日2008年3月10日
发明者H·金, 加藤泰己, 宫田完二郎, 武元宏泰, 片冈一则, 石井笃史, 西山伸宏 申请人:国立大学法人东京大学