专利名称：用于生物医学用途的生物可降解型水凝胶的制备的制作方法
用于生物医学用途的生物可降解型水凝胶的制备相关专利申请的交叉引用本申请要求申请于2009年1月14日的美国临时专利申请61/193，970的权益，其在此全文参考并入。
背景技术：
基于多糖的生物可降解型水凝胶的制备为本领域所知。当用于人体时，优选使用基于葡聚糖的水凝胶，因为葡聚糖在体内能够降解为葡萄糖，葡萄糖是血液中的养分并且提供能量。通常，将多糖转化为水凝胶的方法是，将含有不饱和基团的多糖如葡聚糖甲基丙烯酸酯，在水相介质中使用光辐照例如UV辐照，在光引发剂的存在下，使不饱和基团进行交联并导致多糖的聚合，从而转化得到水凝胶。常用的光引发剂中，有的能够形成两种自由基(定义为I型)，例如，安息香，有的能够在电子供体存在的条件下进行夺氢反应从而产生自由基(定义为II型)，最常用的光引发剂是米希勒酮，其包括氨基取代部分，并且不需要单独加入电子供体。传统的合成型光引发剂，例如安息香和米希勒酮，会产生有细胞毒性的水凝胶，因此被禁用于生物医学用途。此外，UV辐照还存在损伤皮肤和眼睛的风险。发明简述本发明的目的是，提供可用于生物医学用途的基于葡聚糖的生物可降解型水凝胶，其不含有合成型光引发剂以及合成型电子供体，并且可以使用UV辐照来制备或者可以使用可见光辐照来制备。本发明的方法用于制备不含有合成型光引发剂的适用于生物医学用途的基于葡聚糖的生物可降解型水凝胶，包括的步骤有在具有光引发效应剂量的核黄素以及具有电子供体效应剂量的精氨酸特别是L型精氨酸，或壳聚糖存在的条件下，对不饱和基团取代的多糖进行光辐照，以使得不饱和基团的多糖交联和聚合，并形成水凝胶。精氨酸的来源还可以是精氨酸取代的聚(酯-酰胺)，其在Biomaterials 29 (2008)3269-3277 上的“Biodegradable arginine-based poly (ester-amide)s as non-viral gene delivery regents" 一文中有描述，并在此全文参考并入。本申请中所使用的UV辐照是指光波长小于400nm并位于400nm至IOnm之间的辐照，优选为 350-390nm，例如，使用 365nm 长波 UV 灯(Model XX-15S, 115V，60Hz，0. 68Amp，序列号95-0042-05. CE, 15W，UVP，Upland，加利福利亚州)发射出的紫外光。本申请中所使用的可见光辐照是指波长在400-700nm之间的辐照，例如部分光谱或者全光谱灯发射的，例如荧光灯发射(17瓦，EcoluX，F1718-SP-35-EC0，加拿大)的辐照。发明详述所述多糖的平均分子量的范围优选为30，000至200，000克每摩尔，由GPC测定得到。所述多糖优选为葡聚糖，根据其产品信息以及GPC测定，其平均分子量的范围优选为64，000至76，000克每摩尔；但是，所述分子量可以是使其能够溶于溶剂或水的任何分子
Mo其他可用的多糖包括，例如，直链淀粉，糖原，纤维素，甲壳素，菊糖，琼脂糖，木聚糖(zylans)，甘露聚糖以及半乳聚糖。通过将多糖与亲核催化剂如三乙基胺，存在的条件下与甲基丙烯酸酐，丙烯酸酐， 2-苯基丙烯酸酐，2-氯丙烯酸酐，2-溴丙烯酸酐，衣康酸酐，马来酸酐以及苯乙烯马来酸酐反应，得到不饱和基团。不饱和基团取代的多糖优选为葡聚糖甲基丙烯酸酯。在本申请所描述的工作中， 使用0. 3摩尔浓度的甲基丙烯酸酐，获得了 0. 287的取代度。更高摩尔浓度的甲基丙烯酸酐可得到更高的取代度，而更低摩尔浓度的甲基丙烯酸酐会得到更低的取代度。在光引发剂存在的条件下进行光辐照时，高取代度能产生更多的交联以及强度更高的水凝胶，即在没有外力时不容易破损，而低取代度在光引发剂存在的条件下进行光辐照时产生的交联较少，并且水凝胶更容易破损。研究表明，取代度>0.6的葡聚糖甲基丙烯酸酯不溶于水，从而不能用于制备水凝胶。据总结，0. 287的取代度能够在前体的水溶性和水凝胶的抗破损性两方面获得很好的平衡。葡聚糖甲基丙烯酸酯的取代度范围可以是，例如，0. 08至0. 60。可以在水相介质中，例如基于磷酸盐的缓冲水溶液介质(pH-7)中，进行光辐照以获得葡聚糖甲基丙烯酸酯的聚合和交联。所使用的光引发剂为(_)核黄素，又称为维生素B2，例如，可通过市售获得，如可购于密苏里州圣路易斯市的Sigma-Aldrich公司。如上文所述，核黄素的一种电子供体是精氨酸，优选的为L-精氨酸，其为天然精氨酸的L-型，天然精氨酸是20种最常见的天然氨基酸之一。精氨酸的来源也可以是精氨酸取代的聚(酯-酰胺)。电子供体还可以是壳聚糖。当所用光辐照为UV辐照时，核黄素的具有光引发效应的剂量范围优选为占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 01至2%，非常优选的为0. 2-2%。核黄素低于葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数0. 2%时，存在胶凝时间长的缺点。核黄素高于葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数2%时，存在不透明度升高的缺点，这会降低适当胶凝所需的对样品内部的光穿透性，并延长胶凝时间。但是，即使核黄素达到葡聚糖甲基丙烯酸重量百分比的20%时，仍能够获得水凝胶。当所用光辐照为可见光辐照时，核黄素的具有光引发效应的剂量范围优选为占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 01至2%，非常优选的为0. 01-0. 51%。核黄素低于葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数0. 01 %时，存在胶凝时间长的缺点。核黄素超过葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数0.51%时，存在不透明度升高的缺点，这会降低适当胶凝所需的对样品内部的光通透性，并延长胶凝时间。当所用光辐照为UV辐照时，L-精氨酸的具有电子供体效应的剂量范围优选为占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 8至1. 6%，例如，占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 8至1. 2%。L-精氨酸低于葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数0. 8%时，存在易碎的缺点。L-精氨酸高于葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数1. 2%时，例如占葡聚糖重量百分数的 1.6%，胶凝时间延长，并且所形成的凝胶稳定性不佳，这是因为它太粘而不易进行适当的操作。当所用光辐照为可见光辐照时，精氨酸在所有的葡聚糖丙烯酸酯重量百分数下都有效，优选的浓度范围是占葡聚糖丙烯酸酯重量百分数的1至20%。当所用电子供体为壳聚糖时，其用量为，例如占葡聚糖丙烯酸酯重量百分数的 0. 01 至 2. 00%。
水凝胶的形成是通过将葡聚糖丙烯酸酯前体溶解于磷酸盐缓冲水溶液介质(pH7) 中，以获得一定浓度的葡聚糖丙烯酸酯前体，例如10-50% W/v%，例如25W/v%。当葡聚糖丙烯酸酯在缓冲液介质中完全溶解后，向其中加入核黄素，通过搅拌获得均勻的混合物，并向该均勻的混合物中加入精氨酸。然后进行搅拌，例如，在室温下进行搅拌直到形成均勻的溶液。该溶液可制备为Imm厚度的结构用于光辐照，使用距离15cm远的辐照源进行光辐照。进行UV辐照时可以使用，例如，365nm长波UV灯(ModelXX_15S，115V，60Hz，0. 68Amp, Serial No. 95-0042-05，CE，15W，UVP，Upland，加利福利亚州)。进行可见光辐照时可使用， 例如，荧光灯(17瓦，Ecolox, F1718-SP-35-EC0，加拿大)。当整个凝胶可以被提起而不会有任何液体流动时，胶凝过程完成。水凝胶的溶胀性质非常重要，因为它表明了与干燥水凝胶相比，水凝胶所吸收的
溶液量。溶胀程度可以通过溶胀率(％)来表征。可参照Kim，S.H.，et al, Journal of Biomedical Materials Research Part B, Applied Biomaterials 2009, page 390-400(published online 10 June 2009)禾口 Kim， S. -H. ， Fibers and Polymers 2009， Vol 10，No. 1，14-20这两篇文献中所描述的方法进行计算。测试表明，本申请中使用UV辐照制备的水凝胶具有80%的溶胀率，该溶胀率不依赖于溶胀测试介质的PH值。而本申请中使用可见光辐照生成的水凝胶在pH7的测试介质中具有70%的溶胀率，并在pH3和pHIO的测试介质中具有高达100 %的溶胀率，其具有的溶胀率不依赖于pH值，为0至200 %。例如，一种用葡聚糖甲基丙烯酸酯制备无毒的生物可降解型水凝胶的方法，其中所用的葡聚糖的平均分子量范围是30，000至200，000克每摩尔，例如，64，000至76，000克每摩尔，并且其取代率的范围是0. 08至0. 60，该方法包括，在具有光引发效应剂量的核黄素存在时，核黄素的范围为占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 2-2%，以及在具有电子供体效应剂量的L-精氨酸存在时，L-精氨酸的范围为占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 8至1. 6 %，例如占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数0. 8至1. 2 %，在pHl. 0-10的条件下，将葡聚糖甲基丙烯酸酯使用能够产生胶凝效果的剂量的UV辐照，以形成基于葡聚糖的生物可降解型无毒水凝胶，其具有的溶胀率不依赖于pH值，为0至200%。在另一个例子中，本申请提供一种用葡聚糖甲基丙烯酸酯制备无毒的生物可降解型水凝胶的方法，其中所用的葡聚糖甲基丙烯酸酯的平均分子量范围是30，000至200，000 克每摩尔，例如，64，000至76，000克每摩尔，并且其取代率的范围是0. 08至0. 60，该方法包括，在具有光引发效应剂量的核黄素存在时，核黄素的范围为占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 01-0. 51%，以及在具有电子供体效应剂量的L-精氨酸存在时，L-精氨酸的范围为占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的1至20%，在pHl到pHIO的条件下，将葡聚糖甲基丙烯酸酯使用可见光辐照，以形成基于葡聚糖的生物可降解型无毒水凝胶，其溶胀率的范围是64至98%，并且在碱性或者酸性pH值条件下的溶胀率高于中性pH值条件下的溶胀率。本申请的另一实施方式涉及一种应用UV或可见光形成水凝胶的系统。用于UV引发交联的水凝胶形成系统包含a)葡聚糖甲基丙烯酸酯，其平均分子量的范围是30，000至200，000克每摩尔，其取代率的范围是0. 08至0. 60 ；b)具有光引发效应剂量的核黄素，其范围是占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的 0.2至2%，以及c)具有电子供体效应剂量的L-精氨酸，其范围是占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0.8至1.2。用于可见光引发交联的水凝胶形成系统包含a)葡聚糖甲基丙烯酸酯，其平均分子量范围是30，000至200，000克每摩尔，其取代率的范围是0. 08至0. 60 ；b)具有光引发效应剂量的核黄素，其范围是占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的 0. 01 至 0. 51%，以及c)具有电子供体效应剂量的L-精氨酸，其范围是占葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的1至20%。在另一方面中，本申请涉及含有葡聚糖作为多糖基团的生物可降解型无毒水凝胶，其不含有残留的合成型光引发剂，且含有的残留光引发剂仅为那些被可见光所激活的引发剂。我们接下来将说明本申请中所描述和制备的水凝胶的应用。可以将生物活性剂， 例如任意的水溶性生物活性剂或生物制剂，例如，抗生素，消炎药，伤口愈合剂，蛋白质，生长因子如成纤维生长因子，细胞因子如IL-2，6和12，或DNA受体，引入到本申请的水凝胶中，通过将生物活性剂溶解或悬浮于本申请所述接受光辐照的溶液中，以生成含有生物活性剂的水凝胶，从而可用作控制释放的药物组合物。本申请所制备的水凝胶还可以用作皮肤或者其他身体部位的无毒水溶性涂层。本申请的原理在Kim，S.-H.，et al，Journal of Biomedical Materials Research Part B =Applied Biomaterials,2009, pages 390-400 (published online 10 June 2009) 和 Kim，S. -H.，Fibers and Polymers 2009，vol. 10，NO. 1，14-20 中也有公开，这些文献的全部内容在此参考并入。下文阐述了制备本发明所述前体材料的实例以及本申请的操作实施例。操作实施例I泡丨备作力7[0疑胶前体的丙《希Il酉旨在通氮条件下，在90°C时将葡聚糖溶于LiCl/DMF(10wt. % )溶剂系统。完全溶解后，将该溶液降温至70°C并缓慢向其中加入亲核催化剂三乙基胺。添加的三乙基胺的量为甲基丙烯酸酸酐摩尔百分比浓度的10%。将该葡聚糖溶液剧烈搅拌10分钟后，使用注射器向系统中缓慢注入甲基丙烯酸酸酐。添加的甲基丙烯酸酸酐的量为葡聚糖中葡萄糖单元羟基的摩尔数的0.3倍。该反应在70°C进行5小时。反应混合物中的葡聚糖甲基丙烯酸酯产物使用冰冷的异丙醇沉淀，并使用异丙醇洗涤数次，于真空烘箱中室温干燥。为除去葡聚糖甲基丙烯酸酯中残留的任何未反应的甲基丙烯酸酸酐，将该葡聚糖甲基丙烯酸酯溶解于DMF中并使用异丙醇沉淀。相同的过程重复3次，以获得完全纯化的葡聚糖甲基丙烯酸酯前体。通过对甲基丙烯酸片段中的双键(5. 5 6. 5ppm)以及葡聚糖骨架中羟基的氢峰 (4. 3 5. 5ppm)进行积分和校正，测得葡聚糖中的甲基丙烯酸基团的取代度为0. 287的取代度(D.S.)。当所有3个羟基基团都被取代时，得到定义为3. 00的最大D. S.。以下的方程可用于计算D. S.，该方程的详细推导可参见Kim，S.-H.，“ Synthesis of dextran-based hydrogels, their characterization structural study, and doing control release property, Cornell University, UMI Dissertation Services ；1999 :211-216.葡聚糖中甲基丙烯酸基团的D. S. = 4R/(R+2)R = Β/ΑA =葡聚糖骨架中羟基的氢峰(4. 3 5. 5ppm)的积分面积B =甲基丙烯酸片段(5. 5 6. 5ppm)的积分面积操作实施例II以(-)核黄素/L-精氨酸为光引发剂/共引发剂在MIlIM下光交联葡聚糖甲基丙烯酸酯以生成水凝胶将实施例I得到的葡聚糖甲基丙烯酸酯作为聚合物前体，分别溶解于pH3，7，和10 的缓冲液介质中。所有凝胶制作过程中，聚合物前体浓度都维持在25w/V%。将葡聚糖甲基丙烯酸酯前体在缓冲液介质中彻底溶解后，向其中分别加入浓度为聚合物前体重量百分数的0. 2，1,2,4,12，20%的核黄素。将该混合物搅拌5分钟，直到形成均勻的混合物，向其中分别加入浓度为葡聚糖甲基丙烯酸酯前体重量百分数的0. 4,0. 8，1. 2，1. 8，和2. 0的L-精氨酸。该混合物随后在室温条件搅拌5分钟，直到形成均勻的溶液。将该溶液倾倒至塑料板上形成Imm厚度，并对其进行辐照直到完全形成水凝胶，即，使用置于所述Imm厚度结构上方 15cm 处的 365nm 长波 UV 灯(Model XX-15S，115V，60Hz，0. 68Amp，序列号 95-0042-05. CE, 15W，UVP，Upland，加利福利亚州，美国)进行辐照，直到水凝胶完全形成。在一定时间间隔内使用刮刀在该溶液上划取划痕，当刮刀的划痕不再消失时记为胶凝起始时间。当整个凝胶能够被提起而不会有液体流动时，记为胶凝完成的时间。下表1展示了支持本专利申请的工作中测得的核黄素浓度以及水相反应介质的 PH对葡聚糖甲基丙烯酸酯水凝胶特点的影响表 权利要求
1.制备不含有合成型光引发剂的生物可降解型水凝胶的方法，其步骤包括，在具有光引发效果剂量的核黄素以及具有电子供体效果剂量的精氨酸或壳聚糖存在的条件下，在水相介质中对不饱和基团取代的多糖进行光辐照，使得所述不饱和基团取代的多糖发生交联和聚合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述光辐照是紫外光辐照。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述光辐照是可见光辐照。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述多糖是重量平均分子量范围为30，000至 200，000克每摩尔的葡聚糖。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述不饱和基团取代的多糖是葡聚糖甲基丙烯酸
6.如权利要求5所述的方法，其中所述葡聚糖甲基丙烯酸酯的取代度范围为0.08至 0. 60。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述不饱和基团所取代的多糖是取代度范围为0.08 至0. 60的葡聚糖甲基丙烯酸酯，所述核黄素的具有光引发效应的剂量范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 2-2%，所述电子供体是L-精氨酸，L-精氨酸的具有电子供体效应的剂量范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 8-1. 2 %，所述方法在pH值1. 0至10 的范围内进行，并且所述方法用于制备基于无毒生物可降解型葡聚糖的无毒水凝胶，其溶胀率范围不依赖于pH，为0至200%。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述不饱和基团取代的多糖是取代度范围为0.08至 0. 60的葡聚糖甲基丙烯酸酯，所述核黄素的具有光引发效应的剂量范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0.01-0. 51%，所述电子供体是L-精氨酸，L-精氨酸的具有电子供体效应的剂量范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯质量百分数的1_20%，所述方法在pH值1.0至10的范围内进行，并且所述方法用于制备基于生物可降解型葡聚糖的无毒水凝胶，其溶胀率范围是64至98%，并且其溶胀率在碱性或者酸性pH值条件下比在中性pH条件下高。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述核黄素的剂量范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0.01至2%。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述电子供体是壳聚糖，并且所述壳聚糖的具有电子供体效应的剂量范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0. 01至2。
11.使用UV辐照引发交联的水凝胶生成系统，含有a)葡聚糖甲基丙烯酸酯，其重量平均分子量范围为30，000至200，000克每摩尔，且其取代率范围为0. 08至0. 60 ；b)具有光引发效果剂量的核黄素，其范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0.2至 2%，以及c)具有电子供体效果剂量的L-精氨酸，其范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的 0. 8 至 1. 2%。
12.使用可见光引发交联的水凝胶生成系统，含有a)葡聚糖甲基丙烯酸酯，其重量平均分子量范围为30，000至200，000克每摩尔，且其取代率范围是0. 08至0. 60 ；b)具有光引发效果剂量的核黄素，其范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的0.01至0.51%，以及c)具有电子供体效果剂量的L-精氨酸，其范围为葡聚糖甲基丙烯酸酯重量百分数的1 至 20%。
13.生物可降解型无毒水凝胶，含有作为多糖基团的葡聚糖，其不含有残留的合成型光引发剂。
14.如权利要求13所述的生物可降解型无毒水凝胶，其仅含有被可见光所激活的残留引发剂。
全文摘要
制备得到可用于生物医学用途的基于生物可降解型葡聚糖的水凝胶，其可以在核黄素/L-精氨酸或核黄素/壳聚糖的存在下，用紫外和可见光辐照在水性介质中的不饱和基团取代的多糖，例如葡聚糖甲基丙烯酸酯，使得不饱和基团取代的多糖进行光交联的方法制得。
文档编号C08F251/00GK102325814SQ201080008635
公开日2012年1月18日 申请日期2010年1月14日 优先权日2009年1月14日
发明者储世昌, 金向熙 申请人:康奈尔大学