专利名称：土壤杆菌ZX09,用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖及其制备方法及在降低血糖上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物及微生物胞外多糖技术领域，特别是一种土壤杆菌 Agrobacteriumsp. ΖΧ09,该菌生产的新型水溶性β -葡聚糖分子及其制备方法和在降低血 糖上的应用。
背景技术：
葡聚糖广泛地分布于真菌、细菌和植物体内，目前药用、食用菌β-葡聚糖主 要来源于食用、药用担子真菌和子囊酵母菌的细胞壁，谷物中的葡聚糖主要存在于燕 麦和大麦胚乳的细胞壁中，从这些物质中提取葡聚糖的工艺较复杂，且产量较低。葡聚糖不仅在各种生物体内发挥多种生物学活性，而且在各种生物间的相 互影响过程中也具有多种功能，是高效的生物反应调节因子(BRM)。据报道，β-葡聚糖 具有抗肿瘤、抗氧化等功能，长时间食用含葡聚糖的食物能够降低高胆固醇的人血 液中的胆固醇，燕麦中提取的β-葡聚糖可降低糖尿病人的餐后血糖(Jenkins，A. L.， D. J. A. Jenkins, U. Zdravkovic, P. Wiirsch and V. Vuksan. 2002. Depression of the glycemic index byhigh levels of β -glucan fiber in two functional foods tested in type 2diabetes. EuropeanJournal of Clinical Nutrition 56,622-628)。然而，β-葡 聚糖功效的发挥需要一定溶解度、空间结构和合适的分子量的支撑。很多葡聚糖的水 溶性较低，例如，可得然胶是由土壤杆菌或产碱杆菌产生的一种水不溶的凝胶多糖型葡聚 糖，它由D-葡萄糖残基经β-葡萄糖苷键在Cl，C3线性连接而成(Kim，Μ. K.，K. Ε. Ryu, W. A. Choi, Y. H. Rhee,andl. Y. Lee. 2003. Enhanced production of (1 — 3)-β-D-glucan by a mutant strain ofAgrobacterium species. Biochem. Eng. J. 16 163-168)；香对 肿瘤有抑制作用，但它在水中的溶解度也不高。而非水溶性的葡聚糖进入人体后很难被直 接吸收，使其应用范围收到极大的限制。为解决这一难题，很多学者研究了 β “葡聚糖的衍生化来提高它的水溶性和生 物活性，如在对从虎奶菌(Pleurotus tuber-regium)中提取的β-葡聚糖进行硫酸化 前后抗肿瘤活性的变化研究中，发现硫酸化后多糖溶解度增大，同时抗肿瘤能力也相应 的增力口(Lina Zhang，Mei Zhang，Jing Dong，Ji Guo, Yinyin Song，Peter Chi keung Cheung. 2001. Chemical structure and chain conformation of the water-insoluble glucan isolated fromPleurotus tuber-regium. Biopolymers 59 :457_464·张俐娜，张 玫，张志强，黄荣春。虎奶菇葡聚糖硫酸酯在水溶液中的链构象及构效关系。2003年全国高 分子学术论文报告会)。另外，在中国专利(CN:1583802A)中对非水溶性酵母β -(1，3)-葡 聚糖通过甲酸降解，得到不同分子量的可溶于水的β_(1，3)_葡聚糖。但所有这些解决方 法都增加了获得所需葡聚糖的难度，使制备成本大大提高，限制了在生产领域中的大 规模使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产水溶性β -葡聚糖的土壤杆菌(Agrobacterium sp. ZX09)。本发明的另一目的是提供一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性高粘度β -葡聚糖 及其制备方法。本发明的目的还在于提供一种用土壤杆菌ΖΧ09生产的水溶性高粘度β -葡聚糖 在降低血糖上的应用。实现本发明目的的技术解决方案为一种土壤杆菌ΖΧ09，在山东东营的盐土中分 离得到菌株，此菌株为土壤杆菌属菌株(Agrobacterium sp.)，菌株已于2010年1月21日 在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO :M2010020o一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β -葡聚糖，结构通式如下所示— {3) -beta-D-Glup- (1 — 3) - [beta-D-Glup- (1 — 3) -beta-D-Glup-] 3-a Ipha-D-G Iup- (1 — 3)_alpha_D_Glup_(l}n —上述结构中的η为100 200。一种用土壤杆菌ΖΧ09生产的水溶性β -葡聚糖的制备方法，步骤如下(1)配置培养液将 NaH2PO4 0. 5%。-2. 5%。，KNO3 2%。-4%。，CaCl2 0. 07%。-0. 15%, MgCl2 0. 2 %0 -0. 5 %o, FeSO4 · 7Η20 0. 005 %0 -0. 0125 %0，MnSO4 0. 001 %0 -0. 003 %0， ZnCl2O. 005% -0. 0075%,NaCl 0_7%，蔗糖 2% -4%溶于 H2O 中，ρΗ 为 5-11，以上盐浓度为 质量比；(2)将培养液加热110-121 灭菌15-30分钟，然后冷却；(3)向步骤(2)中冷却至30-37°C的灭菌后的培养液内加入平皿菌落液，在28°C 30°C发酵24-48h形成种子培养液；(4)向步骤(2)中冷却至30-37°C的灭菌后的培养液内加入步骤(3)中获得的种 子培养液，在28°C 30°C发酵48 72h ；(5)向第(4)步得到的发酵液内注入超过发酵液两倍体积的乙醇、丙酮或异戊醇， 沉淀得到粗多糖；(6)对粗多糖去蛋白后得到纯品。一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β -葡聚糖的应用，将利用土壤杆菌ΖΧ09生 产的葡聚糖应用于降低血糖。本发明与现有技术相比，其显著优点(1)菌株新颖，性质独特，可耐盐生长，生长 过程中不分泌色素；(2)菌种的培养操作简便，工艺简单，培养基为全合成培养基，成份明 确，成本低，适宜于工业化生产；(3)所得的葡聚糖为新结构多糖化合物；(4) β-葡聚 糖提取方法简便，所得的葡聚糖可直接溶于冷水；(5)对小鼠喂食混有淀粉的多糖，能 有效控制餐后血糖的升高。下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
图1是菌株的平板菌落、显微照片和耐盐生长情况。图2是葡聚糖组分测定的气相色谱图。
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图3是葡聚糖的高碘酸氧化结果。图4是葡聚糖的红外光谱。图5是葡聚糖的核磁共振谱。图6是小鼠喂养多糖后的血糖变化图。土壤杆菌的菌株已于2010年1月21日在中国典型培养物保藏中心保存(CCTCC)， 保藏单位的地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M2010020，其生物材料的分类命名为(Agrobacterium sp. ZX09)。
具体实施例方式本发明土壤杆菌(Agrobacterium sp. ZX09)是在山东东营的盐土中分离得到。该 菌株具有以下特点a.形态特征在无机盐琼脂平板培养基上28 °C培养本菌株3_5天后观察，菌落呈 白色、圆形，表面光滑，边缘整齐，菌株分泌大量的胞外多糖。b.生理生化特征能有效还原硝酸盐，不能降解纤维素，不分泌色素。能够在7% 的NaCl发酵液中生长，在含2% NaCl的发酵液中生长速度最快。以蔗糖或乳糖为碳源能很 好地生长，可疑利用碳源为D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、或D-木糖，不能利用碳源为麦芽 糖。发酵48小时后的发酵液最高粘度可达到20000mPa 's(NDJ-l RotationalViscometer, Rotor为3，RPM为6，上海天平仪器厂)。图1中，A为平板培养基上的菌落，B为细菌的显 微镜照片，C为菌株在不同盐浓度的培养液中震荡培养后的相对生长率。c. 土壤杆菌的16S DNA序列见序列表。d.此菌株为土壤杆菌属菌株。本发明从土壤杆菌ZX09的菌株中提取出大分子的胞外水溶性β-葡聚糖，结构通 式如下所示— {3) -beta-D-Glup- (1 — 3) - [beta-D-Glup- (1 — 3) -beta-D-Glup-] 3-a Ipha-D-G Iup- (1 — 3)_alpha_D_Glup_(l}n —上述结构中的η为100 200。上述β-葡聚糖的特性如下a.多糖组分为单一葡萄糖。图2为气相色谱图。同一组分在同一位置出峰。A图 为水解后的ZX09产多糖的出峰情况，单一的峰说明多糖由单一组分组成。B图中水解多糖 与甘露糖混合后出现了两个的峰，而C图中水解多糖与葡萄糖混合后只有一个峰，这就说 明了组成多糖的单一组分就是葡萄糖。该多糖为葡聚糖。b.高碘酸不能氧化多糖，见图3。葡聚糖有不同的连接方式。在与高碘酸盐反应 时，以1 — 2或1 — 4位键合的糖基，平均每个糖基消耗一分子高碘酸；以1 — 6位键合的 糖基或非还原末端基，消耗两分子高碘酸，而1 — 3位键合的糖基，不消耗高碘酸。可溶性 淀粉是以1 — 4位键合的葡聚糖，以可溶性淀粉作参照，对ZX09生产的葡聚糖进行高碘酸 氧化，发现可溶性淀粉消耗了高碘酸盐，而ZX09生产的葡聚糖不消耗高碘酸盐，这说明该 葡聚糖的糖基均以1 — 3位键合。c.多糖的红外光谱见图4，该高聚物并无衍生基团存在。d.多糖的核磁共振谱见图5。1H NMR中，有两个信号，表明葡聚糖中存在alpha构象(δ 5. 1-5. 3ppm)和 beta 构象(δ 4. 92-4. 96ppm) ； 13C NMR 谱中，低场 δ 106. 4，105. 75， 105. 69，105. 51，105. 37，105. 31，105. 14，99. 59，99. Olppm处的峰，表征了 C-I 的beta构象， 而高场δ 98，96ppm处的峰，表征了 C-I的alpha构象本发明利用土壤杆菌ZX09生产水溶性β -葡聚糖，其步骤包括如下a.配置培养液将 NaH2PO4 0. 5% -2. 5%。，KNO3 2% -4%。，CaCl2 0. 07% -0. 15%, MgCl2O. 2 % -0. 5 %o, FeSO4 · 7H20 0. 005 %0 -0. 0125 %0，MnSO4 0. 001 %0 -0. 003 %0， ZnCl2O. 005% -0. 0075%,NaCl 0_7%，蔗糖 2% -4%溶于 H2O 中，pH 5-11,以上盐浓度为质量比。b.将培养液加热110_121°C灭菌15-30分钟，然后冷却；c.向步骤b中冷却至30_37°C的培养液内加入平皿菌落液；d.在28°C 30°C发酵步骤c中已接种的培养液24_48h形成种子培养液；e.向步骤b中冷却至30-37°C的培养液内加入种子培养液；f.将步骤e中已接种的培养液在28°C 30°C发酵48 72h ；h.向步骤f中获得的发酵液内注入超过发酵液两倍体积的乙醇、丙酮或异戊醇， 得到粗多糖；i.得到的粗多糖去蛋白后得到纯品。通过上述方法制备的葡聚糖的水溶液有很高的粘度，使其具有广泛的应用价 值。利用土壤杆菌ΖΧ09生产的葡聚糖为活性成分的制剂在食品、饮料以及降低餐后血 糖水平上的应用。如该葡聚糖或葡聚糖与淀粉混合后，对禁食后的小鼠进行灌喂，检测 不同时间的餐后血糖值。图6中只喂食淀粉的小鼠餐后血糖值明显高于喂食含有本发明 β-葡聚糖的食物的小鼠。实施例1配置培养液，NaH2PO40. 5g, KNO3 2g, CaCl2 0. 07g, MgCl2 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 005g,MnSO4 0. OOlgjZnCl2 0. 005g，蔗糖 20g，H2OlOOOmL,pH 5.0。将培养液加热 121°C灭 菌15分钟，冷却至30°C接入平皿菌落液200μ ，28 培养24h，为种子液。向灭过菌(121°C 灭菌15分钟)并冷却至30°C的培养液中加入2%的种子培养液，28°C发酵48h。在该发酵 液中加入两倍体积的乙醇，得到β-葡聚糖粗品。禁食15小时的小鼠，直接喂食多糖ZOOmg/kg—1或喂食混有淀粉的多糖200mg/ kg_\能有效控制餐后血糖的上升。实施例2配置培养液，NaH2PO40. 5g, KNO3 2g, CaCl2 0. 07g, MgCl2 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 0075g, MnSO4 0. 002g, ZnCl2 0. 005g, NaCl 20g，蔗糖 20g，H2OlOOOmL, pH 7.2。将培养液 加热121°C灭菌15分钟，冷却至30°C接入平皿菌落液100μ L，28°C培养24h，为种子液。向 灭过菌(121°C灭菌15分钟)并冷却至30°C的培养液中加入10%的种子培养液，28°C发酵 72h。向发酵液内加入两倍体积的95%乙醇，得沉淀即为粗多糖，将沉淀取出，重新溶解于水 中，利用sevag法去蛋白3次。去蛋白的上清液中再加入2倍体积乙醇，沉淀多糖，并将该沉 淀再次溶解于水。得到的多糖水溶液经过DEAE-32纤维素和琼脂糖凝胶S印harose CL-4B 分离后，乙醇沉淀，干燥，即得纯化的多糖。实施例3
配置培养液，NaH2PO41. 0g, KNO3 2. 5g, CaCl2 0. 07g, MgCl2 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 0075g, MnSO4 0. 002g, ZnCl2 0. 005g,NaCl 20g，蔗糖 30g，H2OlOOOmL, pH 7. 2，将培养液加 热121 °C灭菌15分钟，冷却至30°C接入平皿菌落液200 μ L，30 V培养24h，为种子液。向灭 过菌(121°C灭菌15分钟)并冷却至30°C的培养液中加入4%的种子培养液，28°C发酵48h。 向发酵液内加入两倍体积的95%乙醇，得沉淀即为粗品，将沉淀取出，重新溶解于水中，利 用sevag法去蛋白3次。去蛋白的上清液中再加入2倍体积乙醇，沉淀多糖，并将该沉淀再 次溶解于水。得到的多糖水溶液经过DEAE-32纤维素和琼脂糖凝胶S印harose CL-4B分离 后，乙醇沉淀，干燥，即得纯化的多糖。实施例4配置培养液，NaH2PO41. 5g, KNO3 3g, CaCl2 0. 07g, MgCl2 0. 4g, FeSO4 · 7H20 0. 0075g, MnSO4 0. 002g, ZnCl2 0. 005g,NaCl 20g，蔗糖 40g，H2OlOOOmL, pHll，将培养液加热 121°C灭菌15分钟，冷却至30°C接入平皿菌落液100 μ L，28°C培养24h，为种子液。向灭过 菌(121°C灭菌15分钟)并冷却至30°C的培养液中加入10%的种子培养液，30°C发酵48h。 向发酵液内加入两倍体积的95%乙醇，得沉淀即为粗品，将沉淀取出，重新溶解于水中，利 用利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法去蛋白。去蛋白的上清液中再加入2倍体积乙醇， 沉淀多糖，并将该沉淀再次溶解于水。得到的多糖水溶液经过DEAE-32纤维素和琼脂糖凝 胶S印harose CL-4B分离后，乙醇沉淀，干燥，即得纯化的多糖。实施例5配置培养液，NaH2PO42. 5g, KNO3 4g，CaCl2 0. 15g, MgCl2 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. 0125g, MnSO4 0. 003g, ZnCl2 0. 0075g, NaCl 70g，蔗糖 40g，H2OlOOOmL, pH 7. 2，将培养液 加热110°C灭菌30分钟，冷却至30°C接入平皿菌落液100 μ L，28°C培养24h，为种子液。向 灭过菌(121°C灭菌15分钟)并冷却至30°C的的培养液中加入5%的种子培养液，30°C发酵 72h，向该发酵液内加入两倍体积的95%乙醇，得沉淀即为粗品。小鼠喂食同实施例1。
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权利要求
一种土壤杆菌ZX09，其特征在于在山东东营的盐土中分离得到菌株，此菌株为土壤杆菌属菌株(Agrobacterium sp.)，菌株已于2010年1月21日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NOM2010020，该菌株具有以下特点a.形态特征在无机盐琼脂平板培养基上28℃培养本菌株3 5天后观察，菌落呈圆形，菌株分泌大量的胞外多糖；b.生理生化特征能有效还原硝酸盐，不能降解纤维素，不分泌色素，能够在7％的NaCl发酵液中生长，在含2％NaCl的发酵液中生长速度最快；以蔗糖或乳糖为碳源能很好地生长，可疑利用碳源为D 葡萄糖、D 果糖、D 甘露糖或D 木糖，不能利用碳源为麦芽糖。
2.根据权利要求1所述的土壤杆菌ZX09，其特征在于土壤杆菌(Agrobacteriumsp. ZX09) 16S rDNA 序列为atgcagtcgaCCgCCCCgggaggggagtggcagacgggtgagtaacgggtggcaacctac60cctttcctgcggaatacctccggaaaactggaattaacaccgcatcccccctagggggga120aatatttatcggggaaggattgccccgcgttgtattagctagttgggggggaaacggcct180accaaggcgaccatccatagctgggctgagaggatgatccgcctcgttgggactgacccc240ccccccaccctcctacgggaggcagcgggggaaaatattgaacgatgggcgcacgcctga300tcccgccctgccgggtgagtgaagaaggccttagggttgtaatcttttttcaccgatgaa360aataatgacggtagtcaaaaaagaccccccggctaacttcctgccagccgccgcgataat420acgaagggggctagtgttgttcagaattactgggcgtaaagcgcacgtaggcgtttattt480aagtgggggaagaaatcccgcagctcaactgcggaactgtctttgatgctgggtatgttg540aggatggaagaggtaagtggaattccgagtgtagaggagaaattcgtatatattcggagg600accaccagtggcgaaggcttcttactggtccattactgacgctgaggtgcgaaagcgtgg660ggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgttagccgtc720gggcagtatactgttcggtggcgcagctaacgcattaaacattccgcctggggagtacgg780tcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggt840ttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagctcttgacattcggggtatgggcattgg900agacgatgtccttcagttaggctggccccagaacaggtgctgcatggctgtcgtcagctc960gtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgcccttagttgccag1020catttagttgggcactctaaggggactgccggtgataagccgagaggaaggtggggatga1080cgtcaagtcctcatggcccttacgggctgggctacacacgtgctacaatggtggtgacag1140tgggcagcgagacagcgatgtcgagctaatctccaaaagccatctcagttcggattgcac1200tctgcaactcgagtgcatgaagttggaatcgctagtaatcgcagatcagcatgctgcggt1260gaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccg1320aaggtagtgcgctaaccgcaaggaggcagctaaccac1357
3. 一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性葡聚糖，其特征在于结构通式如下所示 —⑶-beta-D-Glup- (1 — 3) - [beta-D-Glup- (1 — 3) -beta-D-Glup-] 3-alpha-D_Glup-(1 — 3)-alpha-D-Glup-(l}n — 上述结构中的η为100 200。
4.一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β -葡聚糖的制备方法，步骤如下(1)配置培养液将NaH2PO4O. 5 %0 -2. 5 %0’ ΚΝ032 %0 ~4 %0’ CaCl2O. 07 %0 -0. 15 %0’ MgCl2O. 2 % -0. 5 %o, FeSO4 · 7Η200· 005 %0 -0. 0125 %0，MnSO4O. 001 %0 -0. 003 %0， ZnCl2O. 005% -0. 0075%, NaClO-7%，蔗糖 2% -4%溶于 H2O 中，pH 为 5-11，以上盐浓度为 质量比；(2)将培养液加热110-121°C灭菌15-30分钟，然后冷却；(3)向步骤(2)中冷却至30-37°C的灭菌后的培养液内加入平皿菌落液，在28°C 30°C发酵24-48h形成种子培养液；(4)向步骤(2)中冷却至30-37°C的灭菌后的培养液内加入步骤(3)中获得的种子培 养液，在28°C 30°C发酵48 72h ；(5)向第(4)步得到的发酵液内注入超过发酵液两倍体积的乙醇、丙酮或异戊醇，沉淀 得到粗多糖；(6)对粗多糖去蛋白后得到纯品。
5.一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖的应用，其特征在于将利用土壤杆菌 ΖΧ09生产的β -葡聚糖应用于降低血糖。
全文摘要
本发明公开了一种土壤杆菌ZX09，用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖及其制备方法及在降低血糖上的应用。其中土壤杆菌ZX09在山东东营的盐土中分离得到菌株，此菌株为土壤杆菌属菌株(Agrobacterium sp.)，菌株已于2010年1月21日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NOM2010020。用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖，结构通式如下所示→{3)-beta-D-Glup-(1→3)-[beta-D-Glup-(1→3)-beta-D-Glup-]3-alpha-D-Glup-(1→3)-alpha-D-Glup-(1}n→，上述结构中的n为100～200。本发明菌株新颖，性质独特，可耐盐生长，生长过程中不分泌色素；菌种的培养操作简便，工艺简单，培养基为全合成培养基，成份明确，成本低，适宜于工业化生产。
文档编号C08B37/02GK101935623SQ20101014637
公开日2011年1月5日 申请日期2010年4月14日 优先权日2010年4月14日
发明者修爱慧, 张建法, 朱斌 申请人:南京理工大学