专利名称：含羟基交联聚合物的胍基化产物在基因传递中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚乙烯亚胺及其类似物与含有二个或二个以上环氧基交联剂交联合成含羟基的交联聚合物的方法。同时还涉及具有一定链长的胍基化试剂，即3-胍基丙醇丙烯酸酯，5-胍基戊醇丙烯酸酯等的合成方法和采用这些试剂与聚乙烯亚胺或前述的交联聚合物反应制备胍基化聚合物的方法。
背景技术：
早期人们发现，人类免疫缺陷病毒(HIV) I型的反式激活因子(TAT)，具有穿透各种类型细胞膜的能力，可以极大提高HIV基因组的转录和复制水平。根据TAT功能，人们发现了一类具有细胞膜穿透能力的小分子多肽，称为细胞穿透肽(Cell PenetratingPeptides, CPPs)，其长度一般不超过30个氨基酸且富含碱性氨基酸。它们具有强大的细胞膜穿透能力，几乎不受细胞类型的限制。更重要的是，将CPPs偶联到大分子物质上，CPPs能有效地携带这些物质进入细胞内(Eric Vives.Journal of Controlled Release.2005; 109: 77 - 85.Bhawna Gupta, Tatiana S.Levchenko, Vladimir P.Torchilin.Adv Drug Deliv Rev.2005; 57: 637 - 651)。这类小分子多肽除 TAT 外，还包括 Ant、VP22.Poly-lysine和Poly-arginine等。近年来研究发现，8_10个精氨酸构成的聚合物(Polyarginine)，例如:R8 (Octaarginine) — RlO (Decaarginine)是一类细胞穿透能力较强的细胞穿透妝(Elena A.Gounj Rajesh Shinde, Karen W.Dehnert, AngieAdams-Bond, Paul A.Wender.Bioconjugate Chem.2006;17: 787- 796.Lars Tonges,Paul Lingor，Roman Eglej Gunnar P.H.Dietz, Alfred Fahr and Mathias Bahr.RNA2006; 12:1431 - 1438.)，其细胞穿透能力甚至超过原来最初发现的TAT等，因为精氨酸(Arginine)主要含有胍基，进一步研究发现人为设计的含有8 一 15个胍基的低分子量的聚合物也具较高的细胞穿透能力，因此获得高的细胞穿透能力不必具有肽结构或精氨酸结构，胍基才是重要的提高转染效率的基团(Elena A.Goun, Thomas H.Pillow, Lisa R.Jones, Jonathan B.Rothbard, and Paul A.Wender.ChemBioChem 2006，7，1497 -1515)。
聚乙烯亚胺(PEI)是迄今为止转染效率较高的非病毒载体之一，目前经常被用来做为新的基因转染载体评价物，将新设计与新开发的基因转染载体与之比较。但它的高转染效率往往伴随着较大的细胞毒性。一般来说2000Da以下的聚乙烯亚胺无细胞毒性，但也没有转染效率(Gosselin M A, Guo W，Lee R J.Bioconjugate Chem.2001,12: 989 - 994.Godbey WT, Wu KK, Mikos AG.Proceed.1nt.Symp.Control.Relat.Bioact.Mater.1997，25: 230 - 231)，25 kDa聚乙烯亚胺有较高的转染效率，但有较大的细胞毒性(Thomas M.and Klibanov A.M.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 2002;99: 14640 - 14645)。以往的高效转染系统注意力主要集中在提高聚合物链的正电荷、分子量及支化度上，但正电荷过高会导致包裹了 DNA/RNA后所形成的纳米颗粒过于紧密，被细胞内吞后无法在胞内打开释放DNA/RNA，分子量大会导致细胞毒性增加。因此许多研究致力于采用各种交联剂交联小分子的聚乙烯亚胺从而希望获得低细胞毒性的高效转染载体，有的交联剂含有可水解的酯键及体内易于断裂的S-S键等(Gosselin M A, Guo W，Lee R J.Bioconjugate Chem.2001, 12: 989 - 994.Thomas M., Ge Q., Lu J.J.Pharmaceutical Research 2005; 22: 373 - 380)。这些方法明显地降低了细胞毒性和部分地提高了转染效率，但仍然不能满足使用的要求。近来采用组合化学合成方法合成出了大量的类似于PEI的聚￠-氨基酯，对这些结构的化合物库进行结构与性能研究发现带有羟基的化合物的转染效率明显地高，而且进一步的研究发现带有羟基的类脂化合物的转染效率也较高，目前这类优选出的化合物已经用于体内的基因传递且取得了优异的效果(Jordan J.Green, Robert Langer, and Daniel G.Anderson A.Accounts of ChemicalResearch 2008; 41: 6749-759.Kevin T.Lovea, Kerry P.Mahonb, Christopher G.Levins, Kathryn A.Whitehead, William Querbes, J.Robert Dorkind, June Qind,William Cantleyd, Liu Liang Qind, Timothy Racied, Maria Frank-Kamenetskyd,Ka Ning Yipa, Rene Alvarezd, Dinah ff.Y.Sahd, Antonin de Fougerollesd, KevinFitzgeraldd, Victor Kotelianskyd, Akin Akincd, Robert Langer, and Daniel G.Andersonb.Proc Natl Acad Sci USA.2010 ;107 (5): 1864-9)。但由于这类分子结构中的胺基远远少于PEI，所以所得最优结构的聚合物必须进行末端的进一步的胺基化提高转染效率(Green J J, Zugates G T, Tedford N C.Adv Mate 2007，19:2836 - 42)。基于对大量的文献的分析，我们认为在聚合物母链上带有羟基不仅可以改善其溶解性，而且可以提高转染效率，同时我们前期的采用简单结构的含有双环氧基团的脂肪族醇或酸的缩水甘油醚或酯交联剂交联小分子的PEI的探索实验已经证实，在PEI结构中引进羟基可以减低其细胞毒性，同时提高转染效率。所以本发明采用无细胞毒性的PEI或多胺基化合物与含有二个或二个以上环氧基交联剂反应合成羟基化聚乙烯亚胺，由于这种产物有足够的胺基，所以不进行端位氨化也可以有较高的转染效率，在此基础上进行胍基化可以大大地提高转染效率且减低毒性。本发明也采用本身无毒的分子量较小的PEI或多胺等类似结构的分子经合适的结构设计在一些合理的位点上偶联具有一定臂长的胍基，优化胍基数量和聚合物结构，筛选高效低毒的基因转染载体。近年来许多研究者通过各种胍基化试剂将不同的聚合物胍基化，以期望提高聚合物的基因转染性能。 Tziveleka等人用IH-吡唑_1_甲脒盐酸盐将四代聚丙烯亚胺树枝状聚合物胍基化，结果大大提高了树枝状聚合物的转染效率，其中胍基基团的数目，所用细胞系，以及血清存在与否都对转染效率有所影响。但是在任何条件下，完全胍基化的树枝状聚合物的转染效率都是最高的，这是因为树枝状聚合物表面富含胍基基团，从而提高了细胞穿透能力(Tziveleka L A, Psarra A G, Tsiourvas D.J Controlled Release.2007, 117:137 -146)。Nimesh等人用0-甲基异脲半硫酸盐修饰了 25kDa PEI,合成了不同取代比例(18%，37%，56%，74%)的PEI衍生物，他们认为胍基化有利于聚合物上的伯胺正电荷的分散，从而降低毒性。转染HEK293细胞系的结果表明，经过胍基化修饰的PEI的转染效率较商业试剂Lipofectin和25kDa PEI有所提高，且毒性下降，其中修饰度为56%时转染效果最好(Nimesh S， Chandra R.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics.2008，68:647 - 655)。Kim等人合成了具有生物还原性的胍基化聚合物(GBP)，他们首先通过N-叔丁氧羰基-1，6-己二胺(N-Boc-DAH)和N，N-胱胺双丙烯酸酯(CBA)的麦克尔加成反应得到poly (CBA-DAH)，然后用IH-吡唑-1-甲脒盐酸盐将poly (CBA-DAH)上的伯胺胍基化，得到GBP0实验结果表明，对于C2C12细胞系，GBP的转染效率几乎达到PEI25kDa的40倍，对于HEK293细胞系和HepG2细胞系，GBP的转染效率与PEI25kDa相当或略有提高。与未胍基化的poly(CBA-DAH)相比，在三种细胞系中，GBP的转染效率均高出8倍，因此GBP由于胍基化而具有了很好的转染效率，作为基因载体具有很大的应用前途(Kima T, Lee M, Kima Sff.Biomaterials.2010，31:1798 - 1804)。对细胞穿透肽以及R8的研究表明，胍基基团是此类物质具有良好的细胞膜穿透功能的主要原因，而细胞摄取是非病毒基因载体取得较好转染效率的一大障碍，因此我们希望将胍基基团偶联到非病毒载体骨架上，从而赋予载体很好的细胞膜穿透能力，以提高转染效率。此外，胍基基团还能分散聚合物上伯胺的正电荷，从而降低载体的毒性。目前市场上销售的胍基化试剂，如前所述的IH-吡唑-1-甲脒盐酸盐、0-甲基异脲半硫酸盐等都是将胍基基团直接偶联到聚合物上，不能伸出一定的臂长，而对精氨酸及其类似物的结构研究发现胍基基团与聚合物骨架通过一定长度的碳链连接有利于提高转染性能。以往的研究都是在分子量较大的PEI或树枝状聚合物(20kDa以上)上直接将胺基转化成胍基，尽管这样可以提高转染效率，但仍然表现出了明显的细胞毒性。八个精氨酸的均聚物的小分子量化合物表现出来的高的细胞穿透能力提示我们几千分子量的化合物也可以有高的细胞转染能力。因此，我们设计合成了具有一定链长的胍基化试剂，并用它们修饰无细胞毒性的2000分子量的PEI聚合物，也用它修饰所合成的带有羟基的交联聚合物，从而获得高性能的基因转染载体。
发明内容
本发明通过在一些无细胞毒性的多胺类化合物或聚合物中引入羟基和/或胍基，从而提高其基因转染效率，降低其细胞毒性。最终筛选出高效，低毒的基因转染载体。具体的发明目的如下。(I)采用PEI或各种多胺基化合物与交联剂反应合成含羟基的交联聚合物。(2)采用氨基保护的方法合成具有一定链长的胍基化试剂。(3)用所合成的胍基化试剂作为修饰剂修饰所合成的含羟基的交联聚合物，制得一系列的胍基化的交联聚合物。(4)对合成的交联聚合物(含羟基的交联聚合物或胍基化后的交联聚合物)进行基因转染实验，筛选出毒性较低，转染效率较高的基因运送载体。实现本发明目的(I)的技术解决方案为:
将100-30000分子量的PEI，如分枝状的bPEI ((600Da，1200Da, 2000Da)或其类似的多胺基化合物与含有二个或二个以上环氧基的分子量为100-5000Da的交联剂反应合成含羟基的交联聚合物，所述的PEI或多胺基化合物如表I所示。所述的交联剂是各种含有二个或二个以上环氧反应基团，同时其母链上带有脂环基、苯基、杂环基或S-S键的交联剂的一种或几种 的复合物,如表2所不。
交联反应的温度15_90°C，优选的反应温度为25_50°C，优选30_45°C。为了控制产物的分子量，反应时间应视反应物的不同有所变化，PEI600 (线性或分支状)与所述的几种交联剂交联时，反应时间为10小时以上，一般为15-20小时。PEI1200(线性或分支状)与所述的几种交联剂交联时，反应时间为8小时左右，一般为6-12小时。PEI2000 (线性或分支状)与所述的几种交联剂交联时，反应时间为4小时左右,一般为3-8小时。其它的多胺化合物的交联反应时间为12小时以上，一般为18-24小时。反应的溶剂为:水、甲醇、二氯甲烧、THF或DMS0，优选为:二氯甲烷、THF或DMS0。胺类化合物与交联剂的比例为:0.1:1-5:1，优选为 0.5:1-4:1。与现有技术相比，这种交联聚合物基因转染效率在293，Hela，EL_4，A549，B16F10，3T3，U87等多种细胞系中的转染效率是25kDa PEI的3_11倍，具有比25kDa PEI更好的基因转染性能，同时由于这类交联产物具有羟基，所以其水溶性得到了改善，其细胞毒性均较低。
表I本发明优选实施方案的 多胺类化合物及小分子量的PEI的结构
权利要求
1.一种交联聚合物，其特征是由线性或分枝状的聚乙烯亚胺或多胺基化合物与交联剂反应合成，其中，所述的聚乙烯亚胺或多胺基化合物与所述的交联剂的摩尔比是0.1:1-5:10
2.如权利要求1所述的交联聚合物，其特征是所述的交联剂为含有二个或二个以上环氧反应基团，同时其母链上带有脂环基、苯基、杂环基或S-S键的交联剂的一种或几种的复合物。
3.如权利要求1或2所述的交联聚合物，其特征是所述的聚乙烯亚胺或其它多胺基化合物的分子量为100-30000Da，所述的交联剂的分子量为50-5000 Da。
4.一种胍基化交联聚合物，其特征是所述的胍基化交联聚合物是用胍基化试剂3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯作为修饰剂修饰权利要求1所述的交联聚合物后再脱掉Boc保护后获得。
5.如权利要求4所述的胍基化交联聚合物，其特征是所述的胍基化试剂3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯的合成工艺路线为:硫脲在THF溶液中与NaH和Boc酸酐反应将硫脲的胺基进行Boc保护；产物在三乙胺和HgCl2作用下与3-氨基丙醇或5-氨基戊醇在DMF中反应，获得Boc保护的3-胍基丙醇或5-胍基戊醇；最后与丙烯酰氯反应，获得胍基化试剂3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯。
6.一种基因转染组合物，其特征是所述的组合物含有如权利要求1或4所述的交联聚合物和核酸。
7.如权利要求6所述的基因转染组合物，其特征是所述的核酸是指DNA、治疗基因、RNA、催化活性核酸、反义寡核苷酸或修饰的核酸。
8.一种用核酸转染细胞的方法，其特征是所述的方法包括使细胞与权利要求6所述的组合物相接触的步骤。
9.一种试剂盒，其特征是所述的试剂盒含有如权利要求1或4所述的交联聚合物和指导将上述物质和核酸结合用于核酸转染细胞的说明。
10.如权利要求1或4所述的交联聚合物在基因传递中的应用，其特征是其在体外用于基因转染试剂或体内用于基因治疗的药物传输系统，或用做药物，蛋白，多肽生物活性剂的传输载体。
全文摘要
本发明公开了用于输送核酸和其它生物活性剂的含羟基交联聚合物及其胍基化产物的制备方法和应用。具体为以分子量为100-30000Da的线性或分枝状的聚乙烯亚胺或各种多胺基化合物与分子量为100-5000Da的各种含有二个或二个以上环氧基团的交联剂的一种或几种的复合物反应，合成出含羟基交联聚合物。同时还提供了新型胍基化试剂3-胍基丙醇丙烯酸酯或5-胍基戊醇丙烯酸酯的合成方法，采用这种胍基化试剂对前述含羟基交联聚合物或其它聚合物进行胍基化可以明显提高其基因转染效率，同时降低细胞毒性。本发明筛选出性能优异的聚合物其基因转染效率在A549，B16F10，3T3，U87等多种细胞系中的转染效率明显高于常规的商业化基因转染试剂，是一些低毒高效的非病毒基因转染载体。使用本发明制备的载体可以在体外实现对各种细胞的高效，低毒性的转染，在体内可实施高效,低毒性的局部给药，具有广泛的应用前景。
文档编号C08G59/30GK103193979SQ20121000181
公开日2013年7月10日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者董伟, 王伯良, 丰连东, 刘洋洋, 赵玉瑜, 谢阿明 申请人:南京理工大学