专利名称：一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因治疗及新材料领域，具体涉及一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物及应用。
背景技术：
基因治疗是一种利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，从而使疾病得到治疗的技术。基因载体是基因治疗领域的核心技术之一。基因载体通常分为病毒载体和非病毒载体.在多数情况下，病毒载体的转染效率高，但存在潜在毒性、免疫原性等问题，限制了其在临床治疗中的应用；非病毒载体虽然可以克服上述问题， 但是不利的生物分布以及低效的胞内运转，导致活性基因转染率低.因此提高非病毒基因载体的转染率是当前研究的关键。阳离子聚合物，如壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵等是最为常用的几种非病毒基因载体聚合物材料。这些聚合物材料作为基因载体材料的主要问题是，其与DNA或RNA形成的复合物粒子易在生理环境下对一些蛋白质产生特异性的相互作用而产生吸附，从而影响其细胞内吞作用以及从内涵体或溶酶体中逃逸的速度继而影响转染效率。克服该问题的办法主要通过化学改性的方式，如通过化学修饰方法在其结构中引入PEG链段，但是该方式往往同时也消耗了聚阳离子结构中的氨基，使其压缩 DNA的能力下降。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物及应用，该功能性寡聚物制备工艺简单、易于实施；该功能性寡聚物与其它聚阳离子材料一起用作非病毒基因载体，具有低细胞毒性、良好的抗血清稳定性和高的基因转染效率，有望用于临床基因治疗。本发明的技术方案一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物P(His-C0-DMAEL)，由烯丙基组氨酸衍生物，2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)和含乳糖单体
2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基-O，3，4，6-四-氧-乙酰基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3， 6-三-氧-乙酰基-β -D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)通过以水溶性硫代酯作为分子量调节剂自由基聚合制得，分子量为0. 5-20KDa，分子量分布为1. 0-2. 0，MA-His-OMe和MAEL摩尔比为
3-15 1。一种所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备方法，以MA-His-OMe 和MAEL为共单体，以2，2'-偶氮二 O-甲基丙腈)(AIBN)或4，4'-偶氮(4-氰基戊酸) (ACVA)为引发剂，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)为连转移剂制备，步骤如下1)以组氨酸甲酯和烯丙基苯并三氮唑为原料合成2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)
将4. 8g苯并三氮唑溶解在25ml 二氯甲烷中，加入1. 2g 二氯亚砜，搅拌30min后， 加入0. 86g甲基丙烯酸，继续反应池，有机相用浓度为2摩尔/升的氢氧化钠溶液萃取三次，有机相用硫酸钠干燥12h，旋蒸除去二氯甲烷，产物用快速层析柱纯化，得到烯丙基苯并三氮唑。将1. 87g烯丙基苯并三氮唑溶解在50ml 二氧六环中；将1. 69g组氨酸甲酯溶解在 IOml去离子水中，磁力搅拌条件下，调节其pH值为8. 0，然后将溶解在二氧六环中的烯丙基苯并三氮唑缓慢滴加至上述组氨酸甲酯溶液中进行反应，并用薄层色谱监测反应进程，待薄层色谱显示烯丙基苯并三氮唑消耗完全时，停止搅拌，用质量百分比浓度为10%的稀盐酸调节溶液PH值至中性，旋蒸除去二氧六环，过滤除去不溶物并旋蒸除去水相，产物经冷冻干燥后溶解在无水乙醇中并过滤，再将滤液旋干并真空干燥，得到MA-His-OMe ；2)2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基，3，4，6_四-氧-乙酰基-β _D_半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)的制备将20g乳糖、IOg无水醋酸钠加到120ml醋酸酐中，混合并在回流温度下反应2h， 反应结束后将产物倒入冰水中搅拌，过滤并用水洗涤固体三次，置于空气中干燥，然后用乙醇重结晶得到八乙酰基乳糖；在20ml 二氯甲烷中，加入5g八酰基乳糖和4. 8ml甲基丙烯酸羟乙酯以及2mL三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反应池，然后室温反应12h，反应结束后加入 20ml去离子水，分离后依次用水、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤二氯甲烷相至中性，然后用硫酸钠干燥，旋蒸除去二氯甲烷并用色谱柱分离，得到MAEL ；3)用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备0. 96g MA-His-OMe、0· 5g MAEL、0. 0075g ACVA 和 0. 023g CPADB 溶解在 IOml N,
N' -二甲基甲酰胺中，冷冻除氧三次后密封置于70°C水浴中反应48小时，反应结束后， 先用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析48h并冷冻干燥，然后将产物溶解在无水乙醇中，加入Iml质量百分比浓度为30%甲醇钠的甲醇溶液并反应2小时，再用截留分子量为3500的透析袋在去离子水透析48小时并冷冻干燥，得到功能性寡聚物 P(His-co-DMAEL)。一种所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，将该功能性寡聚物与聚阳离子材料混合制备DNA或RNA复合物，用作非病毒基因载体材料，并进行细胞转染试验。所述聚阳离子材料包括壳聚糖(以下简称为CS)、聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺 (PEI)和聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(PDMMC)。所述DNA或RNA复合物的制备方法是，先将0. 1-2. 0 μ g/μ 1的功能性寡聚物与 DNA或RNA室温下混合均勻并放置15分钟；然后再将0. 1-2. 0 μ g/ μ 1的聚阳离子材料溶液滴加入上述DNA混合液中，振动搅拌10秒使溶液混合均勻并放置15分钟，即可制得Ν/Ρ =0.25 1-40 1 比的 DNA 或 RNA 复合物。所述功能性寡聚物与DNA或RNA的质量比为0-200 1。所述功能性寡聚物与聚阳离子材料的质量比为0-40 1。本发明的主要优点一些常用的聚阳离子材料单独作为基因载体材料时，往往或因毒性大或转染效率低而，难以临床应用。本发明的方法通过引入一种多功能性的非离子寡聚物，既得到了对质粒DNA具有良好保护作用、稳定性高的复合纳米粒子，同时又改善了复合粒子与细胞膜表面的结合作用以及质粒DNA在细胞之内从溶酶体/内涵体中的逃离效率，从而使复合粒子对HeLa、H印G2、NIH3T3等细胞的转染效率较未改性聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵等聚阳离子大幅提高，有望达到临床应用水平，同时经本发明方法改性的聚合物较未改性聚合物在细胞毒性方面也大幅下降。
图1为聚[2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯-co-2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基-(2，3，4，6-四-氧-乙酰基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙酰基-β -D-吡喃葡糖糖苷]400Μ核磁谱图。图2为不同聚阳离子与DNA形成的复合物在相同Ν/Ρ比时的体外细胞转染绿色荧光图以及相对应的明场图。图3为相同聚阳离子与DNA形成的复合物在不同Ν/Ρ比时的体外细胞转染绿色荧光图以及相对应的明场图。图 4 为不同 P (His-co-DMAEL)含量的 PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)复合物在相同 N/ P比时的体外细胞转染绿色荧光图以及相对应的明场图。图 5 为 PLL/DNA、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)复合物在 0. 5%牛血清白蛋白(BSA) 溶液中粒径随时间的变化图，复合物DNA用量为3 μ g，N/P = 15 1，功能性寡聚物与聚阳离子材料的质量比为4 1，培育时间依次为0、6、Mh。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明方案作进一步说明，但此说明并不限制本发明的范围。实施例一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备方法，以MA-His-OMe和 MAEL为反应物，以2，2'-偶氮二 O-甲基丙腈)(以下简称为AIBN)或4，4'-偶氮(4-氰基戊酸)(ACVA)为引发剂，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)为连转移剂制备，步骤如下l)MA-His-0Me 的制备4. 8g苯并三氮唑溶解在25ml 二氯甲烷中，加入1. 2g 二氯亚砜，搅拌30min后，加入0. 86g甲基丙烯酸，继续反应2h。反应结束后，有机相用2摩尔每升的氢氧化钠溶液萃取三次，用硫酸钠干燥12h。旋蒸除去二氯甲烷，产物用快速层析柱纯化，得到烯丙基苯并三氮唑。将1.69g组氨酸甲酯溶解在IOml去离子水中，磁力搅拌条件下，调节其pH值至 8. 0左右，将1. 87g烯丙基苯并三氮唑溶解在50ml 二氧六环中，然后缓慢滴加至组氨酸甲酯溶液中反应，并用薄层色谱监测反应进程，待薄层色谱显示烯丙基苯并三氮唑消耗完全，停止搅拌，用稀盐酸调节溶液PH值至中性，旋蒸除去二氧六环，过滤除去不溶物并旋蒸除去水相。产物冷冻干燥后溶解在无水乙醇并过滤，将滤液旋干并真空干燥，得到2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯。2) MAEL 的制备；
将20g乳糖、IOg无水醋酸钠加到120ml醋酸酐中，混合并在回流温度下反应2h。 反应结束后将产物倒入冰水中搅拌，过滤并用水洗涤固体三次，置于空气中干燥，然后用乙醇重结晶得到八乙酰基乳糖。在20ml 二氯甲烷中，加入5g八酰基乳糖和4. 8ml甲基丙烯酸羟乙酯以及2mL的三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反应2h，然后室温反应12h。反应结束后加入20ml去离子水并依次用水、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤二氯甲烷相至中性。接着用硫酸钠干燥，旋蒸除去二氯甲烷，并用色谱柱分离，得到MAEL。3)功能性寡聚物P(His-co-DMAEL)的制备。0. 96g MA-His-OMe,0. 5g MAEL、0. 023g CPADB、0. 0075g ACVA 溶解在 lOmlN，
N' -二甲基甲酰胺中，冷冻除氧三次后密封置于70°C水浴中反应48小时。反应结束后，先用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析4 并冷冻干燥，然后将产物溶解在无水乙醇中，加入Iml 30%的甲醇钠/甲醇溶液并反应2小时，再用截留分子量为3500的透析袋在去离子水透析48小时并冷冻干燥，得到P(His-C0-DMAEL)。—种所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，将该功能性寡聚物与聚阳离子材料混合制备DNA或RNA复合物，用作非病毒基因载体材料，并进行细胞转染试验。1)PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)、PLL/DNA 细胞基因转染复合物的制备将P(His-co-DMAEL)溶于pH = 7. 4的0. OlM的磷酸盐缓冲液(以下简称PBS)， 配制成lmg/ml的P(His-C0-DMAEL)溶液，将配置好的浓度为0. 2 μ g/μ L的经绿色荧光蛋白标记的质粒DNA溶液，用PBS稀释后等体积加入到P (His-co-DMAEL)溶液中，DNA用量为 lyg，混合后室温静置15min。然后根据N/P = 5 1或者15 1，将计算好的lmg/ml的PLL 溶液用PBS稀释后等体积加入，P(His-C0-DMAEL)与PLL质量比为4 1，混合并室温静置 15min，得到 PLL/DNA/P (Hi s-co-DMAEL)复合物。用等体积的 PBS 溶液代替 P (Hi s-co-DMAEL) 溶液，按与上述相同的方法制备得到PLL/DNA复合物。2) PEI/DNA/P (His-co-DMAEL)、PEI/DNA 细胞基因转染复合物的制备将P(His-co-DMAEL)溶于 pH = 7. 4 的 0. OlM 的 PBS，配制成 lmg/ml 的 P(His-C0-DMAEL)溶液，将配置好的浓度为0. 2 μ g/μ L的经绿色荧光蛋白标记的质粒DNA 溶液，用PBS稀释后等体积加入到P(His-C0-DMAEL)溶液中，DNA用量为1 μ g，混合后室温静置15min。然后根据Ν/Ρ =15 1，将计算好的lmg/ml的PEI溶液用PBS稀释后等体积加入，P(His-C0-DMAEL)与PEI质量比为4 1，混合并室温静置15min，得到PEI/DNA/ P(His-C0-DMAEL)复合物。用等体积的PBS溶液代替P (His-co-DMAEL)溶液，按与上述相同的方法制备得到PEI/DNA复合物。3) PDMMC/DNA/P (His-co-DMAEL)、PDMMC/DNA 细胞基因转染复合物的制备将P(His-co-DMAEL)溶于 pH = 7. 4 的 0. OlM 的 PBS 溶液，配制成 lmg/ml 的 P(His-C0-DMAEL)溶液，将配置好的浓度为0. 2 μ g/μ L的经绿色荧光蛋白标记的质粒DNA 溶液，用PBS稀释后等体积加入到P(His-C0-DMAEL)溶液中，DNA用量为1 μ g，混合后室温静置15min。然后根据Ν/Ρ = 15 1，将计算好的lmg/ml的PDMMC溶液用PBS稀释后等体积加入，P(His-co-DMAEL)与PDMMC质量比为4 1，混合并室温静置15min，得到PDMMC/ DNA/P (His-co-DMAEL)复合物。用等体积的PBS溶液代替P (His-co-DMAEL)溶液，按与上述相同的方法制备得到PDMMC/DNA复合物。4) CS/DNA/P (His-co-DMAEL)、CS/DNA 细胞基因转染复合物的制备将P(His-co-DMAEL)溶于 pH = 7. 4 的 0. OlM 的 PBS 溶液，配制成 lmg/ml 的 P(His-C0-DMAEL)溶液，将配置好的浓度为0. 2 μ g/μ L的经绿色荧光蛋白标记的质粒DNA 溶液，用PBS稀释后等体积加入到P(His-C0-DMAEL)溶液中，DNA用量为1 μ g，混合后室温静置15min。然后根据N/P = 15 1，将计算好的lmg/ml的CS溶液(pH = 5. 5的0. OlM的 CH3C00Na/CH3C00H 缓冲溶液)用 pH = 5. 5 的 0. OlM 的 CH3C00Na/CH3C00H 缓冲溶液稀释后等体积加入，P (His-co-DMAEL)与CS质量比为4 1，混合并室温静置15min，得到CS/DNA/ P(His-C0-DMAEL)复合物。用等体积的PBS溶液代替P (His-co-DMAEL)溶液，按与上述相同的方法制备得到CS/DNA复合物。5)不同功能性寡聚物含量的PLL/DNA/P(His-co-DMAEL)细胞基因转染复合物的制备将P(His-co-DMAEL)溶于 pH = 7. 4 的 0. OlM 的 PBS 溶液，配制成 lmg/ml 的 P(His-C0-DMAEL)溶液，将配置好的浓度为0. 2 μ g/μ L的经绿色荧光蛋白标记的质粒DNA 溶液，用PBS稀释后等体积加入到P(His-C0-DMAEL)溶液中，DNA用量为1 μ g，混合后室温静置15min。然后根据N/P = 15 1，将计算好的lmg/ml的PLL溶液用PBS稀释后等体积加入，混合并室温静置15min，得到P(His-co-DMAEL)与PLL质量比分别为1 1,2 1,4 1， 8 1 的复合物，分别表示 PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)-1，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -2, PLL/DNA/P(His-co-DMAEL) -4，PLL/DNA/P(His-co-DMAEL) -8。6)不同聚阳离子与DNA形成的复合物在相同N/P比时的体外细胞转染将HeLa细胞以每孔5X104的细胞数种入M孔培养板并培育M小时，然后用 0. 5ml含有不同基因转染复合物的含10%牛血清白蛋白FBS的培养基替换原培养基并继续培育，DNA的用量为1 μ g每孔，N/P = 15 LP(His-Co-DMAEL)与聚阳离子的质量比为 4 1，M小时后，用0.5ml含10% FBS的培养基替换含有基因转染复合物的培养基并继续培育，24h后用荧光倒置显微镜观察。结果如图2所示。图 2 表明，在相同 N/P 比时，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)、PEI/DNA/ P(His-co-DMAEL)、PDMMC/DNA/P (His-co-DMAEL), CS/DNA/P (His-co-DMAEL)复合物较对应的PLL/DNA、PEI/DNA, PDMMC/DNA、CS/DNA复合物对HeLa细胞的转染效率均显著提高。7)相同聚阳离子与DNA形成的复合物在不同N/P比时的体外细胞转染将HeLa细胞以每孔5X104的细胞数种入M孔培养板并培育M小时，然后用 0. 5ml含有基因转染复合物的含10% FBS的培养基替换原培养基并继续培育，DNA的用量为 Iyg 每孔，N/P = 5 1 或者 15 1，P (His-CO-DMAEL)与 PLL 的质量比为 4 1，24 小时后，用0. 5ml含10% FBS的培养基替换含有基因转染复合物的培养基并继续培育，24h后用荧光倒置显微镜观察。结果如图3所示。图3表明，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)复合物在N/P = 5 1以及15 1时，较对应的PLL/DNA复合物对HeLa细胞的转染效率均显著提尚。8)不同 P (Hi s-co-DMAEL)含量的 PLL/DNA/P (Hi s-co-DMAEL)复合物在相同 N/P 比时的体外细胞转染将HeLa细胞以每孔5 X IO4的细胞数种入M孔培养板并培育M小时，然后用 0.5ml 含有 PLL/DNA/P(His-co-DMAEL)-1，PLL/DNA/P(His-co-DMAEL)-2，PLL/DNA/ P(His-co-DMAEL) -4，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -8 或者 PLL/DNA 复合物的含 10% FBS 的培养基替换原培养基并继续培育，DNA的用量为Iyg每孔，N/P= 15 1，M小时后，用0. 5ml 含10% FBS的培养基替换含有基因转染复合物的培养基并继续培育，24h后用荧光倒置显微镜观察。结果如图4所示。图 4 表明，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)-1，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -2，PLL/DNA/ P (His-co-DMAEL)-4，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -8 复合物在 N/P = 15 1 时，较对应的 PLL/DNA复合物对HeLa细胞的转染效率均显著提高。该复合物稳定试验在0. OlM 的 PBS 溶液中制备 PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)-1、PLL/DNA/ P (His-co-DMAEL) -2、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -4、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -8 以及 PLL/DNA复合物，每种复合物DNA用量均为3 μ g，Ν/Ρ = 15 1，然后往复合物溶液中加入牛血清白蛋白BSA溶液，使BSA最终浓度为0. 5%并混合均勻。37°C条件下分别培育0，6， Mh，然后用动态光散射DLS测定复合物粒径。结果如图5所示。图 5 表明，在蛋白质溶液中，PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)-1、PLL/DNA/ P (His-co-DMAEL) -2、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -4、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL) -8 复合物较 PLL/DNA复合物稳定性均显著提高。
权利要求
1.一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物P(His-C0-DMAEL),其特征在于 由烯丙基组氨酸衍生物，2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)和含乳糖单体2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基_(2，3，4，6_四-氧-乙酰基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙酰基-β-D-卩比喃葡糖糖苷(MAEL)通过以水溶性硫代酯作为分子量调节剂自由基聚合制得，分子量为0. 5-20KDa,分子量分布为1. 0-2. 0，MA-His-OMe 和MAEL摩尔比为3-15 1。
2.一种如权利要求1所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备方法，其特征在于以MA-His-OMe和MAEL为共单体，以2，2'-偶氮二 O-甲基丙腈)(AIBN)或4， 4'-偶氮(4-氰基戊酸)(ACVA)为引发剂，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)为连转移剂制备，步骤如下1)以组氨酸甲酯和烯丙基苯并三氮唑为原料合成2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基) 丙酸甲酯(MA-His-OMe)将4. 8g苯并三氮唑溶解在25ml 二氯甲烷中，加入1. 2g 二氯亚砜，搅拌30min后，加入 0. 86g甲基丙烯酸，继续反应池，有机相用浓度为2摩尔/升的氢氧化钠溶液萃取三次，有机相用硫酸钠干燥12h，旋蒸除去二氯甲烷，产物用快速层析柱纯化，得到烯丙基苯并三氮唑。将1. 87g烯丙基苯并三氮唑溶解在50ml 二氧六环中；将1. 69g组氨酸甲酯溶解在IOml 去离子水中，磁力搅拌条件下，调节其PH值为8.0，然后将溶解在二氧六环中的烯丙基苯并三氮唑缓慢滴加至上述组氨酸甲酯溶液中进行反应，并用薄层色谱监测反应进程，待薄层色谱显示烯丙基苯并三氮唑消耗完全时，停止搅拌，用质量百分比浓度为10%的稀盐酸调节溶液PH值至中性，旋蒸除去二氧六环，过滤除去不溶物并旋蒸除去水相，产物经冷冻干燥后溶解在无水乙醇中并过滤，再将滤液旋干并真空干燥，得到MA-His-OMe ；2)2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基，3，4，6_四-氧-乙酰基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)的制备将20g乳糖、IOg无水醋酸钠加到120ml醋酸酐中，混合并在回流温度下反应2h，反应结束后将产物倒入冰水中搅拌，过滤并用水洗涤固体三次，置于空气中干燥，然后用乙醇重结晶得到八乙酰基乳糖；在20ml 二氯甲烷中，加入5g八酰基乳糖和4. 8ml甲基丙烯酸羟乙酯以及2mL三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反应池，然后室温反应12h，反应结束后加入20ml 去离子水，分离后依次用水、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤二氯甲烷相至中性，然后用硫酸钠干燥，旋蒸除去二氯甲烷，用色谱柱分离，得到MAEL ；3)用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备0. 96g MA-His-OMe,0. 5g MAEL、0. 0075g ACVA和 0. 023g CPADB溶解在 IOml N, N' -二甲基甲酰胺中，冷冻除氧三次后密封置于70°C水浴中反应48小时，反应结束后，先用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析4 并冷冻干燥，然后将产物溶解在无水乙醇中，加入Iml质量百分比浓度为30%甲醇钠的甲醇溶液并反应2小时，再用截留分子量为 3500的透析袋在去离子水透析48小时并冷冻干燥，得到功能性寡聚物P(His-C0-DMAEL)。
3.—种如权利要求1所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，其特征在于将该功能性寡聚物与聚阳离子材料混合制备DNA或RNA复合物，用作非病毒基因载体材料，并进行细胞转染试验。
4.根据权利要求3所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，其特征在于所述聚阳离子材料包括壳聚糖(以下简称为⑶)、聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)和聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(PDMMC)。
5.根据权利要求3所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，其特征在于所述DNA或RNA复合物的制备方法是，先将0. 1-2. 0 μ g/μ 1的功能性寡聚物与DNA或 RNA室温下混合均勻并放置15分钟；然后再将0. 1-2. 0μ g/μ 1的聚阳离子材料溶液滴加入上述DNA混合液中，振动搅拌10秒使溶液混合均勻并放置15分钟，即可制得Ν/Ρ = 0.25 1-40 1比的DNA或RNA复合物。
6.根据权利要求3所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，其特征在于所述功能性寡聚物与DNA或RNA的质量比为0-200 1。
7.根据权利要求3所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，其特征在于所述功能性寡聚物与聚阳离子材料的质量比为0-40 1。
全文摘要
一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物，由MA-His-OMe和MAEL通过以水溶性硫代酯作为分子量调节剂自由基聚合制得；其制备方法是以MA-His-OMe和MAEL为共单体，以AIBN)或ACVA为引发剂，以CPADB为连转移剂制备；将该功能性寡聚物与聚阳离子材料混合制备DNA或RNA复合物，用作非病毒基因载体材料，并进行细胞转染试验。本发明的优点该功能性寡聚物对质粒DNA具有良好保护作用，改善了复合粒子与细胞膜表面的结合作用以及质粒DNA在细胞之内从溶酶体/内涵体中的逃离效率，从而使复合粒子对HeLa等细胞的转染效率大幅提高，毒性大幅下降，有望达到临床应用水平。
文档编号C08F2/38GK102532411SQ20111044016
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者周德重, 李从欣, 胡玉玲, 郭天瑛 申请人:南开大学