专利名称：b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗活化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及多糖活化方法技术领域，特别是b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗活化工艺。
背景技术：
流感嗜血杆菌迄今仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病菌，其中绝大部分由b型流感嗜血杆菌(Hib)引起，是导致2岁以下婴幼儿脑膜炎和细菌性肺炎的主要病因。2006年世界卫生组织(WHO)报道全世界每年至少造成300万例严重疾病和40万 70万人死亡，已成为全球性的一大公共卫生问题。Hib荚膜多糖是Hib的主要毒力因子之一，是由以磷酸多聚核糖基核糖醇(PRP)为主要成分的重复单位组成的多聚体，具有较好的免疫原性，可诱发机体产生有效的保护性杀菌抗体。Hib多糖在较大儿童和成年人中诱发很高的杀菌抗体，但对18月龄以下婴幼儿不能诱生有效杀菌抗体，也不能诱发免疫记忆。这是因为多糖属T细胞非依赖性抗原，在免疫系统机能发育尚不完善的2岁以下婴幼儿中，多糖类抗原不能刺激机体产生有效抗体，所以PRP对这一高危人群不能起到有效保护作用。为了改变多糖的非T细胞依赖性，人们将多糖共价偶联到一种蛋白载体上，使之转变为T细胞依赖性抗原，从而解决了在2岁以下婴幼儿免疫原性差的问题。这种新一代结合疫苗不仅在任何年龄段人群中均可诱生出高浓度的以IgG为主的保护性抗体，并可产生明显的免疫回忆反应。在工业化国家和发展中国家，疫苗接种都是唯一能迅速降低Hib疾病发病的公共卫生措施。将Hib疫苗纳入儿童常规免疫规划的国家多数在数年内就实际上消除了 Hib严重病例。由于细菌对一些最有效的抗生素耐药性正在不断增加，通过疫苗预防Hib疾病就变得比以往更为重要。目前，国产的所有已经上市的结合疫苗(如b型流感嗜血杆菌结合疫苗、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗)全部采用同一种化学结合方法制备而成，即用溴化氰(CNBr)活化多糖的邻位羟基，活化后的多糖与己二酰肼(ADH)反应生成多糖-ADH衍生物。然后在碳二亚胺(EDAC)的催化作用下，多糖-ADH衍生物与载体蛋白共价结合。该工艺的缺点是在结合过程中会使用到溴化氰。溴化氰为极毒而且性质活泼的物质，受热、遇水放出剧毒气体如氰化氢，遇酸易引起爆炸。溴化氰的毒性作用类似氢氰酸，对眼睛和皮肤有強烈刺激性。溴化氢曾作为第一次世界大战期间澳大利亚军队使用的毒气。对人来说，在极低的浓度下，就能刺激眼、咽喉而催泪、咳嗽；在0. 05mg/L(20PPM)的浓度下I分钟也忍耐不了 ；如果在120mg/m3条件下，接触30分钟后即死亡。随着对环保意识的增强，以及对工人工作环境状况的重视，人们一直在寻找合适的方法来避免在疫苗制造过程中使用象溴化氰这样剧毒的化学试剂。使用现代的技术对传统的生产工艺进行改进以减少或弃用有毒化学试剂对于保护人类健康以及减少环境污染都具有重要的意义。CDAP(1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯)是一种新型的水溶性氰化剂。在传统的活化反应中，为了让多糖的羟基有足够的亲核型能够与CNBr反应，反应需要在较高的pH下进行。CDAP的氰基基团比CNBr的亲电能力强，因此氰基化反应能够在较低的反应pH下进行(PH8-9)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种环境友好、安全性高的b型流 感嗜血杆菌多糖结合疫苗活化工艺。本发明的目的通过以下技术方案来实现b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗活化工艺，它包括以下步骤A、制备Hib多糖，其包括以下子步骤Al、将杀菌后的培养液采用8000 1200rpm离心20 40min沉淀菌体，收集上清液；A2、将CTAB加入上清液中，CTAB与上清液的重量体积比(w/v)为I : 800 I 1200，室温搅拌0. 5 I. 5h，得到的混合液8000 1200rpm离心20 40min后收集CTAB与Hib荚膜多糖的复合物沉淀；A3、复合物沉淀用0. 5 IM氯化钠溶液溶解，室温搅拌I 3小时，使Hib荚膜多糖与CTAB解离；加入3 5°C预冷的无水乙醇至乙醇终浓度为20 30% (v/v)，3 5°C搅拌过夜；A4、8000 1200rpm离心20 40min,收集上清液,上清液中继续加入无水乙醇至乙醇终浓度为70 80% (v/v), 3 5°C揽拌过夜,8000 1200rpm离心20 40min,收集
沉淀；A5、沉淀用8 12%饱和醋酸钠溶解，按体积比I : 2 I : 3加入冷酚，搅拌
0.5 I. 5小时后6000 8000rpm离心50 70min,收集上清液；A6、上清液用0.05 0. 15M氯化钠溶液透析去除残余苯酚，加入乙醇至终浓度70 80%，离心收集沉淀；A7、沉淀用无水乙醇和丙酮各洗一 三次，干燥后用灭菌注射用水溶解，即得Hib多糖；B、将I-氰基-4- 二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)用乙腈溶解成溶液；C、将Hib多糖溶解于注射用水中，配制成溶液，调节pH至9. 0 ;D、按Hib多糖溶液CDAP溶液=2 I 3 : I的体积比向Hib多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2 5分钟；E、将ADH用NaHCO3溶解成溶液，将其按多糖溶液ADH溶液=I 3 I : 5的体积比加入混合溶液中，室温搅拌I 2小时；F、将反应结束后的溶液上样于预先用注射用水平衡好的S印hadex G-25凝胶层析柱，收集外水体积的洗脱液，冻干即为多糖-ADH衍生物。本发明具有以下优点本发明的制备的Hib-ADH衍生物的质量指标可达到行业标准，且采用安全无毒的CDAP替代对人和环境危害极大的溴化氰作为活化剂，提高了安全性，避免了对人和环境的危害。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述Hib细菌的培养液的制备参考文献的方法(Anderson等，1977. INFECTION ANDIMMUNITY. 15⑵472 477)。培养基选用CY培养基，培养温度为37 °C，振荡速度为220rpm，待菌种浓度OD66tl为0. 5后接种至发酵罐继续培养，维持培养温度37°C，搅拌速度150rpm，培养8 IOh后加入浓度为0. 5% (v/v)的甲醛杀菌，收获时菌液浓度OD66tl > 4. O。实施例I :本实施例为本发明最佳实施例。b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗活化工艺，它包括以下步骤A、制备Hib多糖，其包括以下子步骤Al、将杀菌后的培养液采用IOOOOrpm离心30min沉淀菌体，收集上清液；A2、将CTAB加入上清液中，CTAB与上清液的重量体积比(w/v)为I : 1000，室温搅拌lh，得到的混合液IOOOOrpm离心30min后收集CTAB与Hib荚膜多糖的复合物沉淀；A3、复合物沉淀用IM氯化钠溶液溶解，室温搅拌2小时，使Hib荚膜多糖与CTAB解离；加入4°C预冷的无水乙醇至乙醇终浓度为25% (v/v)，4°C搅拌过夜；A4、IOOOOrpm离心30min，收集上清液，上清液中继续加入无水乙醇至乙醇终浓度为75% (v/v)，4°C搅拌过夜，IOOOOrpm离心30min,收集沉淀；A5、沉淀用10%饱和醋酸钠溶解，按体积比I : 2加入冷酚(IOOg结晶酚溶解于40ml的10%饱和乙酸钠)，搅拌I小时后7000rpm离心60min，收集上清液；A6、上清液用0. IM氯化钠溶液透析去除残余苯酚，加入乙醇至终浓度75%，离心收集沉淀；A7、沉淀用无水乙醇和丙酮各洗两次，干燥后用灭菌注射用水溶解，即得Hib多糖；B、将I-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)用乙腈溶解成100mg/ml的溶液；C、将Hib多糖溶解于注射用水中，配制成浓度为5mg/ml的溶液，调节pH至9. 0 ;D、按Hib多糖溶液CDAP溶液=I 0. 5的体积比向Hib多糖溶液中加入CDAP
溶液，室温搅拌4分钟；Ejf ADH用0. 2M NaHCO3溶解成100mg/ml的溶液，将其按多糖溶液ADH溶液=I 3. 5的体积比加入混合溶液中，室温搅拌I小时；F、将反应结束后的溶液上样于预先用注射用水平衡好的S印hadex G_25凝胶层析柱，收集外水体积的洗脱液，冻干即为多糖-ADH衍生物。取样检测ADH衍生度，检测结果如下表所示
权利要求
1.b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗活化工艺，其特征在于它包括以下步骤 A、制备Hib多糖，其包括以下子步骤 A I、将杀菌后的培养液采用8000 1200rpm离心20 40min沉淀菌体，收集上清液；A 2、将CTAB加入上清液中，CTAB与上清液的重量体积比(w/ v)为1:800 1:1200，室温搅拌0. 5 I. 5h，得到的混合液8000 1200rpm离心20 40min后收集CTAB与Hib荚膜多糖的复合物沉淀； A3、复合物沉淀用0. 5 I. 5M氯化钠溶液溶解，室温搅拌I 3小时，使Hib荚膜多糖与CTAB解离；加入3 5°C预冷的无水乙醇至乙醇终浓度为20 30%(v/v)，3 5°C搅拌过夜； A 4,8000 1200rpm离心20 40min，收集上清液，上清液中继续加入无水乙醇至乙醇终浓度为70 80% (v/v)，3 5°C搅拌过夜，8000 1200rpm离心20 40min，收集沉淀； A 5、沉淀用8 12%饱和醋酸钠溶解，按体积比1:2 1:3加入冷酚，搅拌0. 5 I. 5小时后6000 8000rpm离心50 70min,收集上清液； A 6、上清液用0. 05 0. 15M氯化钠溶液透析去除残余苯酚，加入乙醇至终浓度70 80%,离心收集沉淀； A 7、沉淀用无水乙醇和丙酮各洗一 三次，干燥后用灭菌注射用水溶解，即得Hib多糖； B、将I-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)用乙腈溶解成溶液； C、将Hib多糖溶解于注射用水中，配制成溶液，调节pH至9.0 ; D、按Hib多糖溶液CDAP溶液=2:1 3:1的体积比向Hib多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2 5分钟； E、将ADH用NaHCO3溶解成溶液，将其按多糖溶液ADH溶液=1:3 I :5的体积比加入混合溶液中，室温搅拌0. 5 2小时； F、将反应结束后的溶液上样于预先用注射用水平衡好的SephadexG_25凝胶层析柱，收集外水体积的洗脱液，冻干即为多糖-ADH衍生物。
全文摘要
本发明公开了b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗活化工艺，它包括以下步骤A、制备Hib多糖；B、将CDAP用乙腈溶解成溶液；C、将Hib多糖配制成溶液；D、向Hib多糖溶液中加入CDAP溶液，室温搅拌2～5分钟；E、将ADH用NaHCO3溶解成溶液，将其加入混合溶液中，室温搅拌0.5～2小时；F、将反应结束后的溶液上样于预先用注射用水平衡好的SephadexG-25 凝胶层析柱，收集外水体积的洗脱液，冻干即为多糖-ADH衍生物。本发明的有益效果是制备的Hib-ADH衍生物的质量指标可达到行业标准，且采用安全无毒的CDAP替代对人和环境危害极大的溴化氰作为活化剂，提高了安全性，避免了对人和环境的危害。
文档编号C08B37/00GK102626515SQ20121012131
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者伍长华, 吴强, 陈爱民, 魏新 申请人:成都欧林生物科技股份有限公司