专利名称：一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法
技术领域：
本发明涉及疫苗领域，具体涉及一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法。
背景技术：
在Hib疫苗制备的过程中，荚膜多糖的制备是关键的步骤。在我国多采用和流行性脑膜炎球菌以及伤寒Vi多糖提取相似的工艺来提取荚膜多糖。此工艺采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与酸性多糖形成季胺络合物从而沉淀多糖。但是CTAB对核酸、蛋白质也有不同程度的沉淀作用，因此要获得纯度较高的荚膜多糖，必须进一步去除沉淀的核酸和蛋白质。常规的去除蛋白质的方法是用苯酚抽提去除蛋白质。但是该工艺的缺点是会产生大量的废弃苯酚，苯酚是一种强腐蚀性的高毒性物质，对环境有严重危害，对水体和大气可造成污染。苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能。人吸入高浓度苯酚气体可致头痛、头晕、乏力、视物模糊、肺水肿等。因此，对去除蛋白质的工艺进行改进是有实际意义的。羟基磷灰石是磷酸钙的一种形式，具有独特的选择性和分辨率，经常能够分离一些其他技术无法区分的生物分子。羟基磷灰石填料广泛用于核酸、蛋白、病毒以及其他大分子的分离纯化。当前还没有将羟基磷灰石用于b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化的工艺。
发明内容
本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，该方法不使用苯酚来进行荚膜多糖的纯化，减轻了对环境的危害和对人体的损害，并且得到的Hib荚膜多糖纯度可达到行业标准。本发明的目的通过以下技术方案实现一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，包括以下步骤A.装填一根羟基磷灰石层析柱，用20mM磷酸盐缓冲液平衡2个柱体积直至基线平稳；B.将b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖粗糖溶解于20mM磷酸盐缓冲液，将得到的Hib荚膜多糖粗糖溶液上样于层析柱上；C.使用20mM磷酸盐缓冲液洗2个柱体积，收集流穿峰；D.用高盐缓冲液洗脱结合在层析柱上的蛋白质，再生层析柱；E.将收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝胶柱进行缓冲液置换，流动相为无热原的注射用水，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液。在上述步骤中，Hib荚膜多糖粗糖是通过对Hib样本进行处理得到的沉淀物。在上述步骤中，20mM磷酸盐缓冲液的pH值为6. 9。在步骤B中，将50 150mgHib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM磷酸盐缓冲液。在步骤D中，高盐缓冲液为pH值为6. 9，由20mM磷酸盐缓冲液和0. 2M氯化钠组成的液体。
本发明的优点在于，采用羟基磷灰石进行荚膜多糖的纯化，避免了使用苯酚对环境和人体带来的危害，并且得到的Hib荚膜多糖纯度可达到行业标准。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的保护范围不限于以下所述。一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，包括以下步骤A.装填一根羟基磷灰石层析柱，用20mM磷酸盐缓冲液平衡2个柱体积直至基线平稳；B.将b型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖粗糖溶解于20mM磷酸盐缓冲液，将得到的Hib荚膜多糖粗糖溶液上样于层析柱上；C.使用20mM磷酸盐缓冲液洗2个柱体积，收集流穿峰；D.用高盐缓冲液洗脱结合在层析柱上的蛋白质，再生层析柱；E.将收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝胶柱进行缓冲液置换，流动相为无热原的注射用水，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液。在上述步骤中，Hib荚膜多糖粗糖是通过对Hib样本进行处理得到的沉淀物。在上述步骤中，20mM磷酸盐缓冲液的pH值为6. 9。在步骤B中，将50 150mgHib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM磷酸盐缓冲液。在步骤D中，高盐缓冲液为PH值为6. 9，由20mM磷酸盐缓冲液和0. 2M氯化钠组成的液体。Hib荚膜多糖粗糖制取方法如下参照文献公开的方法(Anderson，1977.INFCTION AND IMMUNITY. Vol 15. No. 2,P472 477)进行Hib的培养。培养基采用CY培养基，1升培养基含IOg酸水解酪蛋白，5g酵母提取物，5g葡萄糖，Img氯化血红素，Img辅酶I，0. IM PB，培养基的pH值为7. 6。培养温度为37°C，振荡速度为220rpm，待菌种浓度OD66tl为0. 5后接种至发酵罐继续培养，维持培养温度37°C，搅拌速度150rpm，培养8 IOh后加入浓度为0.5% (ν/ν)的甲醛杀菌，收获时菌液浓度OD66tl > 4. O0杀菌后的培养液采用IOOOOrpm离心30min沉淀菌体，收集上清液。将CTAB加入上清液中，CTAB与上清液的重量体积比(w/v)为1 1000，室温搅拌lh，得到的混合液IOOOOrpm离心30min后收集CTAB与Hib荚膜多糖的复合物沉淀。沉淀用0. 5 IM氯化钠溶液溶解，室温搅拌2小时，使Hib荚膜多糖与CTAB解离。加入4°C预冷的无水乙醇至乙醇终浓度为25% (ν/ν)，4°C搅拌过夜。IOOOOrpm离心30min，收集上清液，上清液中继续加入无水乙醇至乙醇终浓度为75% (v/v)，4°C搅拌过夜，IOOOOrpm离心30min，收集沉淀。沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤两次，最终得到的沉淀即为Hib荚膜多糖粗糖。实施例一预先装填一根羟基磷灰石层析柱(5cmX 20cm)，用20mM PB缓冲液(pH6. 9)平衡柱子2个柱体积直至OD2tl6nm基线平稳。然后将50mg Hib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM PB缓冲液(PH6. 9)，上样于层析柱上。上样完成后先用缓冲液A(20mM PB缓冲液，pH6.9)洗2个柱体积，收集流穿峰。然后用缓冲液B(20mM PB缓冲液，0. 2M氯化钠，pH6.9)洗脱结合在层析柱上的的蛋白质，再生层析柱。
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预先装填一根G-25葡萄糖凝胶柱(5cmX 20cm)，用无热原的注射用水平衡层析柱直至0D206nm基线平稳。然后将收集的流穿峰上样于G-25葡萄糖凝胶柱上。用无热原的注射用水作为流动相洗脱，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液，并取样检测。各项检定指标如下
蛋白含量5.02 mg/g
核酸含量6.55 mg/g
核糖含量394.52 mg/g
磷含量76.38 mg/g
内毒素含量 <12.5 EU/μ g。实施例二 预先装填一根羟基磷灰石层析柱(5cmX 20cm)，用20mM PB缓冲液(pH6. 9)平衡柱子2个柱体积直至0D206nm基线平稳。然后将IOOmg Hib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mMPB缓冲液(pH6. 9)，上样于层析柱上。上样完成后先用缓冲液A(20mM PB缓冲液，pH6. 9)洗2个柱体积，收集流穿峰。然后用缓冲液B(20mM PB缓冲液，0. 2M氯化钠，pH6. 9)洗脱结合在层析柱上的的蛋白质，再生层析柱。预先装填一根G-25葡萄糖凝胶柱(5cmX 20cm)，用无热原的注射用水平衡层析柱直至0D206nm基线平稳。然后将收集的流穿峰上样于G-25葡萄糖凝胶柱上。用无热原的注射用水作为流动相洗脱，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液，并取样检测。各项检定指标如下
蛋白含量
核酸含量核糖含量磷含量内毒素含量实施例三预先装填一根羟基磷灰石层析柱(5cmX 20cm)，用20mM PB缓冲液(pH6. 9)平衡柱子2个柱体积直至0D206nm基线平稳。然后将IOOmg Hib荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mMPB缓冲液(pH6. 9)，上样于层析柱上。上样完成后先用缓冲液A(20mM PB缓冲液，pH6. 9)洗2个柱体积，收集流穿峰。然后用缓冲液B(20mM PB缓冲液，0. 2M氯化钠，pH6. 9)洗脱结合在层析柱上的的蛋白质，再生层析柱。预先装填一根G-25葡萄糖凝胶柱(5cmX 20cm)，用无热原的注射用水平衡层析柱直至0D206nm基线平稳。然后将收集的流穿峰上样于G-25葡萄糖凝胶柱上。用无热原的注
4.64 mg/g
6.33 mg/g391.19 mg/g71.03 mg/g<12.5 EU/μ go射用水作为流动相洗脱，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液，并取样检测。各项检定指标如下
蛋白含量5.86 mg/g
核酸含量5.51 mg/g
核糖含量411.91 mg/g
磷含量82.47 mg/g
内毒素含量 <12.5 EU/μ g。通过本发明制备的Hib荚膜多糖各项检定指标与行业标准的比较
行业标准蛋白含量核酸含量核糖含量磷含量内毒素含量<10mg/g<10mg/g320 410mg/g68 90mg/g<50EU/ μ g实施例一5.026.55394.5276.38<12.5实施例二4.646.33391.1971.03<12.5实施例三5.865.51411.9182.47<12.5 从上表中可以看出，本发明制备的Hib荚膜多糖的蛋白含量、核酸含量、核糖含量、磷含量和内毒素含量均达到行业标准，且制备过程中完全不使用苯酚，杜绝了因使用苯酚对环境和人体带来的危害。
权利要求
1.一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤A.装填一根羟基磷灰石层析柱，用20mM磷酸盐缓冲液平衡2个柱体积直至基线平稳；B.将5(Tl50mgb型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜多糖粗糖溶解于50ml 20mM磷酸盐缓冲液，将得到的Hib荚膜多糖粗糖溶液上样于层析柱上；C.使用20mM磷酸盐缓冲液洗2个柱体积，收集流穿峰；D.用高盐缓冲液洗脱结合在层析柱上的蛋白质，再生层析柱；E.将收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝胶柱进行缓冲液置换，流动相为无热原的注射用水，收集含Hib荚膜多糖的洗脱峰，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液。
2.根据权利要求1所述的一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，其特征在于，所述Hib荚膜多糖粗糖是通过对Hib样本进行处理得到的沉淀物。
3.根据权利要求1所述的一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，其特征在于，所述20mM磷酸盐缓冲液的pH值为6. 9。
4.根据权利要求1所述的一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，其特征在于， 所述高盐缓冲液为由20mM磷酸盐缓冲液和0. 2M氯化钠组成的混合液体，混合液体pH值为 6. 9。
全文摘要
本发明公开了一种b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的纯化方法，本方法使用羟基磷灰石进行Hib荚膜多糖的纯化，过程如下将Hib荚膜多糖粗糖溶解于20mm磷酸盐缓冲液，将得到的Hib荚膜多糖粗糖溶液上样于羟基磷灰石层析柱；使用20mm磷酸盐缓冲液洗2个柱体积，收集流穿峰；用高盐缓冲液洗脱结合的蛋白质，将收集的流穿峰用G-25葡萄糖凝胶柱进行缓冲液置换，最终得到Hib荚膜多糖精糖原液。本发明的优点在于采用羟基磷灰石进行荚膜多糖的纯化，避免了使用苯酚对环境和人体带来的危害，并且得到的Hib荚膜多糖纯度可达到行业标准。
文档编号C08B37/00GK102558382SQ20121003724
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者伍长华, 关晓峰, 吴强, 罗力心 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司