专利名称：一种青蛤多糖提取物的提取方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生化药物领域，具体涉及一种青蛤多糖提取物的提取方法，本发明还涉及前述方法提取得到的青蛤多糖提取物的应用。
背景技术：
青蛤sinensis)为软体动物门瓣鳃纲帘蛤目帘蛤科动物，是我国南北沿海习见和主要的食用双壳贝类，是我国滩涂养殖贝类的主要品种，有着很大的开发潜力。青蛤营养成分分析表明，软体中含有丰富的糖类、蛋白质(肽)等成分，含有亮氨酸、蛋氨酸等10多种人体必需的氨基酸，还含有酪氨酸和胱氨酸等非必需氨基酸，不饱和脂肪酸含量大大高于饱和脂肪酸，EPA和DHA的含量较高。因此，青蛤以其肉味鲜美、营养丰富、蛋白质含量高等诸多优点，逐渐成为人们喜爱的海产品。此外，传统医学认为，青蛤具有软坚散结、清热化痰的功效，主治虚症、咳嗽气喘等有一定疗效。青蛤肉提取液中含有多种药理活性物 质，在提高机体免疫力方面也有重要作用。目前对青蛤的研究主要集中在繁殖、增养殖技术和食品初加工等方面，但有关青蛤生物活性大分子提取物，如多糖和蛋白质的研究报道较少。目前市场上未见关于青蛤提取物的药物和保健品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提出一种工艺合理、可操作性强、有效提取青蛤多糖成份的青蛤多糖提取物的提取方法。本发明所要解决的另一个技术问题是提供了前述方法提取得到的提取物在制备抗氧化保健品中的应用。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种青蛤多糖提取物的提取方法，其特点是，其步骤如下
(1)取青蛤软体部位为原材料，洗净、绞碎后，加水煎煮1-3次，每次煎煮2-4小时，煎煮时水与青蛤软体原材料的质量比为5-20:1 ；
(2)滤过，合并煎煮液，然后将煎煮液在3000-8000转/分下离心，收集上清液，浓缩后，向浓缩液中加入蛋白酶，在4°C下静置12-24小时进行脱蛋白处理，收集脱蛋白后的水溶液；
(3 )向脱蛋白后的水溶液中加入无水乙醇以沉淀多糖，无水乙醇在搅拌状态下加入，所加无水乙醇在沉淀体系中的体积百分含量为60-80% ;滤过，得沉淀物，干燥得青蛤多糖提取物。本发明所述的青蛤多糖提取物的提取方法技术方案中，进一步优选的技术方案或者技术特征是
I.在步骤(2)中煎煮液离心时的转速优选为5000转/分。2.在步骤(2)中，所述的蛋白酶可以为常用的蛋白酶，优选为木瓜蛋白酶。3.步骤(3)中所述的干燥方法优选为将沉淀物于50_70°C烘箱中干燥30_35小时。或者优选为将沉淀物置于冷冻干燥机中，_25°C冻干48小时。本发明方法所制得的青蛤多糖提取物的成份主要由多糖和蛋白质组成，经按常规方法检测，其中多糖含量占70%以上，蛋白质和其他成分含量低于30%。本发明所述的提取方法所提取得到的青蛤多糖提取物可以用来制备抗氧化保健品。本发明方法制得的青蛤多糖提取物具有一定的抗氧化的活性。本发明通过体外药效学实验对上述青蛤多糖提取物的抗氧化活性进行了验证，结果证实青蛤多糖提取物具有较强的还原能力和总抗氧化能力，对DPPH自由基、超氧阴离子和羟基自由基的清除活性随浓度升高而增大，表现出较强的抗氧化活性。与现有技术相比，本发明方法原料易得，操作简单方便，可操作性强，该方法可以有效地提取得到具有较强抗氧化能力的青蛤多糖成份。
图I为青蛤多糖提取物的还原能力测定 图2为青蛤多糖提取物的总抗氧化能力测定 图3为青蛤多糖提取物清除DPPH自由基能力的测定 图4为青蛤多糖提取物清除羟自由基能力的测定 图5为青蛤多糖提取物清除超氧阴离子自由基能力的测定图。
具体实施例方式以下实施方式视为本发明的一些举例，以使本技术领域的技术人员进一步的理解本发明，而不应视为是对本发明的限定。实施例1，一种青蛤多糖提取物的提取方法，其步骤如下
(1)取青蛤软体部位为原材料，洗净、绞碎后，加水煎煮I次，每次煎煮2小时，煎煮时水与青蛤软体原材料的质量比为5:1 ；
(2)滤过，合并煎煮液，然后将煎煮液在3000转/分下离心，收集上清液，浓缩后，向浓缩液中加入蛋白酶，在4°C下静置12小时进行脱蛋白处理，收集脱蛋白后的水溶液；
(3 )向脱蛋白后的水溶液中加入无水乙醇沉淀多糖，无水乙醇在搅拌状态下加入，所加无水乙醇在沉淀体系中的体积百分含量为60% ;滤过，得沉淀物，干燥得青蛤多糖提取物。实施例2，一种青蛤多糖提取物的提取方法，其步骤如下
(1)取青蛤软体部位为原材料，洗净、绞碎后，加水煎煮3次，每次煎煮4小时，煎煮时水与青蛤软体原材料的质量比为20:1 ；
(2)滤过，合并煎煮液，然后将煎煮液在8000转/分下离心，收集上清液，浓缩后，向浓缩液中加入蛋白酶，在4°C下静置24小时进行脱蛋白处理，收集脱蛋白后的水溶液；
(3 )向脱蛋白后的水溶液中加入无水乙醇沉淀多糖，无水乙醇在搅拌状态下加入，所加无水乙醇在沉淀体系中的体积百分含量为80% ;滤过，得沉淀物，将沉淀物置于冷冻干燥机中，-25°C冻干48小时，得青蛤多糖提取物。实施例3，一种青蛤多糖提取物的提取方法，其步骤如下
(I)取青蛤软体部位为原材料，洗净、绞碎后，加水煎煮1-3次，每次煎煮2-4小时，煎煮时水与青蛤软体原材料的质量比为10:1 ；(2)滤过，合并煎煮液，然后将煎煮液在5000转/分下离心，收集上清液，浓缩后，向浓缩液中加入木瓜蛋白酶，在4°C下静置18小时进行脱蛋白处理，收集脱蛋白后的水溶液；
(3 )向脱蛋白后的水溶液中加入无水乙醇沉淀多糖，无水乙醇在搅拌状态下加入，所加无水乙醇在沉淀体系中的体积百分含量为70% ;滤过，得沉淀物，将沉淀物于50-70°C真空箱中干燥30-35小时，得青蛤多糖提取物。实施例4，参照图1，实施例3制得的青蛤多糖提取物进行的还原能力测定实验。于试管中分别加入1.0 mL不同质量浓度的青蛤多糖提取物水溶液，再分别加入
I.O mL磷酸缓冲溶液(O. 2 mol/L, pH6. 6)及I. O mL铁氰化钾水溶液(1%)，50°C水浴20min后取出快速冷却,加入I. O mL三氯乙酸水溶液(10%),摇勻，5000 rpm/min离心5 min。取I. O mL上清液，依次加入I. O mL蒸馏水，O. 5 mL三氯化铁水溶液(O. 1%)，充分混匀，10min后，在700 nm波长处测定吸光度，吸光度越大，则说明还原能力越强。实验结果见图1，由图可见青蛤多糖提取物具有一定的还原能力，随着多糖提取物浓度提高，还原力呈上升 趋势。实施例5，参照图2，实施例3制得的青蛤多糖提取物进行的总抗氧化力测定实验。总抗氧化力的测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，在520 nm处测定样品的吸光度。一个单位的总抗氧化力定义为37°C时每毫升待测样品液每分钟吸光度增加0.01。总抗氧化能力(TAC)是由下面的公式描述TAC (U/ml) = [C4s- A0)/(O. 01*30)]*Kt*Ks*C，其中，Js表示样品的吸光度·Λ)表示对照组吸光度A表示反应液总体积(ml) ;KS表示样品液体积(ml) K表示样品的稀释倍数。结果如图2所示，随着青蛤多糖提取物浓度的提高，总抗氧化能力呈明显上升趋势。实施例6，参照图2，实施例3制得的青蛤多糖提取物清除DPPH自由基活性的测定实验。取100 μ I待测液及50 μ I的2X1(T4 mol/L DPPH溶液加入96孔板中，摇匀。20min后用相应溶剂作参比在517 nm下测定其吸光度<，同时测定2X 10_4 mol/L DPPH溶液与等体积相应溶剂混合液的吸光度尤，以及待测液与等体积无水乙醇混合液的吸光度根据以下公式计算清除率7=( A- A1+ 4) *100/ 4，结果如图3所示，从图中可以看出，当青蛤多糖提取物水溶液的浓度从I. 25 mg/mL增加到20. O mg/mL，其清除DPPH自由基的能力从(52. 44 土 I. 12)%升高到(83.01 土 3. 84)%，说明青蛤多糖提取物具有显著的DPPH自由基清除活性。实施例7，参照图2，实施例3制得的青蛤多糖提取物清除羟自由基活性的测定实验。取不同浓度提取液50 μ L, 50 μ L 9 mmol/L硫酸亚铁与50 μ L 8. 8 mmol/ LH2O2于96孔酶标板充分混合后,分别加入50 μ L 10 mmol/ L水杨酸的乙醇溶液,摇勻,静置20 min，以蒸馏水为参比，在508 nm处测定吸光度⑷)。按照上述操作，用蒸馏水代替样品液，测定得疋，用蒸馏水代替H2O2溶液，测定得名。根据以下公式计算清除率7=( A-A1+ 4) *100/ ^，结果如图4所示，从图中可以看出青蛤多糖提取物对羟自由基的清除效应随浓度的增加而升高，呈现良好的浓度依赖曲线。当青蛤多糖提取物浓度从5. O mg/mL增加到40. O mg/mL，其清除羟自由基的能力从(17. 53 + 1. 24)%升高到(85. 99 + 3. 36)%。实施例8，参照图2，实施例3制得的青蛤多糖提取物清除超氧阴离子自由基活性的测定实验。采用邻苯三酚自氧化法测定。取浓度为O. I mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7. 3，内含2 mmol/L EDTA) 100 yL，超纯水50 μ L加入96孔酶标板中，于25°C保温20 min后加入预热过的60 mmol/L的邻苯三酹50 μ L (以10 mmol/L HCl溶液配制)，迅速摇勻,在319 nm波长处每隔50 s测一次，测定启动后5 min内邻苯三酚自氧化的速率，记作八义。加入50 UL样品液，相应减少同体积水，测定启动后5 min内样品抑制邻苯三酚自氧化的速率Λ木。根据以下公式计算清除率7=( AA0- AAS)*100/ Λ次，结果如图5所示，从图 中可以看出青蛤多糖提取物具有较强的超氧阴离子自由基清除活性，随着多糖浓度提高，其对超氧阴离子自由基的清除活性呈上升趋势。
权利要求
1.一种青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，其步骤如下 (1)取青蛤软体部位为原材料，洗净、绞碎后，加水煎煮1-3次，每次煎煮2-4小时，煎煮时水与青蛤软体原材料的质量比为5-20:1 ； (2)滤过，合并煎煮液，然后将煎煮液在3000-8000转/分下离心，收集上清液，浓缩后，向浓缩液中加入蛋白酶，在4°C下静置12-24小时进行脱蛋白处理，收集脱蛋白后的水溶液； (3 )向脱蛋白后的水溶液中加入无水乙醇以沉淀多糖，无水乙醇在搅拌状态下加入，所加无水乙醇在沉淀体系中的体积百分含量为60-80% ;滤过，得沉淀物，干燥得青蛤多糖提取物。
2.根据权利要求I所述的青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，步骤(2)中煎煮液离心时的转速为5000转/分。
3.根据权利要求I所述的青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶。
4.根据权利要求I所述的青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的干燥方法为将沉淀物于50-70°C烘箱中干燥30-35小时。
5.根据权利要求I所述的青蛤多糖提取物的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述的干燥方法为将沉淀物置于冷冻干燥机中，_25°C冻干48小时。
6.权利要求1-5任何一项所述的提取方法所提取得到的青蛤多糖提取物在制备抗氧化保健品中的应用。
全文摘要
一种青蛤多糖提取物的提取方法，取青蛤软体部位为原材料，洗净、绞碎后，加水煎煮1-3次，每次煎煮2-4小时，煎煮时水与青蛤软体原材料的质量比为5-20:1；滤过，合并煎煮液，然后将煎煮液在3000-8000转/分下离心，收集上清液，浓缩后，向浓缩液中加入蛋白酶，在4℃下静置12-24小时进行脱蛋白处理，收集脱蛋白后的水溶液；向脱蛋白后的水溶液中加入无水乙醇以沉淀多糖，无水乙醇在搅拌状态下加入，所加无水乙醇在沉淀体系中的体积百分含量为60-80%；滤过，得沉淀物，干燥得青蛤多糖提取物。本发明方法原料易得，操作简单方便，可操作性强，该方法可以有效地提取得到具有较强抗氧化能力的青蛤多糖成份。
文档编号C08B37/00GK102887961SQ201210333998
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月12日 优先权日2012年9月12日
发明者郭雷, 姚东瑞, 许福泉, 王淑军, 张敬敏, 董志国 申请人:淮海工学院