专利名称：人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法
技术领域：
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法。
背景技术：
干细胞是人体及其各种组织细胞的初始来源。它的研究受到了全世界政府和科学界的极大重视并已成为世界科学的热点研究领域之一。以干细胞为基础的专利权和专有技术在生命科学、药学、组织工程、基础医学及医疗应用领域中的潜在价值不可估量。多潜能干细胞(pluripotent stem cells)是一类既具有自我更新又具有全能性的干细胞。自我更新指多潜能干细胞能够在体外进行无限期的培养和传代，通过细胞分裂扩增出与自身相同的高度未分化细胞，维持自己的全能性而不会随着细胞的分裂而丧失。全能性指在一定的条件下，多潜能干细胞可以进一步分化成各种成体细胞，进而构成机体的各种组织和器官。目前，最受关注的多潜能干细胞是(embryonic stem，ES)细胞和(induced ploiPS)细胞。ES细胞是前胚胎囊胚期的内细胞团细胞在体外特定培养条件下得到的特殊细胞，理论上具有发育和分化成为机体内几乎所有组织细胞类型的潜能，故又称为“万能细胞”。典型的人体iPS细胞是采用体外基因转染技术，通过将一组4个基因 (0ct3/4, Sox2, c-Myc,and Klf4)转入皮肤成纤维细胞，使其重新编程逆转到细胞分化前的状态，具有与ES细胞类似的形态和功能的细胞。iPS细胞具有和ES细胞类似的功能，却绕开了 ES细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，因此在医疗领域的应用前景非常广阔。iPS细胞作为生命科学、药学、组织工程、基础医学及医疗应用领域研究中最有前景的种子细胞，将从根本上解决供体细胞来源不足的问题。体外培养人体iPS细胞的基本原则是最大限度地抑制分化，维持其自我更新性能，同时促进其快速增殖及维持其正常的二倍体核型。iPS细胞只有保持未分化性能才具有全能性，所以涉及iPS细胞的所有研究都首先要以未分化iPS细胞作为研究起点的种子细胞，因此，获取该种子细胞成为人体多潜能干细胞研究的关键。由于iPS细胞的建系效率只有0.02%，所以需要大量扩增。目前，人体iPS细胞培养法的材料通过制备滋养层结构，该滋养层结构来进行培养，在该方法中先将滋养层细胞在组织培养用聚苯乙烯板(tissue-culture polystyrene,TCPS)表面贴壁单层培养扩增之后，再将多潜能性干细胞播种到滋养层细胞(目前大多使用受射线照射或丝裂霉素处理后胚胎鼠源成纤维细胞作为滋养细胞)之上培养的方法，该方法中人体iPS细胞培养依赖滋养层细胞。该方法存在以下问题(1)滋养层细胞的问题。小鼠胚胎成纤维细胞生命期有限，不能在体外长期传代，且体外传代次数增多，其产生抑制分化因子和促进增殖因子的能力会减弱甚至丧失，在第3 5代时使用最好，所以只能过一段时间后解剖孕鼠提取，这增大了体外培养的工作量；( 细胞分离问题。在滋养层细胞上扩增培养的人体iPS细胞克隆(cell colony，指圆形或椭圆形的细胞的聚集体，)需要在显微镜下用特殊的工具逐个挑选，操作难度大。因此，滋养层培养法不但存在操作繁琐复杂、耗费人力物力、效率低以及难以大量获取的缺点，而且还存在着异种动物交叉感染的危险性。为了克服滋养层细胞带来的问题，开发了以基质胶(Matrigel)作为人体iPS细胞培养支架的制备方法，该方法制备的培养支架，由于基质胶是一种天然水凝胶，主要成分包括层黏连蛋白和胶原IV，同时含有TGF-β成纤维细胞生长因子，组织纤维酶原活化因子以及其它在Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肿瘤中自然表达的生长因子。在室温下，Matrigel 可自动聚集产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料。虽然使用方便，但其不但成分复杂且含有未知蛋白质，依然存在异种动物交叉感染的危险性。因此，需要建立一套能够达到安全简便且高效稳定的人体iPS细胞未分化扩增的培养支架的制备方法。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，由此制备方法制备出来的水凝胶细胞支架既不修饰任何从动物体内抽提的蛋白质，也不涉及任何滋养层细胞的条件下，以合成高分子水凝胶为细胞培养支架，由于具有合成高分子水凝胶的化学结构明确、物理化学性能稳定且易于调控、无异物感染且易于灭菌且廉价的优势，是安全培养人体多潜能干细胞的理想生物材料，由此能建立安全简便扩增未分化人体iPS细胞的软材料培养体系。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是一种人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 50 1 100混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为去离子水或PH值为 6. 0 8. 0的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括带负电荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸钠、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、带正电荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵或者丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 100 1 200混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水或pH值为6. 0 8. 0 的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸羟乙脂、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N，N' 二甲基丙烯酰胺；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.5 1 1.0混合均勻后，加入质量浓度为1 10%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1% 的2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0. 1 1 0.5，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.2 1 0.5，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5:将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为
1.5mm-2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支
^K O所述的板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0本发明制备出来的制备出来的水凝胶细胞支架既不修饰任何从动物体内抽提的蛋白质，也不涉及任何滋养层细胞的条件下，以合成高分子水凝胶为细胞培养支架，由于具有合成高分子水凝胶的化学结构明确、物理化学性能稳定且易于调控、无异物感染且易于灭菌且廉价的优势，是安全培养人体多潜能干细胞的理想生物材料，由此能建立安全简便扩增未分化人体iPS细胞的软材料培养体系。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作更详细的说明。实施例1:人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 50混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为去离子水的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括带负电荷的丙烯酸；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 100混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸羟乙脂；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.5混合均勻后， 加入质量浓度为1 %的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1 %的2-氧代-1， 5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0. 1，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.2， 再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后， 再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及
2.5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为1. 5mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架。所述的板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0将Iml 2X IO4Cells细胞悬浮液滴加于人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的圆柱状高分子水凝胶表面，逐滴将细胞悬浮液滴加于高分子水凝胶表面进行接种，逐滴中的一滴小于等于0. 1ml，接种完后小心地移置于内部温度为37°C且其内CO2体积比为 5%的细胞培养箱中培养，在移动过程中避免摇动，72小时后iPS细胞在高分子水凝胶表面形成了大量稳定、结构致密的椭圆形克隆，长轴的最大长度为100ym-200ym，ALP染色结果为阳性。而作为对照组的在M孔板表面培养的细胞铺展于材料表面，没有出现克隆，ALP 染色结果全为阴性。说明水凝胶上培养的细胞仍然保持着未分化的特性。实施例2 人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 70混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括甲基丙烯酸；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 150混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水或pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液， 中性高分子单体包括甲基丙烯酸甲酯；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.7混合均勻后， 加入质量浓度为5%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 的2-氧代-1， 5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.2，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.3， 再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后， 再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5:将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为 1. 5mm-2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支
^K O所述的板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0将Iml 2X IO4Cells细胞悬浮液滴加于人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的圆柱状高分子水凝胶表面，逐滴将细胞悬浮液滴加于高分子水凝胶表面进行接种，逐滴中的一滴小于等于0. 1ml，接种完后小心地移置于内部温度为37°C且其内(X)2体积比为 5%的细胞培养箱中培养，在移动过程中避免摇动，80小时后iPS细胞在高分子水凝胶表面形成了大量稳定、结构致密的椭圆形克隆，长轴的最大长度为100ym-200ym，ALP染色结果为阳性。而作为对照组的在M孔板表面培养的细胞铺展于材料表面，没有出现克隆，ALP 染色结果全为阴性。说明水凝胶上培养的细胞仍然保持着未分化的特性。实施例3 人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 100混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为pH值为8. 0的磷酸盐缓冲溶液， 电解质高分子单体包括苯乙烯磺酸钠；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 200混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为pH值为8.0的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括N-乙烯基吡喏烷酮；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 1.0混合均勻后， 加入质量浓度为10%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 的2-氧代-1， 5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.5，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.5， 再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后， 再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水 疑月交用 4- (-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid ^ HEPES t^WMM 泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5:将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架。所述的板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0
将Iml 2X IO4Cells细胞悬浮液滴加于人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的圆柱状高分子水凝胶表面，逐滴将细胞悬浮液滴加于高分子水凝胶表面进行接种，逐滴中的一滴小于等于0. 1ml，接种完后小心地移置于内部温度为37°C且其内(X)2体积比为 5%的细胞培养箱中培养，在移动过程中避免摇动，96小时后iPS细胞在高分子水凝胶表面形成了大量稳定、结构致密的椭圆形克隆，长轴的最大长度为100ym-200ym，ALP染色结果为阳性。而作为对照组的在M孔板表面培养的细胞铺展于材料表面，没有出现克隆，ALP 染色结果全为阴性。说明水凝胶上培养的细胞仍然保持着未分化的特性。
权利要求
1.一种人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，其特征在于，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 50 1 100混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为去离子水或PH值为6.0 8.0的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括带负电荷的丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸钠、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸、带正电荷的丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵、甲基丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵或者丙烯酰氧乙基二甲基苄基氯化铵；步骤2 制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围 1 100 1 200混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水或pH值为6. 0 8. 0 的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸羟乙脂、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡喏烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N，N' 二甲基丙烯酰胺；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.5 1 1.0混合均勻后，加入质量浓度为1 10%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 的 2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0. 1 1 0.5，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.2 1 0.5，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中，再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 缓冲溶液浸泡， 该 HEPES 缓冲溶液还包括 5X IO^3M 的 HEPESU. 55X IO^2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为1. 5mm-2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架。
2.根据权利要求1所述的人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，其特征在于板状合成模具是由玻璃板围成的框架结构构成的容器，且该框架结构内设置有硅胶垫，其长宽高尺寸分别为10cm、IOcm以及0. Icm0
3.根据权利要求2所述的人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，其特征在于，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 50混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为去离子水的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括带负电荷的丙烯酸；步骤2:制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围1 100混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为PH值为6. 0的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸羟乙脂；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.5混合均勻后，加入质量浓度为1 %的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1 %的2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为 1 0. 1，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.2，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中， 再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 缓7中溶液浸泡， 该 HEPES 缓冲溶液还包括 5X KT3M 的 HEPESU. 55X KT2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为1. 5mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架。
4.根据权利要求2所述的人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，其特征在于，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 70混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括甲基丙烯酸；步骤2:制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围1 150 混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为去离子水或PH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括甲基丙烯酸甲酯；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 0.7混合均勻后，加入质量浓度为5%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1 %的2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为 1 0.2，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.3，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中， 再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 缓7中溶液浸泡，该 HEPES 缓冲溶液还包括 5 X IO^3M 的 HEPES、1. 55 X 1(Γ2Μ 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为1. 5mm-2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架。
5.根据权利要求2所述的人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，其特征在于，步骤如下步骤1 首先制备电解质高分子单体溶液，即将电解质高分子单体和溶剂按质量比范围1 100混合而得电解质高分子单体溶液，溶剂为PH值为8.0的磷酸盐缓冲溶液，电解质高分子单体包括苯乙烯磺酸钠；步骤2:制备中性高分子单体溶液，即将中性高分子单体和溶剂按质量比范围1 200 混合而得中性高分子单体溶液，溶剂为PH值为8. 0的磷酸盐缓冲溶液，中性高分子单体包括N-乙烯基吡喏烷酮；步骤3 制备高分子水凝胶，即将制备而得的电解质高分子单体溶液与中性高分子单体溶液按电解质高分子单体与中性高分子单体的摩尔比范围为1 1.0混合均勻后，加入质量浓度为10%的N，N'-亚甲基双丙酰胺交联剂和质量浓度为0. 1 %的2-氧代-1，5-戊二酸引发剂，其中电解质高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为 1 0.5，而中性高分子单体和所述的N，N'-亚甲基双丙酰胺的摩尔比范围为1 0.5，再次混合均勻后将该混合溶液在避光条件下利用氮气脱氧30分钟后加入板状合成模具中， 再用365nm的紫外灯对板状合成模具内氮气脱氧后的混合溶液在室温下照射6小时后，再单体聚合为高分子水凝胶；步骤4 进行高分子水凝胶pH值和离子强度的调节，即将所得的高分子水凝胶在去离子水中浸泡，除去高分子水凝胶中微量的未反应单体、交联剂及引发剂，然后将高分子水凝月交用 4-(-2-hydroxyethyl) -piperazine-l-ethansulfonic acid 的 HEPES 缓7中溶液浸泡， 该 HEPES 缓冲溶液还包括 5X IO^3M 的 HEPESU. 55X IO^2M 的 NaHC03、0. 14M 的 NaCl 以及 2. 5 X IOVl的苯酚红，另外该HEPES缓冲溶液的离子强度I为0. 15M以及pH值为7. 4，并且每经过12小时更新一次所述的HEPES缓冲溶液，直到高分子水凝胶达到溶胀平衡，此时高分子水凝胶的离子强度和PH值与细胞培养液一致；步骤5 将达到溶胀平衡的高分子水凝胶切成直径为15mm且厚度范围为2mm的圆柱状，在温度为120°C条件下，经过20分钟高压灭菌之后转移至培养板的孔中，这样培养板和其上的高分子水凝胶就形成了人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架。
全文摘要
一种人体iPS细胞未分化扩增的水凝胶培养支架的制备方法，制备出来的制备出来的水凝胶细胞支架既不修饰任何从动物体内抽提的蛋白质，也不涉及任何滋养层细胞的条件下，以合成高分子水凝胶为细胞培养支架，由于具有合成高分子水凝胶的化学结构明确、物理化学性能稳定且易于调控、无异物感染且易于灭菌且廉价的优势，是安全培养人体多潜能干细胞的理想生物材料，由此能建立安全简便扩增未分化人体iPS细胞的软材料培养体系。
文档编号C08F220/28GK102382797SQ20111019164
公开日2012年3月21日 申请日期2011年7月8日 优先权日2011年7月8日
发明者刘健康, 刘振齐, 陈咏梅 申请人:西安交通大学