采用离子交换树脂对紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖进行脱色的方法
【专利摘要】本发明公开一种采用离子交换树脂对紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖进行脱色的方法,包括如下步骤:a)对紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖进行预处理,得到分子量范围为30KD~300KD的精制紫芝多糖;b)将步骤a)获得的精制紫芝多糖置于离子交换树脂,在脱色时间2~4h,树脂用量0.25g~0.75g/10ml,脱色温度25~35℃、pH值6~7的脱色条件下进行脱色,得到脱色之后的紫芝多糖。按照本发明方法得到脱色之后的紫芝多糖,其实际脱色率为85%~90%,多糖回收率为65%~70%。
【专利说明】采用离子交换树脂对紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖进行脱色的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及中药化学领域,具体涉及一种采用离子交换树脂对紫芝液体深层发酵菌丝体多糖液进行脱色的方法。
【背景技术】
[0002]紫芝(Ganoderma sinense)是我国名贵中药灵芝的一种(国家药典委员会.中华人民共和国药典[S]2010年版一部北京:中国医药科技出版社,2010:174),是祖国中医药宝库中的珍品,素有"仙草"之誉。古今药理与临床研究均证明,紫芝确有防病治病、延年益寿之功效。东汉时期的《神农本草经》、明代著名医药学家李时珍的《本草纲目》,都对紫芝的功效有详细的极为肯定的记载。现代药理学与临床实践进一步证实了紫芝的药理作用,大量研究表明紫芝多糖是其主要活性成分之一,具有免疫调节、抗肿瘤(杨国红,杨义芳,金隽迪.紫芝液体深层发酵液的抗肿瘤活性部位研究[J].中草药,2008,39 (6):877-880)、抗氧化、抗病毒、降血糖和保肝等药理作用,并证实紫芝多糖是紫芝扶正固本、滋补强壮、延年益寿的主要成分。
[0003]紫芝多糖产品颜色深、色素较多,严重影响多糖的纯度、色度、生物活性,也阻碍了对多糖结构与其生物活性关系的深入研究,因此在纯化过程中应当进行脱色(罗玺,唐庆九*,张劲松,等.灵芝多糖 树脂法脱色工艺优化[J].食品科学,2011,32(16):5-10)。传统脱色方法一般有活性炭吸附、双氧水氧化法等,其中活性炭法脱色时间较长,多糖保留率低,双氧水是强氧化剂,容易破坏多糖结构,影响其活性(袁红波,张劲松,贾薇,等.利用大孔树脂对低分子量灵芝多糖脱色的研究[J].食品工业科技,2009,30 (3):204-206)。
[0004]大孔树脂脱色技术近年来常应用于中草药有效成分的脱色。大孔树脂具有物理化学稳定性高、比表面积大、处理能力大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、成本不高等诸多优点,因此可利用树脂的选择性吸附功能将多糖中的色素除去。国内外文献大多采取正交试验模型对灵芝多糖脱色工艺进行优化,而基于响应面法(response surface methodology, RSM)对紫芝发酵多糖脱色优化工艺的报道尚未出现。
【发明内容】
[0005]本发明在单因素试验的基础上,利用响应面分析法对紫芝发酵多糖脱色工艺进行优化,并结合实际生产条件,确定合理的脱色工艺参数,旨为后续紫芝多糖的分离纯化和活性研究提供基础,同时为脱色产业化提供一定的理论依据。
[0006]因此,本发明提供一种采用离子交换树脂对紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖进行脱色的方法,包括如下步骤:
[0007]a)对紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖进行预处理,得到分子量范围为30KD~300KD的精制紫芝多糖;
[0008]b)将步骤a)获得的精制紫芝多糖置于离子交换树脂,在脱色时间2~4h,树脂用量0.25g~0.75g/10ml,脱色温度25~35°C、pH值6~7的脱色条件下进行脱色,得到脱色之后的紫芝多糖。
[0009]本发明所使用的术语“紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖”是指利用液体深层发酵技术从菌丝体中提取的紫芝粗多糖。具体制备方法为将发酵完成的放罐液进行板框过滤,弃去胞外液,取过滤后菌丝体;将菌丝体用去离子水洗涤,洗至板框滤出液为无色透明并不再产生气泡,过滤称重,将洗涤过滤后的菌丝体称重,按菌丝体重量加适量倍数去离子水,置浸泡罐以一定时间加热提取数次后于板框过滤分离,提取液经过刮板浓缩及单罐浓缩至一定量后加该浓缩液适量倍数质量的85%乙醇于4°C放置12h ;将醇沉物置离心机1200r/min离心分离,取沉淀物;将湿醇沉物装盘后放入箱式烘干器,控制真空度加热至30~40°C烘干2h后取出醇沉物,粉碎;粉碎后重新装盘,再放入烘箱,缓慢升温至65°C烘干2h,最后得紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖。
[0010]根据本发明一个优选的实施方式,步骤a)所述的预处理包括如下步骤:
[0011]I)将紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖按液料比150:1~250:1溶解于水中;
[0012]2)以4000~5000rpm/min的速率离心两次或两次以上,取上清液,每次离心20~40min ;
[0013]3)上清液在温度20~40°C、压力0.02~0.06Mpa条件下过30KD中空纤维超滤膜,截留液稀释后过300KD中空纤维超滤膜,超滤液浓缩冷冻干燥后,得精制紫芝多糖。
[0014]本发明所使用的术语“液料比”是指“液”的体积除以“料”的质量,这里“液”指水,单位用ml,“料”指紫芝粗多糖,单位用g。
[0015]根据本发明一个特别优选的实施方式,步骤I)中所述液料比为180: I~220: 1,更优选 200: I。
[0016]根据本发明一个特别优选的实施方式,步骤I)中所述水为去离子水。
[0017]根据本发明一个特别优选的实施方式,步骤2)中所述离心速率为4500~5000rpm/min,更优选 5000rpm/min ;离心时间为 25 ~35min,更优选 30min。
[0018]根据本发明一个特别优选的实施方式,步骤b)所述的离子交换树脂为LS-850阴离子交换树脂。
[0019]根据本发明一个特别优选的实施方式,步骤b)中脱色时间为2.5h,树脂用量为
0.75g/10ml,脱色温度为28°C,pH值为6。
[0020]本发明所述脱色方法为将树脂和紫芝多糖溶液置入具塞锥形瓶中,然后将锥形瓶置于摇床中进行。所述摇床的转速为100~140r/min,优选120r/min。
[0021]按照本发明方法得到脱色之后的紫芝多糖,其实际脱色率为85%~90%,多糖回收率为65%~70% ;在本发明最佳脱色条件下紫芝多糖的平均脱色率为87.8%,多糖回收率为65%~70%。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为实施例1所述的不同种类树脂对紫芝多糖的脱色效果;
[0023]图2为实施例2所述的脱色时间对紫芝多糖脱色效果的影响;
[0024]图3为实施例3所述的树脂用量对紫芝多糖脱色效果的影响;
[0025]图4为实施例4所述的温度对紫芝多糖脱色效果的影响;[0026]图5为实施例5所述的pH值对紫芝多糖脱色效果的影响。
【具体实施方式】
[0027]原材料和试剂
[0028]用于以下实施例1-5的紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖的制备:将发酵完成的放罐液进行板框过滤,弃去胞外液,取过滤后菌丝体;将菌丝体用去离子水洗涤,洗至板框滤出液为无色透明并不再产生气泡,过滤称重,将洗涤过滤后的菌丝体称重,按菌丝体重量加适量倍数去离子水,置浸泡罐以一定时间加热提取数次后于板框过滤分离,提取液经过刮板浓缩及单罐浓缩至一定量后加该浓缩液适量倍数质量的85%乙醇于4°C放置12h ;将醇沉物置离心机1200r/min离心分离,取沉淀物装盘后放入箱式烘干器,控制真空度加热至30~40°C烘干2h后取出醇沉物,粉碎;粉碎后重新装盘,再放入烘箱,缓慢升温至65°C烘干2h,最后得紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖。
[0029]用于以下实施例1-5的精制紫芝多糖溶液的制备:紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖按液料比200: I溶解于双蒸水中,离心(5000rpm/min)处理两次,每次20分钟,取上清液过30KD中空纤维超滤膜,截留液稀释后过300KD中空纤维超滤膜,超滤液浓缩冷冻干燥后,得精制多糖GS-B,经HPLC测定相对分子量为30KD~300KD ;取上述紫芝多糖GS-B
1.0g,溶解在100mL (液料比100:1)双蒸水中,静置30分钟,离心(5000rpm/min)处理30分钟,取上清液得精制紫芝多糖溶液;
[0030]离子交换树脂DlOl、AB-8、XAD7-HP、LS-840、LS-850 (陕西蓝深特种树脂有限公司);苯酚、葡萄糖、硫酸、盐酸、氢氧化钠分析纯(国药集团试剂有限公司)。
[0031]设备仪器: [0032]UV-25OOPC(日本Shimadzu) ;AB204_S型电子天平(瑞士MettlerFoledo) ;PHS-3C型PH计(上海雷磁仪器有限公司);ZHWY-3122A双层特大容量摇瓶机(上海智城分析仪器制造有限公司);BT01-100恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司);BS-100A型自动收集仪(上海沪西分析仪器厂)。
[0033]多糖的检测:多糖采用苯酚-硫酸法检测。精确称取105°C干燥至恒重的无水葡萄糖0.2540g,溶解定容于1000ml容量瓶中配成浓度为0.254mg/ml的葡萄糖标准溶液,精确量取葡萄糖标准溶液并加蒸馏水至总体积为300 μ I ;以加蒸馏水的试管为空白,然后各加5%苯酚溶液300 μ 1,硫酸4.0ml,迅速摇匀在室温下放置30min,于488nm处测定吸光度。以葡萄糖含量(Ug)为横坐标,以吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程为A =
0.01lx+0.081 (R2 = 0.9982)
[0034]按式⑴计算多糖回收率(R1)。
[0035]R1 = M/M0*100%(I)
[0036]式中:
[0037]M-脱色后多糖含量,g ;
[0038]M0-脱色前多糖含量,go
[0039]脱色率(R2)的测定:以蒸馏水为空白,将多糖溶液进行全波长检测,选择吸收最大(263nm)处测定吸光度。
[0040]R2 = (A0-A)/A0^lOO %(2)[0041]式中:
[0042]A0-脱色前吸光度;
[0043]A-脱色后吸光度。
[0044]实施例1:树脂筛选
[0045]取5种处理过的树脂各0.5g,置入具塞锥形瓶中,每瓶加入IOml精制紫芝多糖溶液,置于摇床中,转速120r/min,恒温30°C,振摇3h,结果见图1。
[0046]树脂对大分子物质的吸附主要以两种方式进行:一是树脂上的离子与吸附物质的离子交换将其吸附;二是相似相吸,依靠次级键(疏水作用力、范德华力等)对物质进行吸附。脱色效果除了主要考察脱色率外,还需要同时兼顾多糖回收率这项指标。由图1可知,LS-850阴离子交换树脂对紫芝多糖脱色效果大大优于其它类型树脂(如图1所示)。LS-850中阴离子通过离子键的形式与紫芝多糖中色素阴离子交换,并且色素的非极性部分与树脂基质中的基团以疏水力结合,从而达到脱色目的。因此本发明优选LS-850阴离子交换树脂对紫芝多糖进行脱色。
[0047]以下实施例2-5以LS-850为脱色树脂研究对象,选取4个因素即脱色时间,树脂用量,脱色温度,PH值4个影响因素,研究其对紫芝多糖脱色效果的影响,以确定脱色因素变化范围以及最佳响应曲面考察范围。
[0048]实施例2:脱色时间的影响
[0049]精确量取紫芝多糖溶液IOml 5份,在相同的树脂用量LS-8500.5g、温度为30°C、pH值为6.0的条件下,考察不同时间对脱色的影响,结果见图2。
[0050]由图2可知,随着时间的延长,树脂脱色效果明显增强,LS-850树脂到3h后,脱色率开始增加缓慢,并有减小的趋势,说明色素的吸附和解吸活动开始朝着动态平衡方向发展。而多糖得率基本上与脱色率呈现相反的趋势,4h以后,多糖得率几乎不再下降。为了将多糖中的色素更多的去除,并且尽可能的减少多糖的损失,综合考虑两个指标,将本发明方法的脱色时间响应面分析考察范围优选为2~4h。
[0051]实施例3:树脂用量的影响
[0052]精确量取紫芝多糖溶液IOml 5份,在相同的脱色时间为3h、温度为30°C、pH值为
6.0的条件下,考察不同树脂用量对脱色的影响,结果见图3。
[0053]由图3可知,随着树脂用量的增加,脱色率呈现上升趋势,但当树脂用量达到0.5g以后,脱色率增加的趋势明显放缓,此时多糖回收率依然继续走低。为了后续科学研究或工业上进一步深加工处理,尽可能增加脱色效果的同时兼顾较高的多糖回收率,降低多糖损耗率,故本发明方法的树脂用量响应面分析考察范围优选为0.25g~0.75g。
[0054]实施例4:脱色温度的影响
[0055]精确量取紫芝多糖溶液1Oml 5份,在相同的脱色时间为3h、树脂用量为0.5g、PH值为6.0的条件下,考察不同脱色温度对脱色的影响,结果见图4。
[0056]由图4可知,温度越高,理论上色素分子的扩散速度越快,多糖溶液粘度也下降,这有利于色素的吸附。由图4可知,温度在35°C时脱色率最高,而温度在25°C时多糖得率最高,综合考虑两个指标,将本发明方法的脱色温度响应面分析考察范围优选为25~35°C。
[0057]实施例5:pH值的影响
[0058]精确量取紫芝多糖溶液IOml 7份,在相同的脱色时间为3h、树脂用量为0.5g、温度为30°C的条件下,考察不同pH值对脱色的影响,结果见图5。
[0059]pH值会影响溶液中分子的带电情况,从而影响它们与树脂作用力的大小,合适的PH值能促使树脂吸附更多的色素并且减少多糖的损失。紫芝多糖为酸多糖,经检测pH值大约为6,呈弱酸性,由图5可知,在pH值为6-7时,能较好的兼顾脱色率和多糖回收率两项指标。考虑到为给后续响应面分析减少实验次数,即减少一个考察因素,优选将溶液的PH值确定为6,即不改变紫芝多糖溶液的pH值。
[0060]实施例6:
[0061]将发酵完成的放罐液进行板框过滤,弃去胞外液,取过滤后菌丝体;将菌丝体用去离子水洗涤,洗至板框滤出液为无色透明并不再产生气泡,过滤称重,将洗涤过滤后的菌丝体称重,按菌丝体重量加适量倍数去离子水,置浸泡罐以一定时间加热提取数次后于板框过滤分离,提取液经过刮板浓缩及单罐浓缩至一定量后加该浓缩液适量倍数质量的85%乙醇于4°C放置12h ;将醇沉物置离心机1200r/min离心分离,取沉淀物装盘后放入箱式烘干器,控制真空度加热至30~40°C烘干2h后取出醇沉物,粉碎;粉碎后重新装盘,再放入烘箱,缓慢升温至65°C烘干2h,最后得紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖;取粗多糖按液料比200:1溶解于双蒸水中,离心(5000rpm/min)处理两次,每次20分钟,取上清液过30KD中空纤维超滤膜,截留液稀释后过300KD中空纤维超滤膜,超滤液浓缩冷冻干燥后,得精制多糖GS-B,经HPLC测定相对分子量为30KD~300KD ;取上述紫芝多糖GS-B l.0g,溶解在100ml(液料比100: I)双蒸水中,静置30分钟,离心(5000rpm/min)处理30分钟,取上清液得精制紫芝多糖溶液;精确量取紫芝多糖溶液IOml 1份,将树脂LS-8500.75g和紫芝多糖溶液置入具塞锥形瓶中,然后控制条件参数为温度30°C、pH值6.0、时间2.5h、摇床的转速120r/min,将锥形瓶置 于摇床中开始振摇脱色,结束后采用多糖回收率和脱色率测定方法,测得多糖回收率为67.3%,脱色率为87.1%。
[0062]实施例7:
[0063]将发酵完成的放罐液进行板框过滤,弃去胞外液,取过滤后菌丝体;将菌丝体用去离子水洗涤,洗至板框滤出液为无色透明并不再产生气泡,过滤称重,将洗涤过滤后的菌丝体称重,按菌丝体重量加适量倍数去离子水,置浸泡罐以一定时间加热提取数次后于板框过滤分离,提取液经过刮板浓缩及单罐浓缩至一定量后加该浓缩液适量倍数质量的85%乙醇于4°C放置12h ;将醇沉物置离心机1200r/min离心分离,取沉淀物装盘后放入箱式烘干器,控制真空度加热至30~40°C烘干2h后取出醇沉物,粉碎;粉碎后重新装盘,再放入烘箱,缓慢升温至65°C烘干2h,最后得紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖;取粗多糖按液料比200:1溶解于双蒸水中,离心(5000rpm/min)处理两次,每次20分钟,取上清液过30KD中空纤维超滤膜,截留液稀释后过300KD中空纤维超滤膜,超滤液浓缩冷冻干燥后,得精制多糖GS-B,经HPLC测定相对分子量为30KD~300KD ;取上述紫芝多糖GS-B 1.0g,溶解在100ml(液料比100: I)双蒸水中,静置30分钟,离心(5000rpm/min)处理30分钟,取上清液得精制紫芝多糖溶液;精确量取紫芝多糖溶液1011111份,将树脂1^-8500.75g和紫芝多糖溶液置入具塞锥形瓶中,然后控制条件参数为温度28°C、pH值6.0、时间2.5h、摇床的转速120r/min,将锥形瓶置于摇床中开始振摇脱色,结束后采用多糖回收率和脱色率测定方法,测得多糖回收率为66.1%,脱色率为89.2%。
[0064]实施例8:[0065] 将发酵完成的放罐液进行板框过滤,弃去胞外液,取过滤后菌丝体;将菌丝体用去离子水洗涤,洗至板框滤出液为无色透明并不再产生气泡,过滤称重,将洗涤过滤后的菌丝体称重,按菌丝体重量加适量倍数去离子水,置浸泡罐以一定时间加热提取数次后于板框过滤分离,提取液经过刮板浓缩及单罐浓缩至一定量后加该浓缩液适量倍数质量的85%乙醇于4°C放置12h ;将醇沉物置离心机1200r/min离心分离,取沉淀物装盘后放入箱式烘干器,控制真空度加热至30~40°C烘干2h后取出醇沉物,粉碎;粉碎后重新装盘,再放入烘箱,缓慢升温至65°C烘干2h,最后得紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖;取粗多糖按液料比200:1溶解于双蒸水中,离心(5000rpm/min)处理两次,每次20分钟,取上清液过30KD中空纤维超滤膜,截留液稀释后过300KD中空纤维超滤膜,超滤液浓缩冷冻干燥后,得精制多糖GS-B,经HPLC测定相对分子量为30KD~300KD ;取上述紫芝多糖GS-B l.0g,溶解在100mL (液料比100:1)双蒸水中,静置30分钟,离心(5000rpm/min)处理30分钟,取上清液得精制紫芝多糖溶液;精确量取紫芝多糖溶液IOmll份,将树脂LS-8500.75g和紫芝多糖溶液置入具塞锥形 瓶中,然后控制条件参数为温度35°C、pH值6.0、时间3h、摇床的转速120r/min,将锥形瓶置于摇床中开始振摇脱色,结束后采用多糖回收率和脱色率测定方法,测得多糖回收率为68.7%,脱色率为85.3%。
【权利要求】
1.一种采用离子交换树脂对紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖进行脱色的方法,包括如下步骤: a)对紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖进行预处理,得到分子量范围为30KD~300KD的精制紫芝多糖; b)将步骤a)获得的精制紫芝多糖置于离子交换树脂,在脱色时间为2~4h,树脂用量为0.25g~0.75g/10ml,脱色温度为25~35°C、pH值为6~7的脱色条件下进行脱色,得到脱色之后的紫芝多糖。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤a)所述的预处理包括如下步骤: 1)将紫芝液体深层发酵菌丝体粗多糖按液料比150:1~250: I溶解于水中; 2)以4000~5000rpm/min的速率离心两次或两次以上,取上清液,每次离心20~40min ; 3)上清液在温度20~40°C、压力0.02~0.06Mpa条件下过30KD中空纤维超滤膜,截留液稀释后过300KD中空纤维超滤膜,超滤液浓缩冷冻干燥后,得精制紫芝多糖。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于步骤I)中所述液料比为180: I~220: 1,优选 200: I。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于步骤I)中所述水为去离子水。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于步骤2)中所述离心速率为4500~5000rpm/min,优选 5000rpm/min ;离心时间为 25 ~35min,优选 30min。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤b)所述的离子交换树脂为LS-850阴离子交换树脂。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤b)中所述脱色时间为2.5h,所述树脂用量为0.75g/10ml,所述脱色温度为28°C,所述pH值为6。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于步骤b)中脱色过程在摇床中进行。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于所述摇床的转速为100~140r/min。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于所述摇床的转速为120r/min。
【文档编号】C08B37/00GK103880970SQ201210559585
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】杨义芳, 胡晓, 杨悦文, 罗永明, 吴春珍, 屈晓晟, 黄春跃 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院