专利名称：一种双膜法提取云芝胞外多糖的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及ー种提取真菌胞外多糖的方法，更确切地说是ー种基于膜技术提取云芝胞外多糖的方法。
背景技术：
云芝胞内糖肽也称云芝糖肽，由云芝胞内糖和胞外多糖组成，是运用现代生物エ程技术从云芝菌中提取精制的具有生理活性的蛋白多糖物质，其功效成分含量远高于云芝菌本身，且易于被人体吸收。传统的云芝胞外多糖生产是将分离后的云芝发酵滤液浓缩到一定倍数后进行多 次酒精醇沉，去除其中的单糖，提高多糖含量。但是在醇沉过程中由于单糖往往伴随着多糖同时被醇沉下来，单糖去除率较低，因此需要多次醇沉,耗费酒精和人工较多，生产成本较高；同时，传统的热浓缩方式，耗用大量的蒸汽，对生产成本和产品质量有较大影响。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述云芝胞外多糖分离纯化方法的不足，从而提供ー种基于膜技术来提取云芝胞外多糖的方法，该方法既提高了云芝胞外多糖的提取效果，又减少了废水的排放，増加了社会效益。为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行一种双膜法提取云芝胞外多糖的方法，该方法包括下述步骤I)将云芝发酵液通过微滤膜，得到微滤透析液和菌丝体，收集微滤透析液；其中，微滤膜的孔径在O. 05 I μ m，操作温度为10 70°C，工作压カ进压为2 8bar，出压为O 5bar ；2)将步骤I)中的微滤透析液通过超滤膜，得到超滤透析液和浓缩液，收集浓缩液；其中，超滤选择截留分子量为800 IOOODa的超滤膜，操作温度为38 50°C，工作压カ进压为I 8bar,出压为O. 5 3bar ；3)将步骤2)中超滤浓缩液在低温条件下浓缩得到浓缩浆；浓缩浆再进ー步低温真空烘干至干燥物水分含量为3 8%，即得。所得干燥物即为云芝胞外多糖。优选将步骤2)中超滤浓缩液在40 80°C条件下浓缩到固形物含量为30 70%得到浓缩浆，再将所得的浓缩浆在60 75°C，真空度-O. 08 -O. 085Mpa的条件下进行烘干，烘干至干燥物水分含量为3 8%。优选微滤采用孔径为O. 05 O. 5 μ m的微滤膜，进ー步优选微滤采用孔径为
0.05 μ m的微滤膜，微滤采用50 60°C的操作温度，进压为2 4bar，出压为O. 8
1.5bar,最优选微滤采用孔径为O. 05 μ m的微滤膜,微滤采用50 60°C的操作温度，进压为3bar，出压为lbar。优选超滤采用截留分子量为800 IOOODa的超滤膜，超滤采用40 450C的操作温度，进压为6 8bar，出压为I 3bar。最优选超滤采用截留分子量为IOOODa的超滤膜，超滤采用40°C的操作温度，进压为7bar，出压为2bar。
本发明微滤所用膜为陶瓷膜或有机膜。超滤所用膜材料可选用PAN、PVDF、PC、PES、PP、PE复合膜中的ー种。云芝胞外多糖是生物活性产品，经实验发现其对温度较为敏感，若温度超过60°C，每升高5°C，云芝胞外多糖指标下降10%。在不超过60°C范围内，分别选取20、30、40、50、600C 5个温度进行膜分离的操作，结果发现，在这5个温度操作所得到的云芝胞外多糖其理化指标相差不大，但是不同温度下膜通量及维持该温度所产生的能耗大不相同，低温下膜通量较小，而且维持低温所需冷却水较大，温度升高，操作过程不需要冷却水或需要极少的冷却水，优选膜过滤温度范围40 60°C，进ー步优选微滤膜50 60°C，超滤膜40 45°C。本发明采用云芝发酵液通过微滤膜，得到发酵液的微滤透析液和菌丝体，菌丝体可用于提取云芝胞内糖；微滤透析液通过超滤膜，得到超滤透析液和浓缩液，超滤透析液可作为发酵配料水；经双膜处理后可显著降低生产成本。与现有技术比较本发明生产方法为云芝胞外多糖分离提取提供了一种新的方法，该方法具有以下几个突出的优点 I、微滤除菌丝体提高菌丝体得率，操作过程中无机械カ破坏，极大程度保存了菌丝体内云芝胞内糖成分，配套成本低，无须板框、离心机等装置；2、超滤I旲的过滤精度闻，单糖去除率闻，提闻z 芝胞外多糖广品质量；同时，超滤透析液中含有单糖，可作为发酵配料用水，減少了污水处理量；3、用超滤膜进行预浓缩，实现冷浓缩，減少蒸汽用量，降低生产成本；4、本发明生产过程无酒精消耗，极大的降低了生产成本和エ时消耗，同时，本发明实现清洁自动化生产，极大改善了工作环境。5、近年来膜技术在国内外不断得到广泛的推广，膜成本也在不断下降，将膜分离纯化技术应用到云芝胞外多糖的提取过程中将产生显著的经济效益。应用膜技术不仅能提高产品质量，还能减少废水的排放，保护环境，实现自动化控制和清洁生产，降低生产成本，还能改善工人的工作环境，提高工作效率。 6、采用本发明方法得到的多糖得率高达2. 54g/L，总糖含量50. 41%，肽含量29. 75%，单糖2. 14%。云芝胞内糖肽标准品购自中国药品生物制品检定所，总糖和多糖测定方法苯酚-硫酸法，按照国家药品标准(WS-XG-021-2002)所提供方法；还原糖测定方法DNS法測定；肽含量測定方法国家药品标准(WS-XG-021-2002)所提供方法；相对分子质量測定方法高效液相色谱，WATERS 6'凝胶色谱柱为Ultrahudrgel Linear 7.8mmX300mm。经检测其有效成分的相对分子质量和标准晶出峰时间一致，符合国家药品标准的要求，因此，该方法在生产上是可行的。与传统水提法相比，云芝胞外多糖的提取率提高了至少O. 8个百分点，总糖含量和肽含量提高了 20%以上，单糖含量降低了至少3个百分点，且提取时间缩短3倍以上，成本大幅度降低；提取全过程避免了高温加热，从而減少了高温对多糖的破坏；所用仪器设备操作方便，自动化程度较高，便于大規模生产。
图I为双膜法提取云芝胞外多糖的エ艺流程图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进ー步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。实施例I本发明云芝胞外多糖提取方法按下述步骤进行I、云芝发酵液来源由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供变色栓菌(云芝)，Trametes，保藏号CGMCC 5. 161，将菌株转接到斜面培养基26 28°C常规培养7天，得活化的云芝菌株；将活化好的云芝菌株接种于种子培养基，其中种子培养基组成为葡萄糖6%，酵母粉4%，蛋白胨5%，磷酸ニ氢钾O. 2%，硫酸镁O. 02%，消泡剂O. 1%，用水配制，pH值自然，26 28°C振荡培养3天得云芝一级种子液；将一级种子液接入ニ级种子培养基，其中二级·种子培养基组成为葡萄糖4%，酵母粉4%，蛋白胨4%，磷酸ニ氢钾O. 2%，硫酸镁O. 02%,消泡剂
O.1%，用水配制，pH值自然，26 28°C培养3天，接种量1%，通气I : O. 4 O. 8vvm ;将ニ级种子培养基接入发酵培养基，其中发酵培养基组成为葡萄糖3%，酵母粉4%，蛋白胨4%，磷酸ニ氢钾O. 2%，硫酸镁O. 02%,消泡剂O. 1%，用水配制，pH值自然，26 28°C培养4天，接种量3%，通气I : O. 3 O. 5vvm，发酵结束即为云芝发酵液。2、微滤过滤将上述云芝发酵液2000Kg (发酵液固形物含量为3%)通过微滤过滤，得到云芝发酵液的微滤透析液1750Kg和250Kg的湿菌丝体(含水量为81%)，透析液的透光率为85%，湿菌丝体可用于提取云芝胞内糖。微滤过滤所用的膜材料是孔径为50nm的陶瓷膜，具体エ艺条件是操作温度为50 60°C，进压为3. Obar,出压为I. Obar,压カ差为
2.Obar03、超滤过滤将步骤I所得的微滤透析液1750Kg通过超滤过滤得超滤透析液1550Kg和200Kg超滤浓缩液，透析液的透光率为95%，1550Kg透析液可作为发酵配料用水。超滤所用的膜材料是截留分子量为IOOODa的PVDF的超滤膜，エ艺条件是操作温度为40°C,进压为7bar,出压为2bar,压カ差为5bar。4、低温浓缩将步骤2超滤所得的超滤浓缩液200Kg在真空度为O. 09MPa，浓缩温度为60°C下继续将云芝胞外多糖浓缩至固形物含量58%的云芝胞外多糖浓缩浆18. 5Kg。5、低温真空干燥将步骤3得到的18. 5kg云芝胞外多糖浓缩浆进入真空干燥箱进行烘干，得到10. 5kg云芝胞外多糖粗品(水分含量4%)。具体エ艺条件是干燥温度75 85°C，真空度为-O. 085Mpa，干燥时间40h。该エ艺条件下得到云芝胞外多糖总糖含量50. 41%，肽含量 29. 75%,单糖 2. 14%。实施例2本发明云芝胞外多糖提取方法，按下述步骤进行I、微滤过滤将实施例I中的云芝发酵液2000Kg (发酵液固形物含量为3%)通过微滤过滤，得到云芝发酵液的微滤透析液1730Kg和270Kg的湿菌丝体(含水量为76%)，透析液的透光率为86%，湿菌丝体可用于提取云芝胞内糖。微滤过滤所用的膜材料是孔径为IOOnm的陶瓷膜，具体エ艺条件是操作温度为50 60°C，进压2. Obar,出压I. Obar，压カ差为 I. Obar02、超滤过滤将步骤I所得的微滤透析液1730Kg通过超滤过滤得超滤透析液1520Kg和210Kg超滤浓缩液，透析液的透光率为96%，1520Kg透析液可作为发酵配料用水。超滤所用的膜材料是截留分子量为SOODa的PAN的超滤膜，エ艺条件是操作温度为42°C，进压为6. 5bar,出压为2. Obar,压カ差为4. 5bar。3、低温浓缩将步骤2超滤所得的超滤浓缩液210Kg在真空度为O. 09MPa，浓缩温度为60°C下继续将云芝胞外多糖浓缩至固形物含量57%的云芝胞外多糖浓缩浆18Kg。4、低温真空干燥将步骤3得到的18kg云芝胞外多糖浓缩浆进入真空干燥箱进行烘干，得到10. 2kg云芝胞外多糖粗品(水分含量3%)。具体エ艺条件是干燥温度75 85°C，真空度为-0.085Mpa，干燥时间40h。该エ艺条件下得到云芝胞外多糖总糖含量
47.50%，肽含量 29. 15%,单糖 3. 05%。实施例3本发明云芝胞外多糖提取方法，按下述步骤进行 I、微滤过滤将云芝发酵后的2000Kg发酵液(发酵液固形物含量为3%)通过微滤过滤，得到云芝发酵液的微滤透析液1790Kg和210Kg的湿菌丝体(含水量为80%)，透析液的透光率为80%，湿菌丝体可用于提取云芝胞内糖。微滤过滤所用的膜材料是孔径为500nm的陶瓷膜，具体エ艺条件是操作温度为50 60°C，进压2. 3bar，出压O. 9bar，压カ差为
I.4bar。2、超滤过滤将步骤I所得的微滤透析液1790Kg通过超滤过滤得超滤透析液1587Kg和203Kg超滤浓缩液，透析液的透光率为94%，1587Kg透析液可作为发酵配料用水。超滤所用的膜材料是截留分子量为900Da的PP的超滤膜，エ艺条件是操作温度为45°C，进压为6. Obar,出压为I. 8bar,压カ差为4. 2bar。3、低温浓缩将步骤2超滤所得的超滤浓缩液203Kg在真空度为O. 09MPa,浓缩温度为60°C下继续将云芝胞外多糖浓缩至固形物含量56%的云芝胞外多糖浓缩浆18. 6Kg。4、低温真空干燥将步骤3得到的18. 6kg云芝胞外多糖浓缩浆进入真空干燥箱进行烘干，得到10. 6kg云芝胞外多糖粗品(水分含量3%)。具体エ艺条件是干燥温度75 85°C，真空度为-O. 085Mpa，干燥时间38h。该エ艺条件下得到云芝胞外多糖总糖含量
48.52%，肽含量 28. 73%,单糖 2. 87%。
权利要求
1.一种双膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是该方法包括下述步骤 1)将云芝发酵液通过微滤膜，得到微滤透析液和菌丝体，收集微滤透析液；其中，微滤膜的孔径在O. 05 I μ m，操作温度为10 70°C，工作压カ进压为2 8bar，出压为O 5bar ； 2)将步骤I)中的微滤透析液通过超滤膜，得到超滤透析液和浓缩液，收集浓缩液；其中，超滤选择截留分子量为800 IOOODa的超滤膜，操作温度为38 50°C，工作压カ进压为I 8bar,出压为O. 5 3bar ； 3)将步骤2)中超滤浓缩液在低温条件下浓缩得到浓缩浆；浓缩浆再进ー步低温真空烘干至干燥物水分含量为3 8%，即得。
2.根据权利要求I所述的双膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步骤I)中采用的微滤膜的孔径为O. 05 O. 5 μ m。
3.根据权利要求I所述的双膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步骤I)中微滤采用的操作温度为50 60°C，工作压カ进压为2 4bar，出压为O. 8 I. 5bar。
4.根据权利要求I所述的双膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步骤2)中超滤膜选择截留分子量为800 IOOODa的超滤膜。
5.根据权利要求I所述的双膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步骤2)中超滤膜过滤采用的操作温度为40 45°C,工作压カ进压为6 8bar,出压为I 3bar。
6.根据权利要求I所述的双膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步骤I)中微滤所用膜为陶瓷膜或有机膜。
7.根据权利要求I所述的双膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步骤2)中超滤所用膜材料选用PAN、PVDF, PC、PES, PP、PE复合膜中的ー种。
8.根据权利要求I所述的双膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步骤3)中将步骤2)中超滤浓缩液在40 80°C条件下浓缩到固形物含量为30 70%得到浓缩浆。
9.根据权利要求I所述的双膜法提取云芝胞外多糖的方法，其特征是所述步骤3)中所得的浓缩浆在60 85°C，真空度-O. 08 -O. 085Mpa的条件下进行烘干，烘干至干燥物水分含量为3 8%,即得。
全文摘要
本发明公开了一种双膜法提取云芝胞外多糖的方法，该方法是将云芝发酵液依次通过微滤和超滤处理分离得到云芝胞外多糖。本发明改变了传统云芝胞外多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了云芝胞外多糖等有效成分的提取效果，降低了生产中乙醇用量，减少滤液废水的排放，显著增加了经济和社会效益。
文档编号C08B37/00GK102827304SQ20121034441
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者王文风, 徐国华, 袁兵兵, 徐玲, 张瑞华, 王英燕 申请人:江苏神华药业有限公司