专利名称：胶乳致敏的方法及试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及胶乳致敏的方法及试剂。更特别地，本发明涉及先通过化学键将胶乳与无关蛋白结合，再使用戊二醛将抗原或抗体交联在无关蛋白上，从而使胶乳致敏的方法。 本发明还涉及利用该方法获得致敏的胶乳及使用了该致敏的胶乳的胶乳增强免疫比浊试剂。
背景技术：
1956年Singer和plotz开始使用直径为微米级的粒子，通过附着在胶乳上的抗原或抗体对血清中的抗体或抗原进行定性的玻片凝集法检测。在此基础上发展起来的胶乳增强免疫比浊法提高了普通免疫比浊法的灵敏度，而且操作简单，可以使用普通生化分析仪测定，是一种新的临床诊断方法。在胶乳增强免疫比浊试剂中，胶乳的致敏，也就是将抗原或抗体与胶乳相结合，这一步是制备试剂中最重要的步骤。胶乳的致敏，通常有物理吸附法和化学交联法。物理吸附法是靠蛋白质分子结构上的疏水基团与胶乳表面的疏水基团间的相互作用，将抗原或抗体吸附到胶乳表面。化学交联法是通过抗原或抗体与胶乳表面的化学基团反应，将抗原或抗体交联在胶乳上。化学交联法由于特异性好、易保存、分散性良好等特点，现已广泛应用于体外诊断试剂中。但是化学交联法会由于化学反应造成抗原或抗体在交联过程中活性丧失，影响试剂的灵敏度。化学交联法通常采取的步骤是，先将抗原或抗体通过化学键直接交联在胶乳上使其致敏，再加入BSA、聚乙二醇等蛋白质或多聚体封闭胶乳表面未结合的位点，整个反应一般在两天及两天以上，时间较长。而且，由于这个反应的条件较强烈且反应时间较长，抗原或抗体的活性损失较大，导致反应的灵敏度也受到较大的影响。所以，需要一种反应更温和、更快速的胶乳致敏的方法和试剂。
发明内容
因此，本发明的技术目的在于寻找一种反应更温和、更快速的胶乳致敏的方法和试齐LU因此，本发明的第一方面涉及一种胶乳致敏的方法，其特征在于先通过化学键将胶乳与无关蛋白结合，再使用戊二醛将抗原或抗体交联在无关蛋白上，从而使胶乳致敏，其中所述无关蛋白是指水溶性的且不与所述抗原或抗体发生免疫反应的蛋白，优选地，所述无关蛋白选自BSA或血蓝蛋白，优选地，所述胶乳为聚苯乙烯胶乳。优选地，所述化学键通过聚苯乙烯胶乳表面的化学基团与无关蛋白的相应化学基团形成，优选地，化学基团选自羧基、磺酸基或羟基。优选地，所述抗原选自天然抗原、基因重组抗原、化学合成抗原或多肽的一种或多种。优选地，所述抗体选自多克隆抗体或单克隆抗体中的一种或多种。优选地，所述聚苯乙烯胶乳的粒径为50-200nm。
优选地，胶乳在反应体系中的浓度无特别限制，优选0. 1 2%重量体积比，更优选0. 5 重量体积比；和/或，无关蛋白在反应体系中的浓度无特别限制，优选0. 05 ang/ml，更优选0. 1 0. 3mg/ml ；和/或，反应条件优选在4 40°C，更优选在25 37°C 反应0. 5 Ihr ；和/或，反应在有缓冲作用的缓冲液中进行的，所述缓冲液选自MES缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲液，优选MES缓冲液，pH5. 5-7 ；和/或，结合有无关蛋白的胶乳浓度无特别限制，优选0. 1 2%重量体积比，更优选0.2 重量体积比；和/或，抗原或抗体在反应体系中的浓度无特别限制，优选0. 05 ang/ml，更优选0. 1 0. 2mg/ml ；和/ 或，戊二醛在反应体系中浓度优选0. 001% 0. 02%重量体积比，更优选0. 001 0. 008% 重量体积比；和/或，反应条件优选在4 40°C，更优选在25 37°C反应0. 5 !3hr。本发明的第二方面涉及一种胶乳，其中，所述胶乳使用如上所述的胶乳致敏的方法致敏，优选地，所述胶乳为羧基修饰的聚苯乙烯胶乳先利用羧基结合BSA，然后利用戊二醛将基因重组链球菌溶血素0抗原结合在BSA上获得的胶乳。本发明的第三方面涉及一种胶乳增强免疫比浊试剂，其中，所述胶乳使用根据上述胶乳致敏的方法致敏。优选地，所述胶乳增强免疫比浊试剂为抗链球菌溶血素0胶乳增强免疫比浊试剂，其包含试剂R1、试剂R2，试剂Rl为含有盐离子的缓冲液，试剂R2为交联了链球菌溶血素0抗原的致敏胶乳溶液，优选地，所述链球菌溶血素0抗原为基因重组链球菌溶血素0抗原，优选地，所述胶乳为羧基修饰的聚苯乙烯胶乳。优选地，所述盐离子为一价金属离子和二价金属离子中的一种或几种，优选地，所述盐离子选自钠离子和/或镁离子，更优选地，所述盐离子为Na离子；优选地，所述盐离子在反应体系中的浓度优选10 300mM，更优选100 200mM ；和/或，胶乳在反应体系中的浓度在0. 08 0. 2%重量体积比。优选地，所述试剂R1、R2的缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸缓冲液，优选地，所述试剂R1、R2的缓冲液是甘氨酸缓冲液，优选地，所述试剂R1、R2 的缓冲液的pH在6. 5 9之间，更优选地，所述试剂Rl、R2的缓冲液的pH在8 8. 6之间；和/或，所述试剂Rl、R2含有表面活性剂、防腐剂、多聚体，优选地，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，更优选地，所述非离子表面活性剂选自TWEEN系列、SPAN系列、TRITON 系列，优选地，所述防腐剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、PC300中的一种或几种，优选地，所述多聚体选自PEG系列、PVP系列。优选地，所述抗链球菌溶血素0胶乳增强免疫比浊试剂的成分如下试剂Rl 甘氨酸缓冲液浓度为 0. 01-0. 5M ρΗ8· 4，优选 0. 05-0. 2ΜρΗ8· 4，NaCl 浓度为 10-600mM，优选 100-500mM，更优选 200-400mM，Tween 20 浓度为 0.01% -1% 重量体积比，优选0. 02-0. 5 %重量体积比，更优选0. 05 % -0. 2 %重量体积比，PEG6000浓度为 0. 01-5%重量体积比，优选0. 1-3. 5%重量体积比，更优选0. 5-3%重量体积比，NaR浓度为 0.01% -1%重量体积比，优选0. 02% -0.5%重量体积比，更优选0. 05% -0.2%重量体积比；试剂R2 甘氨酸缓冲液浓度为0. 01-0. 5M ρΗ8· 4，优选0. 05-0. 2ΜρΗ8· 4，致敏胶乳浓度为0.01% -1%重量体积比，优选0.2% -0.5%重量体积比，更优选0. -0.3% 重量体积比，BSA浓度为0.01% -2%重量体积比，优选0. -1%重量体积比，更优选0. 2% -0.6%重量体积比，NaR浓度为0.01% -I%重量体积比，优选0. 02% -0. 5%重量体积比，更优选0. 05% -0.2%重量体积比。其中所述致敏胶乳为羧基修饰的聚苯乙烯胶乳先利用羧基结合BSA，然后利用戊二醛将基因重组链球菌溶血素0抗原结合在BSA上获得。最优选地，所述抗链球菌溶血素0胶乳增强免疫比浊试剂的成分如下试剂Rl 甘氨酸缓冲液0. IM ρΗ8· 4，NaCl300mM,Tween200.1% 重量体积比，NaN30.1%重量体积比，试剂R2 甘氨酸缓冲液0. IM ρΗ8· 4，致敏胶乳 0. 17%重量体积比，BSA0.5%重量体积比，NaN30.1%重量体积比，其中所述致敏胶乳为羧基修饰的聚苯乙烯胶乳先利用羧基结合BSA，然后利用戊二醛将基因重组链球菌溶血素0抗原结合在BSA上获得。本发明的第四方面涉及一种胶乳增强免疫比浊试剂盒，其中，所述试剂盒使用了如本发明第二方面所述的胶乳或者如本发明第三方面所述的胶乳增强免疫比浊试剂。换言之，本发明提供了一种胶乳致敏的方法，其特征在于先通过化学键将胶乳与无关蛋白结合，再使用戊二醛将抗原或抗体交联在无关蛋白上，从而使胶乳致敏。这样，由于采取了先结合胶乳表面的化学位点，再交联抗原或抗体，使胶乳致敏，因此，一般几个小时就能完成反应，省掉了传统方法中耗时较长的封闭步骤，减少了制备时间，比传统方法节省时间。通过采用戊二醛法交联，由于戊二醛是一种温和的蛋白交联剂，因此在反应中能保持抗原抗体的免疫活性。同时，胶乳和抗原或抗体之间多了无关蛋白的连接，相当于胶乳表面多了一个手臂的连接，增加了抗原或抗体的空间发散度，减少了空间位阻，使抗原抗体反应更加迅速，提高了灵敏度。胶乳是指表面有化学基团修饰的聚苯乙烯胶乳，化学基团可以是羧基、羟基、磺酸基等，优选的胶乳是羧基修饰的聚苯乙烯胶乳，优选的粒径为50-200nm。本发明所使用的无关蛋白无特别限制，满足两个条件即可，一是水溶性蛋白，二是不与交联的抗原抗体发生免疫反应。优选的无关蛋白是BSA、血蓝蛋白等。将胶乳与无关蛋白使用化学键结合后，对胶乳进行离心、清洗、重悬、分散一系列步骤，得到结合有无关蛋白的胶乳。清洗可使用MES缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲液等， 但不限于此。将结合有无关蛋白的胶乳与抗原或抗体使用戊二醛结合后，对胶乳进行离心、清洗、重悬、分散一系列步骤，得到致敏胶乳。清洗可使用MES缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲液等，但不限于此。重悬液可优选甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液等，但不限于此。本发明还提供了使用本方法制备的胶乳增强免疫比浊试剂，特别是使用本方法制备的抗链球菌溶血素0胶乳增强免疫比浊试剂。本发明所述的抗链球菌溶血素0胶乳增强免疫比浊试剂的试剂Rl中，所述盐离子可以为一价金属离子和二价金属离子中的一种或几种，优选钠离子和镁离子，更优选Na离子，其在反应体系中的浓度优选10 300mM，更优选100 200mM。在试剂R2中，交联了链球菌溶血素0抗原的致敏胶乳在反应体系中的浓度在0. 08 0. 2%重量体积比。在本发明中，试剂R1、R2的缓冲液可优选甘氨酸缓冲液，Tris缓冲液、HEPES缓冲液、磷酸缓冲液等，更优选甘氨酸缓冲液，pH在6.5 9之间，更优选8 8.6之间。在试剂Rl、R2中，根据需要还可以含有表面活性剂、防腐剂、多聚体等。本发明的胶乳和胶乳增强免疫比浊试剂可以用于制备胶乳增强免疫比浊试剂盒。本发明所述的胶乳致敏的方法相对于现有技术的胶乳致敏方法节省时间，检测灵敏度提高，增强了胶乳增强免疫比浊法的临床应用价值。
图1 分别采用本发明试剂和市售试剂A，采用奥林巴斯AU400全自动生化分析仪对50份新鲜人血清(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是本发明试剂的测定值；Y轴表示的是A试剂的测定值，相关系数R2 = 0. 9988，回归方程为 y = 0. 981x+5. 864。
具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例实施例1 胶乳与无关蛋白的结合原料羧基修饰的聚苯乙烯胶乳，粒径lMnm，浓度10% (重量体积比)，表面羧基含量为 100 μmol/goEDAC (分析纯，sigma)溶于双蒸水中，配制成5mg/ml溶液，使用前半小时配制。用IOmM MES, pH6. 1缓冲液将胶乳溶液稀释为0. 5 % (重量体积比)，再加入BSA 溶液，使BSA在体系中的浓度达到200ug/ml，最后加入5mg/ml的EDAC溶液，使EDAC在体系中浓度达到75ug/ml，使反应开始。使用恒温水浴锅，保持反应温度37°C，反应时间!3hr。 反应结束后，离心(12000rpm，30min)，再加入起始同量的0. IM PBS, pH7. 4缓冲液，冰浴超声，使胶乳分散，再次离心，将胶乳分散于lOmMTris，pH 8.4(25°C )缓冲液中，胶乳浓度为 0.5% (重量体积比)。实施例2 致敏胶乳的制备向实施例1中的结合有无关蛋白的胶乳溶液中加入链球菌溶血素0抗原。使用的链球菌溶血素0抗原为基因重组产品。加入的抗原在体系中的浓度为lOOug/ml。再加入 2%戊二醛水溶液使反应开始，添加的比例为0. 002%。反应温度25°C，反应时间!3hr，反应结束后，离心(12000rpm，30min)，再加入起始同量的0. IM甘氨酸，pH8. 4缓冲液，冰浴超声， 使胶乳分散，再次离心，将胶乳分散于含有0.5% (重量体积比)BSA的0. IM甘氨酸，pH8.4 缓冲液中保存。
实施例3 抗链球菌溶血素0胶乳增强免疫比浊试剂的制备抗链球菌溶血素0胶乳增强免疫比浊试剂的具体组成如下 试剂Rl 甘氨酸缓冲液0. IM ρΗ8· 4
NaCl300mM
Tween 20 0. 1% (重量体积比)
PEG6000 1 % (重量体积比)
NaN30.1% (重量体积比)
试剂R2 甘氨酸缓冲液0. IM ρΗ8· 4
致敏胶乳(实施例2中制备)0. 17% (重量体积比)
BSA
NaN-
0.5% (重量体积比) 0. 1% (重量体积比)。对照为市售的进口试剂A，其信息如下产品名称抗链球菌0检测试剂盒(免疫比浊法)原理样本中的ASO与超敏化的胶乳颗粒试剂反应，形成免疫复合物，在波长 570nm处检测其浊度的变化，其变化程度与样本中的ASO含量呈正比。试剂Rl':甘氨酸缓冲液试剂R2'含有0. 12% (重量体积比)致敏胶乳的缓冲液。实施例4 试剂测定方法分析方法两点终点法，即试剂Rl 试剂R2用量分别为IOOul和170ul，样本用量 3ul。IOOul试剂Rl加入3ul样本，于37°C 5min后加入170ul试剂R2，即开始读数，反应 5min后读取另一点，检测波长为540nm。使用奥林巴斯AU400自动生化分析仪。采用单点定标方法，标准液采用市售试剂A配套标准液，浓度为500IU/ml。市售试剂A按说明书操作。1相关性试验检测50份新鲜人血清(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，对测定值进行相关分析(结果见图1，X，Y轴均为测定值，单位iu/ml)。相关系数R2 = 0.9988，回归方程为y = 0. 981x+5. 864，结果表明本试剂与市售试剂相关性良好，具有很好的特异性和准确性。2灵敏度试验表1显示本发明试剂和市售试剂A的灵敏度结果，具体操作方法一样。结果显示本发明试剂灵敏度优于市售试剂A。表1 本发明试剂和市售试剂A灵敏度试验结果
权利要求
1.一种胶乳致敏的方法，其特征在于先通过化学键将胶乳与无关蛋白结合，再使用戊二醛将抗原或抗体交联在无关蛋白上，从而使胶乳致敏，其中所述无关蛋白是指水溶性的且不与所述抗原或抗体发生免疫反应的蛋白，优选地，所述无关蛋白选自BSA或血蓝蛋白， 优选地，所述胶乳为聚苯乙烯胶乳。
2.根据权利要求1所述的胶乳致敏的方法，其特征在于所述化学键通过聚苯乙烯胶乳表面的化学基团与无关蛋白的相应化学基团形成，优选地，化学基团选自羧基、磺酸基或羟基。
3.根据权利要求1或2所述的胶乳致敏的方法，其特征在于所述抗原选自天然抗原、基因重组抗原、化学合成抗原或多肽的一种或多种。
4.根据权利要求1至3任一项所述的胶乳致敏的方法，其特征在于所述抗体选自多克隆抗体或单克隆抗体中的一种或多种。
5.根据权利要求1至4任一项所述的胶乳致敏的方法，其特征在于所述聚苯乙烯胶乳的粒径为50-200nm。
6.根据权利要求1至5任一项所述的胶乳致敏的方法，其特征在于胶乳在反应体系中的浓度优选0. 1 2%重量体积比，更优选0.5 重量体积比；和/或，无关蛋白在反应体系中的浓度优选0. 05 2mg/ml，更优选0. 1 0. 3mg/ml ；和/或，反应条件优选在4 40°C，更优选在25 37。C反应0. 5 Ihr ；和/或，反应在有缓冲作用的缓冲液中进行的， 所述缓冲液选自MES缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲液，优选MES缓冲液，pH5. 5-7 ；和/或， 结合有无关蛋白的胶乳浓度优选0. 1 2%重量体积比，更优选0. 2 重量体积比；和 /或，抗原或抗体在反应体系中的浓度优选0. 05 ang/ml，更优选0. 1 0. 2mg/ml ；和/ 或，戊二醛在反应体系中浓度优选0. 001% 0. 02%重量体积比，更优选0. 001 0. 008% 重量体积比；和/或，反应条件优选在4 40°C，更优选在25 37°C反应0. 5 !3hr。
7.一种胶乳，其特征在于所述胶乳使用根据权利要求1至6任一项所述的胶乳致敏的方法致敏，优选地，所述胶乳为羧基修饰的聚苯乙烯胶乳先利用羧基结合BSA，然后利用戊二醛将基因重组链球菌溶血素0抗原结合在BSA上获得的胶乳。
8.一种胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于所述胶乳使用根据权利要求1至6任一项所述的胶乳致敏的方法致敏。
9.根据权利要求8所述的胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于所述胶乳增强免疫比浊试剂为抗链球菌溶血素0胶乳增强免疫比浊试剂，其包含试剂R1、试剂R2，试剂Rl为含有盐离子的缓冲液，试剂R2为交联了链球菌溶血素0抗原的致敏胶乳溶液，优选地，所述链球菌溶血素0抗原为基因重组链球菌溶血素0抗原，优选地，所述胶乳为羧基修饰的聚苯乙烯胶乳。
10.根据权利要求9所述的胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于所述盐离子为一价金属离子和二价金属离子中的一种或几种，优选地，所述盐离子选自钠离子和/或镁离子，更优选地，所述盐离子为Na离子；优选地，所述盐离子在反应体系中的浓度优选10 300mM， 更优选100 200mM ；和/或，胶乳在反应体系中的浓度在0. 08 0. 2%重量体积比。
11.根据权利要求9或10所述的胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于所述试剂Rl、R2 的缓冲液选自甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸缓冲液，优选地，所述试剂 R1、R2的缓冲液是甘氨酸缓冲液，优选地，所述试剂R1、R2的缓冲液的pH在6. 5 9之间，更优选地，所述试剂Rl、R2的缓冲液的pH在8 8. 6之间；和/或，所述试剂Rl、R2含有表面活性剂、防腐剂、多聚体，优选地，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，更优选地，所述非离子表面活性剂选自TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列，优选地，所述防腐剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、PC300中的一种或几种，优选地，所述多聚体选自PEG 系列、PVP系列。
12.根据权利要求9至11任一项所述的胶乳增强免疫比浊试剂，其特征在于所述抗链球菌溶血素0胶乳增强免疫比浊试剂的成分如下试剂Rl 甘氨酸缓冲液0. 01-0. 5M ρΗ8· 4， NaCl10-600mM,Tween 20 0· 01 % _1 %重量体积比， PEG6000 0. 01-5%重量体积比， NaN30. 01% -1%重量体积比，试剂R2 甘氨酸缓冲液0. 01-0. 5M ρΗ8· 4，致敏胶乳 0. 01% -1%重量体积比， BSA0. 01% -2%重量体积比，NaN30. 01% -1%重量体积比，其中所述致敏胶乳为羧基修饰的聚苯乙烯胶乳先利用羧基结合BSA，然后利用戊二醛将基因重组链球菌溶血素0抗原结合在BSA上获得。
13.一种胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于其使用了如权利要求7所述的胶乳或者如权利要求8至12任一项所述的胶乳增强免疫比浊试剂。
全文摘要
本发明涉及胶乳致敏的方法及试剂。具体而言，本发明的胶乳致敏的方法为先通过化学键将胶乳与无关蛋白结合，再使用戊二醛将抗原或抗体交联在无关蛋白上，从而使胶乳致敏。本发明提供了使用本方法制备的抗链球菌溶血素O胶乳增强免疫比浊试剂。使用本发明的方法可以节省试剂的制备时间，同时提高试剂的灵敏度。
文档编号C08H1/00GK102161716SQ20101061528
公开日2011年8月24日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者刘希, 胥敏, 高爱民 申请人:北京九强生物技术股份有限公司