专利名称：一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法
技术领域：
本发明属于多孔材料材料制备领域，特别涉及一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法。
背景技术：
壳聚糖(chitosan)是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，近年来在细胞培养和细胞产物研究领域，壳聚糖支架材料的研究非常广泛。另外，选用的壳聚糖是天然生物高分子，来源极为广泛、安全无毒，价格低廉，与合成高分子相比，具有良好的生物相容性和生物可降解性，因此壳聚糖水凝胶制备的微载体具有很高的环境友好性和生物安全性。在细胞培养的技术研究领域，多孔支架的制备方法有很多，常采用的有多孔浙滤法、冷冻干燥法、乳液冷冻干燥法等。Ikada等人以明胶水凝胶中的水作致孔剂，采用冷冻干燥的方法制备出多孔支架，但由于水凝胶在冷冻过程中热传导速率不同，导致冷冻速率和冷冻温度对支架的影响较大，从而使得支架的孔径在制备过程中不易控制，孔与孔之间的联通性较差。并且传统的冷冻干燥法制备出的壳聚糖支架在可塑性能、微观结构及孔与孔之间的连通性均难以满足细胞培养的技术这一研究领域的要求。因此本领域迫切需要提供一种微观结构均勻、易成型、孔与孔之间连通性较好的三维壳聚糖多孔支架材料。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述的技术问题而提供一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法。本发明的技术方案
一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法，采用乳液冷冻干燥法来制孔，进行缓慢冻干，使壳聚糖乳液中的醋酸铵以晶体的形式析出，并均勻分布在壳聚糖支架中，再高温96°C烘干， 使醋酸铵分解产生氨气来制孔；
同时根据相似相容原理，可采用乙醇除去支架中残余的正戊醇来进一步制孔，最终得到一种三维壳聚糖多孔支架。上述的一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法，具体包括如下步骤 (1)、制备过程所用的溶液的配制
①、溶有醋酸铵的壳聚糖酸溶液的配制
先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液；称取0. IOg的醋酸铵加入1% (V/V)醋酸溶液中，再称取3. Og壳聚糖，加入溶有醋酸铵的1% (V/V)醋酸溶液中即可；
所用的壳聚糖脱乙酰度为80-91% ；
②、1%(ν/ν)戊二醛溶液的配制量取Iml纯戊二醛并加蒸馏水定容至100ml，4°C保存备用；
③、壳聚糖乳液的配制
将溶有醋酸铵的壳聚糖酸溶液搅拌anin后，缓慢加入IOml正戊醇和0. 3ml的戊二醛， 再继续搅拌IOmin后，即可得到壳聚糖乳液；
④、5%的硼氢化钠的配制
称取5. Og的硼氢化钠加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氢化钠溶液；
(2)、冷冻干燥
将步骤(1)中所得的壳聚糖乳液均勻的涂抹在模具上，放置24h后，将壳聚糖乳液注入模具中进行冷冻干燥得到三维壳聚糖支架；
上述的冷冻干燥制孔过程控制预冻温度为_75°C，预冻时间为Ih ；—次干燥的隔板温度为_20°C，时间为20h;
(3)、烘干
将步骤(2)冷冻干燥后所得的三维壳聚糖支架放入96°C的烘箱中干燥35min，得到三维壳聚糖多孔支架粗品；
(4)、支架的洗涤
将步骤(3)烘干后的所得的三维壳聚糖多孔支架粗品放入70%的乙醇中浸泡Mh，再用去离子水反复清洗支架3次，用5%的硼氢化钠除去游离的戊二醛，再用大量的去离子水洗涤，即得到三维壳聚糖多孔支架。上述的三维壳聚糖多孔支架的制备过程中可以通过调整醋酸铵的浓度、壳聚糖溶液的浓度和正戊醇的含量，来调整所得的多孔的壳聚糖支架的孔隙率、孔隙结构和连通性，最终所得的三维壳聚糖多孔支架的孔径为10-60
UH孔隙率为93%，且孔与孔之间的连通性好。本发明的三维壳聚糖多孔支架的制备方法在，制备过程中醋酸铵的浓度会影响其分解时产生气体的量，一般醋酸铵的浓度越高，产生的氨气越多，孔隙率就越高，但是过多的气体含量，会造成支架的机械强度降低；并且正戊醇的含量，过高可增大支架的孔隙率， 但降低支架的机械强度，过低则支架的孔隙率不高；因而本发明中以0. IOg醋酸钠和IOml 正戊醇加入IOOml壳聚糖溶液中为最佳配比。在进行冷冻干燥时是以水做致孔剂的，因而壳聚糖溶液的浓度会影响支架中水的相对含量，一般是水的相对含量越高，制得的孔就越多，但水的相对含量越高，则壳聚糖的相对含量就越低，这会使支架的机械强度降低，因而本发明以3g壳聚糖的含量最佳。上述所得的三维壳聚糖多孔支架用于细胞培养或细胞产物的研究。本发明的技术效果
本发明的一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法，由于采用乳液冷冻干燥法，先对壳聚糖乳液进行冷冻干燥将支架中的冰晶升华来制小孔，可增强孔与孔之间的连通性；并通过醋酸铵的分解产生气体和正戊醇从支架中溶出来制孔，增大支架的孔隙率并增强支架的连通性。另外，用乙醇来除去三维壳聚糖多孔支架中残余的正戊醇，在去除致孔剂的同时， 还对三维壳聚糖多孔支架进行了消毒，使得该三维壳聚糖多孔支架满足对细胞培养的无毒性的需求。
图1是本发明所得的三维壳聚糖多孔支架的扫描电镜图片。
具体实施例方式下面结合附图与实施例对本发明进一步说明，但并不限制本发明。本发明所用的所有试剂均为医药纯，均来自上海国药集团。本发明冷冻干燥设备为冻干机，型号为ES，仪器名字为Advantage PLUS冷冻型干燥机，生产厂家为美国Virtis公司；
本发明所用的扫描电镜为Quanta x50系列扫描电子显微镜(美国FEI公司) 实施例1
一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法，包括如下步骤
(1)、制备过程所用的溶液的配制
①、溶有一定量醋酸铵的壳聚糖酸溶液的配制
先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液；称取0. IOg的醋酸铵加入1% (V/V)醋酸溶液中，再称取3. Og壳聚糖，加入溶有醋酸铵的1% (V/V)醋酸溶液中即可；
②、1%(ν/ν)戊二醛溶液的配制
量取Iml纯戊二醛并加蒸馏水定容至100ml，4°C保存备用；
③、壳聚糖乳液的配制
将溶有一定量醋酸铵的壳聚糖酸溶液搅拌anin后，缓慢加入IOml正戊醇和0. 3ml的戊二醛，再继续搅拌IOmin后，即可得到壳聚糖乳液；
④、5%的硼氢化钠的配制
称取5. Og的硼氢化钠加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氢化钠溶液；
(2)、冷冻干燥
将步骤(1)中所得的壳聚糖乳液均勻的涂抹在模具上，放置24h后，将壳聚糖乳液注入模具中进行冷冻干燥得到三维壳聚糖支架；
上述的冷冻干燥制孔过程控制预冻温度为_75°C，预冻时间为Ih ；—次干燥的隔板温度为_20°C，时间为20h;
(3)、烘干
将步骤(2)冷冻干燥后所得的三维壳聚糖支架放入96°C的烘箱中干燥35min，得到三维壳聚糖多孔支架粗品；
(4)、支架的洗涤
将步骤(3)烘干后的所得的三维壳聚糖多孔支架粗品放入70%的乙醇中浸泡Mh，再用去离子水反复清洗支架3次，用5%的硼氢化钠除去游离的戊二醛，再用大量的去离子水洗涤，即得到三维壳聚糖多孔支架。上述所得的三维壳聚糖多孔支架经扫描电镜进行扫描，结果见图1，从图1中可以看出孔径为10-60 μιι，孔与孔之间的连通性好，三维壳聚糖多孔支架表面的孔隙率高达
93%，并且三维壳聚糖多孔支架的大孔中还有许多10-20 μι 的小孔，可以增强支架的连通性。 上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于采用乳液冷冻干燥法来制孔，进行缓慢冻干，使壳聚糖乳液中的醋酸铵以晶体的形式析出，并均勻分布在壳聚糖支架中，再高温96°C烘干，使醋酸铵分解产生氨气来制孔；再用乙醇除去支架中残余的正戊醇来进一步制孔，最终得到一种三维壳聚糖多孔支架。
2.如权利要求1所述的一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤(1)、制备过程所用的溶液的配制①、溶有醋酸铵的壳聚糖酸溶液的配制先量取Iml醋酸加入IOOml的容量瓶中定容，制得1% (V/V)醋酸溶液；称取0. IOg的醋酸铵加入1% (V/V)醋酸溶液中，再称取3. Og壳聚糖，加入溶有醋酸铵的1% (V/V)醋酸溶液中即可；所用的壳聚糖脱乙酰度为80-91% ；②、1%(ν/ν)戊二醛溶液的配制量取Iml纯戊二醛并加蒸馏水定容至100ml，4°C保存备用；③、壳聚糖乳液的配制将溶有醋酸铵的壳聚糖酸溶液搅拌anin后，缓慢加入IOml正戊醇和0. 3ml的戊二醛， 再继续搅拌IOmin后，即可得到壳聚糖乳液；④、5%的硼氢化钠的配制称取5. Og的硼氢化钠加入IOOml的容量瓶中定容，制得5%的硼氢化钠溶液；(2)、冷冻干燥将步骤(1)中所得的壳聚糖乳液均勻的涂抹在模具上，放置24h后，将壳聚糖乳液注入模具中进行冷冻干燥得到三维壳聚糖支架；上述的冷冻干燥制孔过程控制预冻温度为_75°C，预冻时间为Ih ；—次干燥的隔板温度为_20°C，时间为20h;(3)、烘干将步骤(2)冷冻干燥后所得的三维壳聚糖支架放入96°C的烘箱中干燥 35min，得到三维壳聚糖多孔支架粗品；(4)、支架的洗涤将步骤(3)烘干后的所得的三维壳聚糖多孔支架粗品放入70%的乙醇中浸泡Mh，再用去离子水反复清洗支架3次，用5%的硼氢化钠除去游离的戊二醛，再用大量的去离子水洗涤，即得到三维壳聚糖多孔支架。
3.如权利要求1或2所述的一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于所用的壳聚糖脱乙酰度为80-91%。
4.如权利要求3所述的一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法，其特征在于得到三维壳聚糖多孔支架的孔径为10-60 μη，孔隙率为93%。
5.如权利要求1或2所述的一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法所得到的三维壳聚糖多孔支架用于细胞培养的技术研究。
全文摘要
本发明公开了一种三维壳聚糖多孔支架的制备方法，它是以壳聚糖为原料，以醋酸铵和正戊醇作为致孔剂，采用乳液冷冻干燥法来制备三维壳聚糖多孔支架，其制备方法为先配制溶有一定量醋酸铵的壳聚糖酸溶液，并搅拌3min后，缓慢加入10ml正戊醇，再继续搅拌10min后，将所得的乳液注入模具中，进行冷冻干燥，再将冷冻干燥的支架96℃高温烘干35min，最后将烘干后的支架放入70%的乙醇中浸泡24h，即得到孔径为10-60μm，孔隙率为93%，孔与孔之间的连通性好的三维壳聚糖多孔支架。所得的三维壳聚糖多孔支架且可用于细胞培养的技术研究。本制备方法操作简单，工艺简捷。
文档编号C08J9/28GK102532584SQ20121000057
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月4日 优先权日2012年1月4日
发明者刘宝林, 刘颖斌, 周杰, 李琳, 韩宝三 申请人:上海理工大学