专利名称：直链形肝素修饰的生物型人造血管的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种直链形肝素修饰的生物型人造血管。
背景技术：
人造血管主要用于人体组织血管的替代修复。目前基于人造材料(如涤纶、聚四氟乙烯)的大口径人造血管已应用于临床，而小口径人造血管(直径小于6mm) —直没有临床产品。主要原因有小口径血管的血流速度慢、血压低，容易发生急性血栓、吻合处内膜增生、动脉瘤、感染以及动脉粥样硬化。目前临床治疗中，小口径血管移植替代物多为自体血管(如取自大隐静脉的血管组织)，然而许多患者可能由于其它的血管疾病或血管组织缺失，无法提供可移植的血管。小口径人工血管因而在冠状动脉、脑血管、糖尿病足修复、血管造瘘及体外血液透析等治疗途径中有着迫切的临床需要。脱细胞基质是通过对动物组织和器官进行固化和脱细胞等加工工序，获得的生物相容型的生物型基质，可以用于人体缺损组织的修复与重建，实现组织和器官的原位再生和功能恢复。相对于传统组织工程和再生医学中的人工型支架，脱细胞基质能保留生物组织异常复杂的成分和结构，因而具有人工材料无法比拟的化学和力学等生物性能。然而脱细胞基质虽然具有天然结构和成分，其表面性质可能仍然无法满足生物材料相容性和组织再生的需求。基于脱细胞基质的小口径血管(即生物型血管)目前存在以下问题:血栓一般会在半年内时间形成；血管内表面内皮化以及血管平滑肌细胞对植入型材料的再生重塑过程难以发生。通过对血管内表面进行抗凝修饰是一种最常用的减少血管内血栓形成和提高材料血液相容性的方法。而肝素材料在大口径血管产品中已经得到了应用(参考文献:1.Daenens K, Schepers S, Fourneau 1.Heparin-bonded ePTFE grafts comparedwith vein grafts in femoropopliteal and femorocrual bypasses: 1-and 2-yearresults.J Vasc Surg 2009 ；49 (5):1210-62.Janczak D，Pupka A，Skora J.The useof the heparin-bonded ePTFE grafts for needs of he hemodialysis.Polim Med2010 ；40 (4):35-9 3.Pupka A，Janczak D，Szyber PP.The heparin-bonded ePTFEgrafts in revascularisation of the lower limbs.Polim Med 2010 ；40 (I):9-144.Hugl B，Nevelsteen A，Daenens K.PEPE II—a multicenter study with anend-point heparin-bonded expanded polytetrafluoroethyIene vascular graftfor above and below knee bypass surgery-determinants ofpatency.J CardiovascSurg (Torino) 2009 ；50(2):195-203.)。肝素是一种重要的细胞外基质糖胺聚糖物质，由D-β -葡糖醛酸(或L-α -艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成，高度带负电荷，胺基硫酸化程度高。肝素结构如式I所表示，其结构呈 不均一状态，包括氨基硫酸化的数目和位置不均一，平均分子量不均一等，其中氨基葡萄糖残基的硫酸化大部分发生在C6位，少部分发生在C3和C2位氨基上，而乙酰化选择性发生在氨基葡萄糖的C2位氨基上。氨基葡萄糖C3上的硫酸化是结合抗凝血酶III (AntiThrombin-1II)的重要结构。而由于其带有很高的负电荷密度，
各糖环之间有较强的排斥力因而其分子链不易交叉扭曲，呈一种线性的空间结构。
权利要求
1.I所示的末端胱胺化肝素
2.根据权利要求1所述的末端胱胺化肝素，其特征在于:所述式I所示的末端胱胺化肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团；所述式I中的η = 4-8或8_16。
3.II所示的末端巯基化肝素:
4.根据权利要求3所述的末端胱胺化肝素，其特征在于:所述式II所示的末端胱胺化肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团；所述式II中的η = 4-8或8_16。
5.备式I所示的末端胱胺化肝素的方法，包括下述步骤:在硼氰化钠存在下，使式III所示的肝素与胱胺进行反应，得到式I所示的末端胱胺化肝素；
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述反应在硼酸钠缓冲液中进行，所述反应的反应体系的pH值为8.50±0.03 ;所述反应的反应温度为室温，反应时间为48±0.5小时； 所述反应中，肝素与胱胺的摩尔比1: 10-1: 15； 所述硼氰化钠的加入量与胱胺量摩尔比为1: 0.5-1: 1.0。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述式III所示的肝素中每个二糖单元含1.8-2.5个磺酸基团；所述式III中的η = 4-8或8_16。
8.备式II所示的末端巯基化肝素的方法，是将权利要求1中式I所示的末端胱胺化肝素在还原剂的作用下使二硫键断裂形成巯基得到的；其中所述还原剂具体为TCEP。
9.权利要求1或2所述末端胱胺化肝素或权利要求3或4所述的末端巯基化肝素在制备抗凝剂中的应用或在植入性医用材料抗凝修饰中的应用。
10.一种制备直链肝素修饰的生物型人工血管的方法，包括下述步骤: 1)采用能分别与巯基和氨基进行反应的具有双向官能团的偶联剂对生物型人工血管内表面进行氨基活化处理； 2)将活化后的生物型人工血管与权利要求1或2中所述末端巯基化肝素进行反应，得到直链肝素修饰的生物型人工血管。
11.根据权利要求10所述的方法其特征在于:步骤I)中所述氨基活化处理的活化度为 1% -100% ； 步骤I)中所述具有双向官能团的偶联剂为SM(PEG)2 ； 采用SM(PEG)2对生物型人工血管内表面进行活化处理的方法如下:1)将生物型人工血管的一端标记长度并用夹子夹持，把SM(PEG)2的DMSO溶液加入到生物型人工血管内部，然后再加入DPBS缓冲液使待处理的人工血管内表面完全浸没至标记长度，然后将另一端以同样的夹子夹持；2)将生物型人工血管悬浮于容器中，在搅拌状态下于37±0.5°C反应30± I分钟，吸出生物型人工血管中的溶液并用DPBS缓冲液洗涤血管内壁。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于:步骤2)中所述末端巯基化肝素的加入量以其末端的巯基计，其为所述人工血管的内表面上氨基摩尔量的1-100% ； 所述反应的反应温度为37±0.5°C，反应时间为12±0.5小时。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于:步骤I)中所述氨基活化处理的活化度为50%，在氨基活化处理的过程中，SM(PEG)2加入量与人工血管内表面氨基的摩尔比为1.5: 1-2.0: I;步骤2)中所述末端巯基化肝素纳米材料的加入量以其末端的巯基计，其为人工血管内表面氨基摩尔量的50%。
14.权利要求10-13任一项所述方法制备得到的直链肝素修饰的生物型人工血管。
全文摘要
本发明公开了一种直链形末端胱胺化肝素及其修饰的生物型人造血管。本发明所提供的末端胱胺化肝素的结构式如式I所示。将末端胱胺化肝素通过还原剂将其中的二硫键切断，得到了可与血管支架材料反应的巯基位点；通过双向官能团的偶联剂将血管内表面活化，具有直链形状的肝素即可通过化学键共价固定于血管材料内表面，从而获得具有抗凝作用的复合型人造血管。相对于目前通过肝素羧基修饰材料表面的方法，末端位点反应最大程度保留了肝素分子的天然性质。当该直链肝素修饰于血管内表面，提高了血管内壁抵抗血小板粘附并明显提高了血管的抗凝血性能，结果未修饰的血管。
文档编号C08B37/10GK103087218SQ20111045392
公开日2013年5月8日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者罗莹, 刘晓鹏, 张伟 申请人:北京大学, 广东冠昊生物科技股份有限公司