专利名称：一种基于谷物蛋白的、用于大规模培养细胞的微载体，制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及培养细胞用的微载体，特别是涉及一种基于谷物醇溶蛋白、用于大规模培养细胞的微载体、制备方法及用途，用于疫苗、抗体及组织工程领域。
背景技术：
微载体培养技术是目前公认的最有发展前途的一种用于动物细胞大规模培养的技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，容易放大，条件可控。自1962年Capstile成功地大规模悬浮培养BHK21细胞(Capsitick PB et al.， 1962)，以及1967年Van Wezel (Van Wezel AL et al.，1967)首次成功应用微载体培养贴壁动物细胞以来，至今国际市场上出售的微载体商品类型已达十几种以上，其中常用的商品化微载体有三种Cytodexl、2、3，Cytopore 和 Cytoline。早期微载体多采用合成聚合物，如聚羟乙基丙烯酸甲酯(PHEMA)、葡聚糖等。合成聚合物制备的微载体重复性和力学性能可以达到较高水平，但缺乏细胞识别位点，影响细胞在其表面粘附、生长。天然聚合物及其衍生物因其取材方便、生物相容性好且价格低廉， 有望取代传统微载体制备材料。例如明胶、胶原、纤维素、甲壳素及其衍生物以及海藻酸钠等。胶原是一类可引导组织再生的生物材料，低抗原性、可参与组织愈合过程。Hillegas 等(US 4994388)在聚苯乙烯微球表面包覆一层胶原后表现出很好的效果。壳聚糖是甲壳质脱乙酰后的产物，其分子链之间可以形成许多氢键，分子中β_(1，4)糖苷键为其提供刚性和稳定性；氨基提供弱正电性；乙酰基提供疏水性；羟基具有良好的亲水性，但又不溶解于水。用壳聚糖制备的细胞培养微载体已有报道(Tigli RS et al.，2009)。藻酸盐是带有二价阴离子的天然线性多糖，是由α-L-古洛糖醛酸和β-D甘露糖醛酸残基组成的共聚物。研究表明，培养在海藻酸盐载体上的软骨细胞可以合成与软骨材料相似的胞外基质(Hauselmarm HJ，1996)。除单种材料制备微载体外，还有两种及以上混合材料制备的微载体，如壳聚糖和明胶混合微载体(CN1321175C)，丝素蛋白和壳聚糖大孔微载体 (CN101624472A)，壳聚糖和多聚磷酸钠多孔微载体(CN101844059A)。天然聚合物材料在组织工程化微颗粒方面也有应用(CN101195044A)。微载体的制备方法主要有相分离法、乳化_溶剂挥发法、冷冻法和喷雾法。其中， 乳化-溶剂挥发法应用最为广泛，其法是将所用材料溶解在一种溶剂中，然后注入搅拌中的反相溶剂里乳化成所用材料的乳液，通过挥发掉原溶剂形成微载体。除此以外，有采用锐孔喷射器的方法制备多孔微球(CN1253556C)，同轴高压静电技术和冷冻干燥法制备丝素蛋白微载体(CN101972481A)。玉米醇溶蛋白(zein)由于其良好的生物降解性、生物相容性和可加工性，已有报道应用于药物释放载体和食品工业中(US patent 5271961，5145702)，并可以制成 50-2000nm的微粒子膜和用于组织工程材料(CN 1401659A，CN1775307，CN1555892)。其中 US 5271961采用了相分离的制备方法，获得的微球直径小于30 μ m。US 5145702所用溶剂包括有机溶剂和强碱溶液，通过相分离或用酸中和形成沉淀的方法制备微球，其直径小于 10 μ m。
发明内容
本发明的目的之一在于提供实心、空心、大孔或磁性微载体，其以生物相容性良好的谷物醇溶蛋白为原料，制备出既具有细胞亲和性、有助于细胞粘附、支持大量细胞生长， 又能长期维持细胞活性和细胞功能，且成本低廉的、能够用于大规模培养细胞的微载体。本发明的另一目的在于提供除能够支持细胞生长外，还能满足在力学、形态、灭菌、可降解、无热源、可回收等多方面要求的微载体制备方法，该方法操作简单，成本低廉， 易于工业化生产。本发明的又一目的在于提供上述微载体在大规模动物细胞培养中的应用。为实现上述目的，本发明提供的微载体一是呈球形或类球形，直径为50-2000 μ m 的颗粒。推荐为150-2000 μ m的颗粒，尤其推荐为200-2000 μ m的颗粒。其内部为空心多孔，表面为光滑或具有大孔，可以是实心、空心或磁性的微载体。是由谷物醇溶蛋白在一定条件下制得。所述的谷物醇溶蛋白是玉米醇溶蛋白或小麦醇溶蛋白。在本发明中，可通过下述方法制备所述微载体制备方法一称取一定质量玉米醇溶蛋白固体粉末，溶解于氢氧化钠溶液，待完全溶解后，滴入含表面活性剂的盐酸溶液中，液滴即可固化成微球，将固化后的微球在盐酸溶液中浸泡后取出，用二次水洗涤，反复用氢氧化钠溶液调节PH至中性，进行表面固化处理，干燥后得到成品微球。制备方法二 称取一定质量玉米醇溶蛋白固体粉末，置于容器中，高湿环境下高温高压固化处理，经行星式球磨机磨制成球，过筛分选，表面固化，调节PH，干燥后得到成品微球。制备方法三称取一定质量玉米醇溶蛋白固体粉末，溶解于乙醇-水溶液后制成薄膜，粉碎或切割，过筛后得到所需大小颗粒，高塔造粒或分散于特定介质表面，在高温高压处理下进行固化，调节PH，干燥后得到成品微球。制备方法一可以进一步的描述为通过下述步骤获得方法一a)将谷物醇溶蛋白溶于pH为11-13的碱溶液，使得终浓度达到30_100g/L，得到谷物醇溶蛋白溶液；超声15分钟除去溶液中的气泡；b)制备过程中，调整谷物醇溶蛋白溶液浓度和液滴体积得到不同大小颗粒，加入浓度为0-3(^八％或0-3(^八％的增塑剂；推荐加入浓度为0. 1-2(^八％或0. 1-20 八％的增塑剂；所述的增塑剂为油酸、硬脂酸、柠檬酸或甘油；c)将醇溶蛋白的碱溶液缓慢滴入pH为1-5、含有0. 001-0. 1 八％表面活性剂的酸溶液中，醇溶蛋白的碱溶液液滴体积为1-50微升，固化形成直径在200-2000 μ m的表面光滑但空心多孔或者表面大孔的微球；所述的表面活性剂包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠；
d)将制成的微载体在盐酸溶液中浸泡5-30分钟；然后用0. lmol/L氢氧化钠溶液，反复调节PH至中性；e)在搅拌条件下，将带有微载体的溶液加热到70-90°C，冷却后再加热，重复一到三次进行表面固化，用水洗涤，低温干燥，灭菌，得到空心多孔或大孔微载体，粒径范围为 200-2000 μ m0制备方法二可以进一步的描述为通过下述步骤获得a)将谷物醇溶蛋白溶于体积浓度为55-95 %的醇溶液中，使得终浓度达到 30-500g/L，得到谷物醇溶蛋白的醇溶液；b)制备成厚度为50-1000 μ m的薄膜；c)将b)获得的薄膜在100_121°C，0. l_lMPa，处理1_30分钟，进行表面固化；d)粉碎机粉碎或者切割机切割，过筛，得到50-1000 μ m的立方体的粗颗粒，再进行球磨，获得粒径范围为50-1000 μ m的圆整的球形微载体；或者e)将b)获得的薄膜在高塔造粒，过筛，分散于玻璃、硫酸纸或者疏水介质表面进行造粒，固化条件为在100-121 、 0. I-IMPa下，处理1-30分钟，最后干燥收获圆整的球形微载体，粒径范围为50-1000 μ m ；制备方法三可以进一步的描述为通过下述步骤分别获得a)将谷物醇溶蛋白溶于体积浓度为55-95 %的醇溶液中，使得终浓度达到 30-500g/L，得到谷物醇溶蛋白的醇溶液；b)用喷雾干燥、高塔造粒但不限于这两种方法进行造粒；c)球磨后过筛；d)在100-121 °C、0. I-IMPa下，处理1_30分钟，进行表面固化，干燥。所述的碱溶液推荐为NaOH溶液；所述的酸溶液推荐为HCl溶液；所述的谷物醇溶蛋白推荐为玉米醇溶蛋白。本发明的方法中，在100_121°C和0. I-IMPa下处理谷物醇溶蛋白1_30分钟，进行表面固化和聚合，获得的微载体密度为1-1. 3g/cm3。本发明的方法中，获得的微载体可以进行灭菌后处理以钴60射线辐照、紫外线辐照、或者是在将微载体以蒸馏水或者PBS溶液溶胀后，高温灭菌。采用本发明所述的处理方法旨在使所制备的微载体能够抵御湿热灭菌，不发生连结或聚集等现象。而且，微载体能够抵御胰酶消化，减少细胞回收环节其他成分的混入，保证后期抗体、疫苗制备的纯度。并且不影响细胞再贴壁。本发明提供的微载体可以在上述微载体一的基础上，对微载体表面进行化学修饰，使其带有促进细胞黏附的正电荷；或交联胶原蛋白等成分，提高与细胞的亲和力。本发明提供的微载体以谷物醇溶蛋白为主要成分，因为谷物醇溶蛋白已经被证明具备良好的生物相容性、难溶于水和可降解的特性。并且通过本发明，获得了在湿态下有着优良力学性能的微载体，可以较长时间维持微载体的结构，抵抗搅拌等机械外力，满足了既支持大量细胞生长，又能长期维持细胞活性和功能的要求，可用于高密度培养动物细胞，生产疫苗和抗体，还能用于组织工程领域。
图1、表面光滑的玉米醇溶蛋白微载体(500-1000 μ m)及其内部空心结构。
图2、表面光滑的玉米醇溶蛋白微载体(500-1000 μ m)表面细胞的扫描电镜图片。图3、大孔的玉米醇溶蛋白微载体( 800 μ m)内外结构。图4、大孔的玉米醇溶蛋白微载体(150-400 μ m)孔内NIH3T3细胞的光镜图片。图5、切割成型的微载体(200-400 μ m)的光镜图片。图6、切割成型的微载体(200-400 μ m)与Vero细胞培养第2天和第6天时，荧光倒置显微镜观察。图7、制备方法一的工艺流程图。图8-9、制备方法二和三的工艺流程图。图10、去热源处理前(Control)、后(D印yrogenation)，Vero细胞的生长曲线。纵轴为每毫升的细胞数。图11、胰酶处理对Vero细胞再贴壁的影响。对照为商品cytodexl，纵轴为单位面积的细胞再贴壁数。具体实施方法以下通过具体实施例进一步详细说明本发明。本发明提供的可用于大规模培养细胞的谷物醇溶蛋白微载体，可通过如下方法得到。实施例一1、玉米醇溶蛋白溶液的制备将2-3克玉米醇溶蛋白粉末溶解于30ml氢氧化钠 (0. lmol/L)溶液中，搅拌至完全溶解，超声15分钟除去溶液中的气泡；2、盐酸溶液的制备制成100ml (0.01-lmol/LHCl，0. OOlg表面活性剂)盐酸溶液；3、玉米醇溶蛋白微球的制备将玉米醇溶蛋白溶液通过压力挤出，形成液滴，液滴体积为1-50微升，滴入盐酸溶液，利用重力作用，液滴即可固化成微载体；4、酸液浸泡将制成的微载体在盐酸溶液中浸泡5-30分钟；5、pH调节用0. lmol/L氢氧化钠溶液，反复调节pH至中性；6、表面固化在搅拌条件下，将带有微载体的溶液加热到70-90°C，冷却后再加热，重复一到三次；7、洗涤取出制备的微载体，反复用二次水冲洗，去除表面残留的盐酸溶液。8、低温干燥，得到表面光滑且空心多孔微载体，粒径范围为150-2000 μ m(图1、 2)；9、将微载体以蒸馏水或者PBS溶液溶胀后，高温灭菌，备用。实施例二1、玉米醇溶蛋白溶液的制备将1-2克玉米醇溶蛋白粉末溶解于30ml氢氧化钠 (0. lmol/L)溶液中，搅拌至完全溶解，鼓气1-10分钟；2、盐酸溶液的制备制成100ml (0.01-lmol/LHCl，0. OOlg表面活性剂)盐酸溶液；3、玉米醇溶蛋白微球的制备吸取玉米醇溶蛋白上层溶液(含气泡)，将玉米醇溶蛋白溶液通过压力挤出，形成液滴，液滴体积为1-50微升，滴入盐酸溶液，利用重力作用， 液滴即可固化成微载体；4、酸液浸泡将制成的微载体在盐酸溶液中浸泡5-30分钟；
5、pH调节用0. lmol/L氢氧化钠溶液，反复调节pH至中性；6、表面固化在搅拌条件下，将带有微载体的溶液加热到70-90°C，冷却后再加热，重复一到三次；7、洗涤取出制备的微载体，反复用二次水冲洗，去除表面残留的盐酸溶液。8、低温干燥，得到大孔微载体，粒径范围为150-2000 μ m(图3、4)；9、钴60灭菌后备用。实施例三1、玉米醇溶蛋白溶液的制备将2-3克玉米醇溶蛋白粉末和0. 1-0. 3g氧化铁粉末溶解于30ml氢氧化钠(0. lmol/L)溶液中，搅拌至完全溶解，鼓气1_10分钟；2、盐酸溶液的制备制成100ml (0.01-lmol/LHCl，0. OOlg表面活性剂)盐酸溶液；3、玉米醇溶蛋白微球的制备将玉米醇溶蛋白溶液通过压力挤出，形成液滴，液滴体积为1-50微升，滴入盐酸溶液，利用重力作用，液滴即可固化成微载体；4、酸液浸泡将制成的微载体在盐酸溶液中浸泡5-30分钟；5、pH调节用0. lmol/L氢氧化钠溶液，反复调节pH至中性；6、表面固化在搅拌条件下，将带有微载体的溶液加热到70-90°C，冷却后再加热，重复一到三次；7、洗涤取出制备的微载体，反复用二次水冲洗，去除表面残留的盐酸溶液。8、低温干燥，得到空心磁性微载体，粒径范围为500-2000 μ m ；9、紫外灭菌后备用。实施例四1、玉米醇溶蛋白溶液的制备将玉米醇溶蛋白溶于体积浓度为55-95%的醇溶液中，使得终浓度达到30-500g/L，得到蛋白的醇溶液，真空脱气；2、玉米醇溶蛋白薄膜的制备在模板上反复涂布，得到50-1000 μ m厚度均勻的薄膜；3、玉米醇溶蛋白薄膜的固化100-121 ，0. l_lMPa，处理1_30分钟，进行表面固化，干燥收获；4、玉米醇溶蛋白颗粒的制备将固化后的薄膜在水溶液中浸泡1-30分钟，待软化后，使用切割机切割成边长为50-1000 μ m的立方体；5、玉米醇溶蛋白颗粒的表面整形将切割好的立方体过筛，再进行1-12小时的球磨，最终得到较为圆整的球形微载体。粒径范围为50-1000μπι(图5、6)。6、紫外灭菌后备用。实施例五1、小麦醇溶蛋白溶液的制备将小麦醇溶蛋白溶于体积浓度为55-95%的醇溶液中，使得终浓度达到30-500g/L，得到蛋白的醇溶液，真空脱气；2、小麦醇溶蛋白薄膜的制备在模板上反复涂布，得到50-1000 μ m厚度均勻的薄膜；3、小麦醇溶蛋白颗粒的制备将干燥后的薄膜在水溶液中浸泡1-30分钟，待软化后，使用切割机切割成边长为50-1000 μ m的立方体；
4、小麦醇溶蛋白颗粒的固化100-121 ，0. l_lMPa，处理1_30分钟，进行表面固化，干燥收获；5、小麦醇溶蛋白颗粒的表面整形将切割好的立方体过筛，再进行1-12小时的球磨，最终得到较为圆整的球形微载体。粒径范围为50-1000μπι。6、将微载体以蒸馏水或者PBS溶液溶胀后，高温灭菌。实施例六1、玉米醇溶蛋白溶液的制备将谷物醇溶蛋白溶于体积浓度为55-95%的醇溶液中，使得终浓度达到30-500g/L，得到谷物醇溶蛋白的醇溶液，真空脱气；2、玉米醇溶蛋白薄膜的制备在模板上反复涂布，得到50-1000 μ m厚度均勻的薄膜；3、玉米醇溶蛋白颗粒的制备粉碎机将干燥后的薄膜粉碎，过筛得到不同大小颗粒；4、玉米醇溶蛋白颗粒的固化将上步得到的颗粒均勻并不相互接触的分散于玻璃、硫酸纸或者疏水介质表面，100-121 ，0. 1-lMPa，处理1_30分钟，进行表面固化，干燥收获，最终得到较为圆整的球形微载体。粒径范围为50-1000μπι。5、钴60灭菌后备用。实施例七1、玉米醇溶蛋白溶液的制备将谷物醇溶蛋白溶于体积浓度为55-95%的醇溶液中，使得终浓度达到30-500g/L，得到谷物醇溶蛋白的醇溶液，真空脱气；2、玉米醇溶蛋白薄膜的制备在模板上反复涂布，得到50-1000 μ m厚度均勻的薄膜；3、玉米醇溶蛋白颗粒的制备粉碎机将干燥后的薄膜粉碎，过筛得到不同大小颗粒；4、玉米醇溶蛋白颗粒的固化将上步得到的颗粒均勻喷洒于充满蒸汽的反应塔中，100-121 ，0. 1-lMPa，处理2秒钟-30分钟，进行表面固化，干燥收获，最终得到较为圆整的球形微载体。粒径范围为50-1000 μ m。5、将微载体以蒸馏水或者PBS溶液溶胀后，高温灭菌。实施例八1、所得微载体经0. lmol/L氢氧化钠溶液浸泡24小时，除去内毒素；2、调节pH至中性；3、将微载体以蒸馏水或者PBS溶液溶胀后，高温灭菌。4、经过去热源处理的微载体与Vero细胞培养，其细胞增殖速率不受影响(图10)。实施例九1、所得微载体经0. 25 %胰酶溶液消化2小时；2、消化处理的微载体在Vero细胞培养过程中的细胞再贴壁及其后的增殖速率与商业化产品Cytodex 1无显著差异(图11)。
权利要求
1.一种由谷物醇溶蛋白制备的用于细胞大规模培养的微载体，其特征是所述的该微载体是表面为光滑或具有大孔、内部为空心、多孔或实心结构的直径为50-2000 μ m颗粒。
2.如权利要求1所述的由谷物醇溶蛋白制备的用于细胞大规模培养的微载体，其特征是所述的微载体的直径为150-2000 μ m颗粒。
3.如权利要求1或2所述的由谷物醇溶蛋白制备的用于细胞大规模培养的微载体，其特征是所述的谷物醇溶蛋白是玉米醇溶蛋白或小麦醇溶蛋白；所述的微载体呈球形或类球形。
4.一种权利要求1或2所述的微载体制备方法，其特征通过方法一、二或者三的以下步骤分别获得方法一a)将谷物醇溶蛋白溶于pH为11-13的碱溶液，使得终浓度达到30-100g/L，得到谷物醇溶蛋白的碱溶液；超声15分钟除去溶液中的气泡；b)制备过程中，调节谷物醇溶蛋白溶液浓度和液滴体积得到不同大小的颗粒，加入浓度为0. 1-2(^八％或0. 1-20 八％的增塑剂；所述的增塑剂为油酸、硬脂酸、柠檬酸或甘油；c)将醇溶蛋白的碱溶液缓慢滴入pH为1-5、含有0.001-0.表面活性剂的酸溶液中，醇溶蛋白的碱溶液液滴体积为1-50微升，固化形成直径在150-2000 μ m的微球；所述的表面活性剂包括但不限于十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基硫酸钠；d)将制成的微载体在盐酸溶液中浸泡5-30分钟；然后用0.lmol/L氢氧化钠溶液，反复调节PH至中性；e)在搅拌条件下，将带有微载体的溶液加热到70-90°C，冷却后再加热，重复一到三次进行表面固化，用水洗涤，低温干燥，灭菌，得到表面光滑、内部空心多孔或者内外均大孔的微载体，粒径范围为150-2000 μ m。方法二a)将谷物醇溶蛋白溶于体积浓度为55-95%的醇溶液中，使得终浓度达到30-500g/L， 得到谷物醇溶蛋白的醇溶液；b)制备成厚度为50-1000μ m的薄膜；c)将b)获得的薄膜在100-121°C，0.1-lMPa，处理1-30分钟，进行表面固化；d)粉碎机粉碎或者切割机切割，过筛，得到50-1000μ m的立方体的粗颗粒，再进行球磨，获得粒径范围为50-1000 μ m的圆整的球形微载体；或者e)将b)获得的薄膜在高塔造粒、过筛，分散于玻璃、硫酸纸或者疏水介质表面进行造粒，固化条件为在100-121°C、0. I-IMPa下，处理1_30分钟，最后干燥收获圆整的球形微载体，粒径范围为50-1000 μ m ；或者方法三a)将谷物醇溶蛋白溶于体积浓度为55-95%的醇溶液中，使得终浓度达到30-500g/L， 得到谷物醇溶蛋白的醇溶液；b)用喷雾干燥、高塔造粒但不限于这两种方法进行造粒；c)球磨后过筛；d)在100-121°C、0. I-IMPa下，处理1_30分钟，进行表面固化，干燥。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于采用了在100-121°C和0.I-IMPa下处理谷物醇溶蛋白1-30分钟，进行表面固化和聚合，获得的微载体密度为l-1.3g/cm3。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于对获得的微载体产品进行灭菌后处理 以钴60射线辐照、紫外线辐照、或者是在将微载体以蒸馏水或者PBS溶液溶胀后，高温灭菌。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于还对获得的微载体表面进行化学修饰， 使其带有促进细胞黏附的正电荷；或交联胶原蛋白成分。
全文摘要
本发明涉及基于谷物蛋白的、用于大规模培养细胞的微载体、制备方法和用途。微载体成球形或类球形，空心、实心、大孔和磁性微载体的直径为50-2000μm。由于谷物醇溶蛋白具备良好的生物相容性、疏水性和可降解特性，以及在湿态下有着优良的力学性能，所以能够较长时间维持微载体的结构，既可以支持大量细胞生长，又能长期维持细胞活性和功能。本发明还提供能满足在力学、形态、灭菌、可降解、无热源、可回收等多方面要求的微载体制备方法，可以根据需要在较宽的范围内控制微载体的各项参数，如直径、孔径、密度等，制成的微载体成本低廉，有利于工业化生产。其大规模、高密度培养的细胞可用于生产疫苗、抗体及组织工程领域。
文档编号C08J9/00GK102516778SQ20111038834
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者王瑾晔, 韩亦龙 申请人:上海交通大学