专利名称：一种丝素蛋白/共聚物水凝胶的制备方法
技术领域：
本发明属于水凝胶材料领域，具体涉及一种由丝素蛋白和共聚物PLA-PEG-PLA构成的水凝胶。
背景技术：
在众多生物医用高分子材料中，高分子水凝胶是当今研究热点之一。高分子水凝胶是一种能在水中溶胀并保持大量水分而不溶解的聚合物。由于水凝胶聚合物网络中充斥有大量的水分，使得整个材料具备了流体的性质，这与充盈有大量水溶液的机体组织及其相似，柔软、润湿的表面大大减少了材料对周围组织的刺激，使得水凝胶具有良好的生物相容性，在药物释放和人体组织工程方向拥有极大开发潜力。现有技术中，属于研究热点并且已取得一定进展的水凝胶材料有包括胶原、壳聚糖、聚乙烯醇、聚乙二醇/聚酯嵌段共聚物等，其中，胶原的力学性能较差，需要使用交联剂改善其机械性能，而通常应用的交联剂如戊二醛等都具有很高的细胞毒性，经交联剂交联以后，胶原的生物相容性会降低；壳聚糖作为支架材料，其降解速度以及与组织之间的结合能力都有待提高和优化；聚乙烯醇、聚乙二醇/聚酯嵌段共聚物等人工合成材料，虽然其可加工性好，但是其生物相容性比不上天然可降解材料，降解速度过慢，这些都是需要加以改善和研究的方面。丝素蛋白是一种纯天然蛋白质，具有与胶原蛋白同等的体内、外生物相容性，并且可以自然降解，降解最终产物为氨基酸，非常适合用作生物材料。丝素蛋白水溶液自然放置会形成水凝胶，但其凝胶时间较长，因此，限制了它的应用。Tuna Yucel, Peggy Cebe等人通过超声波振荡的方法，能在短时间内将丝素蛋白溶液形成为水凝胶，大大提高了工作
:Tuna Yucel, Peggy Cebe et al. Biophysical. 97(2009) 2044 - 2050),{0 是此种方法只是解决了丝素凝胶过慢的问题，其细胞相容性以及形成凝胶的结构都还需要进一步研究。聚乳酸(PLA)和聚二乙醇(PEG)的共聚物PLA-PEG-PLA水溶液能在接近人体温度下产生温度敏感的溶胶-凝胶化转变，是被广泛研究的一种水凝胶材料。其合成原料聚乳酸和聚乙二醇都具有良好的生物相容性，但由于其温敏可逆物理交联的性质，决定了其形成的水凝胶机械性能较差缺陷。Christine Hiemstra, Zhiyuan Zhong等人通过合成PEG-PLA星形共聚物来改进PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶机械性能较差的缺点(参见 Christine Hiemstra, Zhiyuan Zhong et al. Biomacromolecules 7(2006) 2790-2795), 但是PLA-PEG-PLA共聚物的生物相容性还没有得到改进。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种水凝胶的制备方法，采用丝素蛋白和共聚物构成水凝胶，改善水凝胶的机械性能、生物相容性，并且使水凝胶的制备时间可控。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种丝素蛋白/共聚物水凝胶的制备方法，包括以下步骤(1)将家蚕丝经脱胶、溶解、透析处理后形成质量分数为1 30%的丝素蛋白水溶液； 按照质量比，丙交酯(LA)聚乙二醇(PEG)= 5 1 1 5，通过开环反应制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物，其中聚乙二醇的重均分子量为400 10000 ；
(2)将聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物加入到丝素蛋白溶液，在 35 39°C下静置至少5分钟直至形成丝素蛋白/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物水凝胶。优选的技术方案中，步骤(1)中，丝素蛋白水溶液的质量浓度为洲 6%;制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物时，按照质量比，丙交酯(LA)聚乙二醇 (PEG) = 1 1 3，聚乙二醇的重均分子量为400 1000。上述技术方案中，当制备的水凝胶作为药物和生长因子缓释载体时，步骤(1)中， 丝素蛋白水溶液的质量浓度为21 4%，制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物时，按照质量比，丙交酯(LA)聚乙二醇(PEG)= 1 1 3，聚乙二醇的重均分子量为 400 1000 ；步骤⑵中，共聚物与丝素蛋白的质量比在3 1 10 1。上述技术方案中，当制备的水凝胶作为细胞培养支架或其他用途时，步骤(1)中， 丝素蛋白水溶液的质量浓度为4% 696，制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PLA)共聚物时，按照质量比，丙交酯(LA)聚乙二醇(PEG)= 0.8 1.2 1，聚乙二醇的重均分子量为800 1200 ；步骤O)中，共聚物与丝素蛋白的质量比在1 3 1。上述技术方案中，形成水凝胶的时间一般为5 720分钟，并且共聚物的浓度越大、PEG链段的比例越低、PEG链段的分子量越大、共聚物与丝素蛋白的质量比越大，静置形成水凝胶的时间越短。上述技术方案中，丝素蛋白溶液的浓度越大，静置形成的水凝胶力学性能越好。本发明同时要求保护采用上述技术方案制备得到的水凝胶材料。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
1.采用本发明所述制备方法制备得到的水凝胶具有良好的机械性能、生物相容性。2.本发明可以通过调整加入的PLA-PEG-PLA共聚物的浓度、PEG链段的比例和分子量的大小可调节水凝胶的凝固时间，还可以通过调整加入的丝素蛋白溶液的浓度调节水凝胶的力学性能。
图1为实施例一中合成PLA-PEG-PLA共聚物的核磁共振谱图2为实施例二中丝素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶的横向剖面扫描电镜图； 图3为实施例七中丝素蛋白水凝胶的细胞培养荧光显微镜图； 图4为实施例七中PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶的细胞培养荧光显微镜图； 图5为实施例七中丝素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶的细胞培养荧光显微镜图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 实施例一
⑴天然桑蚕丝用质量分数0. 05%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯桑蚕丝素蛋白纤维。将该丝素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (质量比)中恒温80士2°C水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白水溶液。透析处理后形成质量分数约为5%的丝素蛋白溶液。⑵以辛酸亚锡为催化剂，丙交酯和聚乙二醇(1000)以1:1的比例，在130°C油浴锅中开环反应M小时合成出pla-peg-pla共聚物，并对所得共聚物进行核磁共振分析，得到图1，由图1可知pla-peg-pla共聚物制备成功。⑶将步骤⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物溶液和丝素蛋白溶液分别在37°C 左右静置。5%丝素蛋白溶液形成水凝胶所需的凝胶时间约为一星期，而25%共聚物水凝胶的弹性回复率为1. 86%。实施例二
⑴天然桑蚕丝用质量分数0. 05%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯桑蚕丝素蛋白纤维。将该丝素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (质量比)中恒温80士2°C水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白水溶液。透析处理后形成质量分数约为5%的丝素蛋白溶液。⑵以辛酸亚锡为催化剂，丙交酯和聚乙二醇(1000)以1:1的比例，在130°C油浴锅中开环反应M小时合成出PLA-PEG-PLA共聚物。⑶将步骤⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到丝素蛋白溶液在37°C左右静置。当加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量1000)与丝素蛋白质量比为5:1时，制备水凝胶所需的凝胶时间约为15分钟，所得水凝胶的弹性回复率为25. 23%。对所得丝素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶进行横向剖面电镜扫描，得到图2， 由图2可知制备的水凝胶有一定的取向孔隙结构，有望应用于药物和生长因子缓释载体。实施例三
⑴天然桑蚕丝用质量分数0. 05%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯桑蚕丝素蛋白纤维。将该丝素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (质量比)中恒温80士2°C水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白水溶液。透析处理后形成质量分数约为5%的丝素蛋白溶液。⑵以辛酸亚锡为催化剂，丙交酯和聚乙二醇(1000)以1:1的比例，在130°C油浴锅中开环反应M小时合成出PLA-PEG-PLA共聚物。⑶将步骤⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到丝素蛋白溶液在37°C左右静置。当加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量1000)与丝素蛋白质量比为3:1时，制备水凝胶所需的凝胶时间约为50分钟，所得水凝胶的弹性回复率为43. 25%。实施例四
⑴天然桑蚕丝用质量分数0. 05%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯桑蚕丝素蛋白纤维。将该丝素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (质量比)中恒温80士2°C水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白水溶液。透析处理后形成质量分数约为3%的丝素蛋白溶液。⑵以辛酸亚锡为催化剂，丙交酯和聚乙二醇(1000)以1:1的比例，在130°C油浴锅中开环反应M小时合成出PLA-PEG-PLA共聚物。⑶将步骤⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到丝素蛋白溶液在37°C左右静置。当加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量1000)与丝素蛋白质量比为8:1时，制备水凝胶所需的凝胶时间约为10分钟，所得水凝胶的弹性回复率为11. 28%。实施例五
⑴天然桑蚕丝用质量分数0. 05%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯桑蚕丝素蛋白纤维。将该丝素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (质量比)中恒温80士2°C水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白水溶液。透析处理后形成质量分数约为5%的丝素蛋白溶液。⑵以辛酸亚锡为催化剂，丙交酯和聚乙二醇(400)以1:1的比例，在130°C油浴锅中开环反应M小时合成出pla-peg-pla共聚物。⑶将步骤⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到丝素蛋白溶液在37°C左右静置。当加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量400)与丝素蛋白质量比为5:1时，制备水凝胶所需的凝胶时间约为220分钟，所得水凝胶的弹性回复率为25. 72%。实施例六
⑴天然桑蚕丝用质量分数0. 05%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯桑蚕丝素蛋白纤维。将该丝素蛋白溶解于LiBr:C2H50H=40:60 (质量比)中恒温80士2°C水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白水溶液。透析处理后形成质量分数约为3%的丝素蛋白溶液。⑵以辛酸亚锡为催化剂，丙交酯和聚乙二醇(400)以1:3的比例，在130°C油浴锅中开环反应M小时合成出PLA-PEG-PLA共聚物。⑶将步骤⑴，⑵中所制得的PLA-PEG-PLA共聚物加入到丝素蛋白溶液在37°C左右静置。当加入的PLA-PEG-PLA共聚物(分子量400，比例1:3)与丝素蛋白质量比为5:1 时，制备水凝胶所需的凝胶时间约为460分钟，所得水凝胶的弹性回复率为20. 57%。实施例七
⑴将上述实施例一和例二中制备的丝素蛋白水凝胶，PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶和丝素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶均勻铺在2X2cm的玻璃片上，辐照灭菌，密封保存，备用；
⑵将小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)接种在材料上进行细胞相容性实验。OTH3T3细胞正常传代，配置新鲜培液小牛血清马血清高糖培养基=10 5 85 (体积比)；随后按照 IXlO4 cell/ml的密度接种细胞在材料上，培养1 d，2 d，3 d，进行H33258染色，荧光倒置显微镜(10*10)拍照观察。⑶水凝胶的细胞培养荧光显微镜图如附图所示，图3为丝素蛋白水凝胶，图4为 PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶，图5为丝素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶。图中光点是黏附在水凝胶上生长的细胞核染色后发出，由图可见，培养3天后细胞在丝素蛋白和丝素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶上正常黏附生长，并大量增殖到140和100个左右，但在 PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶上只有少量细胞黏附生长，大约7、个左右，基本上没有增殖。 可见与PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶相比，丝素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶的细胞相容性更好，有望应用于药物和生长因子缓释载体，细胞培养支架，软组织修复等生物医用方
权利要求
1.一种丝素蛋白/共聚物水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将家蚕丝经脱胶、溶解、透析处理后形成质量分数为1 30%的丝素蛋白水溶液； 按照质量比，丙交酯聚乙二醇=5 1 1 5，通过开环反应制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物，其中聚乙二醇的重均分子量为400 10000 ；(2)将聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物加入到丝素蛋白溶液，在35 390C下静置至少5分钟直至形成丝素蛋白/聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物水凝胶。
2.根据权利要求1所述丝素蛋白/共聚物水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1) 中，丝素蛋白水溶液的质量浓度为21 6% ；制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物时，按照质量比，丙交酯聚乙二醇=1 1 3，聚乙二醇的重均分子量为400 1000。
3.根据权利要求1所述丝素蛋白/共聚物水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1) 中，丝素蛋白水溶液的质量浓度为21 4%，制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物时，按照质量比，丙交酯聚乙二醇=1 1 3，聚乙二醇的重均分子量为400 1000;步骤(2) 中，共聚物与丝素蛋白的质量比在3 10 1。
4.根据权利要求1所述丝素蛋白/共聚物水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1) 中，丝素蛋白水溶液的质量浓度为4% 6%，制备聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物时，按照质量比，丙交酯聚乙二醇=0.8 1.2 1，聚乙二醇的重均分子量为800 1200 ；步骤 (2)中，共聚物与丝素蛋白的质量比在1 3 1。
5.采用权利要求1、2、3或4所述丝素蛋白/共聚物水凝胶的制备方法制备得到的水凝胶材料。
全文摘要
本发明公开了一种丝素蛋白/PLA-PEG-PLA共聚物水凝胶的制备方法，包括以下步骤(1)制备丝素蛋白水溶液，聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物；(2)将共聚物加入到丝素蛋白溶液在35～39℃静置形成水凝胶。采用本发明所述制备方法制备得到的水凝胶具有良好的机械性能、生物相容性；并且，本发明可以通过调整加入的PLA-PEG-PLA共聚物的浓度、PEG链段的比例和分子量的大小可调节水凝胶的凝固时间，还可以通过调整加入的丝素蛋白溶液的浓度调节水凝胶的力学性能。
文档编号C08L67/04GK102174203SQ20111007692
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者左保齐, 钟天翼 申请人:苏州大学