一种卡拉胶硫酸酯化多糖的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种卡拉胶硫酸酯化多糖的制备方法，属于药物加工领域。所述的卡拉胶硫酸酯化多糖，可用于开发新型抗流感病毒类药物，是利用微波辐射酸解和硫酸酯化反应制得的分子量分别为1000Da~3000Da、5000Da~8000Da和10000Da~12000Da的特定硫酸根取代度的硫酸酯化多糖，可采用纳滤和真空冷冻干燥对产品进行纯化干燥。本工艺产品得率大于80%，分子量集中，操作简单，重复性好。产品和生产工艺可广泛应用于活性多糖的功能研究和制药保健品领域。
【专利说明】一种卡拉胶硫酸酯化多糖的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多糖类药物加工技术，具体的讲是利用卡拉胶制备一种特定分子量和特定硫酸取代度的硫酸酯化多糖的方法。
【背景技术】
[0002]海藻是海洋植物中数量和品种最多的一类，对它们生物活性的研究日趋广阔。海藻生物活性物质大致可分为两种，一种是细胞间的粘性多糖，主要包括褐藻中藻酸、褐藻糖胶，红藻中琼胶、卡拉胶等；另一种是分子量较小，吸收后能直接或间接影响体内代谢物质，主要包括卤族化合物、萜类化合物、溴酚类化合物、对苯二酚、海藻单宁和昆布氨酸等。到目前为止，能进行工业化生产的海藻多糖有褐藻胶、琼胶、卡拉胶、叉红藻胶等。从红藻角叉菜中提取的卡拉胶是一种硫酸半乳聚糖，体外实验证明它对正常细胞无不良影响，但能阻断病毒对细胞的吸附、侵入。通过酸降解和硫酸化得到的特定分子量的卡拉胶具有较好的抗流感活性，而且卡拉胶多糖的活性与多糖分子的分子量大小、硫酸根含量以及多糖的空间构象有较大的联系。
[0003]多糖的分子量是影响其生物活性的重要因素之一，因为多糖的分子量在某种程度上反映了多糖的溶解度、粘度以及能否形成于受体匹配的构象，例如低分子量的肝素(平均分子量为4 kDa~5 kDa，分布范围为I kDa~10 kDa)的抗血栓作用优于普通肝素(30 kDa)，具有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小、口服易吸收等特点。实际上，多糖与受体结合时，只有其分子中的几个寡聚糖与受体结合，因此与酶想死，其分子中存在一个或者几个寡糖片段的活性中心，目前，根据活性中心来寻找和发现新的小分子寡糖已成为研究多糖的发展趋势。鉴于此，选择合适的降解方法获得窄分布的小分子量多糖活寡糖片段对筛选小分子量多糖药物和发现活性中心具有重要意义。
[0004]多糖降解的方法 有很多种，如酸降解、氧化降解、超声波(辅助)降解和微波(辅助)降解等，其中微波辅助降解法因能借助微波迅速制热和均匀加热有利于多糖的均匀快速降解，从而能得到窄分子量分布的小分子量多糖或寡糖而引人瞩目，具有操作方便、污染低、收率高等特点。目前，卡拉胶的降解也只限于酶降解、氧化降解和酸降解，有关微波辅助降解法用于小分子量卡拉胶多糖的制备还较少见。
【发明内容】
[0005]本发明公开了一种卡拉胶硫酸酯化多糖的制备方法，目的在于为小分子量卡拉胶多糖硫酸酯化制备工艺提供了优化方案，使得目标产物分子量更集中，产物得率高，操作简单，重复性好，从而为卡拉胶硫酸多糖的生物活性研究提供原材料。
[0006]本发明一种卡拉胶硫酸酯化多糖，是由卡拉胶经微波辐射酸解和硫酸酯化反应后纯化干燥制得，具有特定的分子量分布和硫酸根取代度，具体制备方法如下:
(I)微波辐射酸解
a.将卡拉胶原料配成胶状液，制备量600 mL，微波预处理8~15 min，得到均匀透明的胶状溶液；在PH 2.0的情况下，用750 W微波处理1(T30 min ；
当微波处理时间为25~35 min时，多糖分子量为1000~3000 Da ;当微波处理时间为15~25 min时，多糖分子量为5000~8000 Da ;当微波处理时间为10~15 min时，多糖分子量为 10000 ~12000 Da ；
b.酸解反应结束后，加入lmol/L氢氧化钠溶液，将pH值回调至4.5，待温度下降至常温时再用碱调节pH至6.0 ;
c.酸解液采用旋转蒸发进行浓缩，分子量1000(T20000Da的多糖浓缩至8~12%，分子量小于10000 Da的多糖浓缩至12~18%，浓缩后进行喷雾干燥，喷头压力为1.5~3 kg，工作压力4~6 kg ；
(2)硫酸酯化反应
采用梯度升温进行硫酸酯化反应，在酯化剂氯磺酸和多糖的摩尔比为:3~5:1，反应4 h，3种分子量的多糖在45°C~80°C的梯度变温下反应，硫酸根取代度为1.13~1.95 ；
(3)纯化干燥
纯化工艺是采用250Da的纳滤膜，主要用于脱除S042_和无机离子，干燥工艺是真空冷冻干燥。
[0007]通过上述方法制备的硫酸酯化多糖具有良好的抗病毒活性，可用于开发新型抗流感病毒类药物。
[0008]本发明的有益效果:
本发明明确了特定分分子量和硫酸根取代度的卡拉胶硫酸酯化多糖的制备方法，优化了不同分子量卡拉胶多糖及其硫酸酯化衍生物的制备工艺，主要优势体现在以下三个方面:
(1)有效提高了特定范围小分子量卡拉胶多糖的制备效率和分子量集中程度，取得了令人满意的效果；
(2)确定了特定小分子量范围的微波酸解条件，制备方法相对酶解法等其他方法具有操作方便、污染低、收率高等特点；
(3)采取的硫酸酯化反应梯度升温的优化控制方法，使得卡拉胶多糖硫酸酯化更为均匀。对于小分子量卡拉胶硫酸多糖抗病毒活性的研究具有重要意义。
[0009]【具体实施方式】:
1、微波辐射酸解
(I)将卡拉胶原料配成5%胶状液，制备量600mL，微波预处理10 min，得到均匀透明的胶状溶液；在PH 2.0的情况下，用750 W微波处理1(T30 min。
[0010]a.当微波处理时间为30 min时，多糖分子量为1000~3000 Da ；
b.当微波处理时间为20min时，多糖分子量为5000~8000 Da ；
c.当微波处理时间为12min时，多糖分子量为10000~12000 Da。
[0011](2)酸解反应结束后，加入I mol/L氢氧化钠溶液，将pH值回调至4.5，待温度下降至常温时再用碱调节pH至6.0。
[0012](3)酸解液采用旋转蒸发进行浓缩，分子量10000~20000 Da的多糖浓缩至10%，分子量小于10000 Da的多糖浓缩至15%，浓缩后进行喷雾干燥，喷头压力为2 kg，工作压力 5 kg。[0013]、硫酸酯化反应
(1)在酯化剂氯磺酸和多糖的摩尔比为4:1时，反应4h时，不同分子量的多糖和反应温度控制，硫酸根取代度如下:
【权利要求】
1.一种卡拉胶硫酸酯化多糖，其特征在于本产品是由卡拉胶经微波辐射酸解和硫酸酯化反应后纯化干燥制得，具有特定的分子量分布和硫酸根取代度，具体制备方法如下: (1)微波辐射酸解 a.将卡拉胶原料配成胶状液，制备量600mL，微波预处理8-15 min，得到均匀透明的胶状溶液；在PH 2.0的情况下，用750 W微波处理10-30 min ； b.酸解反应结束后，加入lmol/L氢氧化钠溶液，将pH值回调至4.5，待温度下降至常温时再用碱调节pH至6.0 ; c.酸解液采用旋转蒸发进行浓缩，分子量10000-20000Da的多糖浓缩至8-12%，分子量小于10000 Da的多糖浓缩至12-18%，浓缩后进行喷雾干燥，喷头压力为1.5-3 kg，工作压力4-6 kg ； (2)硫酸酯化反应 采用梯度升温进行硫酸酯化反应，在酯化剂氯磺酸和多糖的摩尔比为:3：5:1，反应4 h，3种分子量的多糖在45°C-80°C的梯度变温下反应，硫酸根取代度为1.13-1.95 ； (3)纯化干燥 纯化工艺是采用250Da的纳滤膜，主要用于脱除S042_和无机离子，干燥工艺是真空冷冻干燥。
2.如权利要求1步骤(I)所述的用750W微波处理10-40 min，其特征在于当微波处理时间为25-35 min时，多糖分子量为1000-3000 Da ;当微波处理时间为15-25 min时，多糖分子量为5000-8000 Da ;当微波处理时间为10-15 min时，多糖分子量为10000-12000 Da。
3.如权利要求1所述的硫酸酯化多糖，其特征在于，所述的硫酸酯化多糖具有良好的抗病毒活性，可用于开发新型抗流感病毒类药物。
【文档编号】C08B37/00GK103467611SQ201310355375
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】龚方, 王乃强, 池振明, 胥九兵, 李方华 申请人:保龄宝生物股份有限公司, 中国海洋大学