石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用，同时公开了该石菖蒲多糖的制备方法，其方法如下：以石菖蒲为原料，经含脱脂、水提醇沉、离子交换和透析工序制备获得石菖蒲多糖。该制备方法简单稳定高效，适合工业化生产。本发明中的石菖蒲多糖经哺乳动物细胞和秀丽线虫疾病模型试验证实，能够显著缓解过氧化氢对神经细胞的氧化胁迫毒性，增强抗氧化酶活性，降低脂质过氧化产物含量并抑制细胞凋亡，还能够抑制β-淀粉样蛋白的神经毒性，表明其具有良好的神经保护作用。
【专利说明】石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于健康食品/保健食品【技术领域】，具体涉及石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用。
技术背景
[0002]随着全球人口老龄化趋势的加剧，以特定神经细胞和组织逐渐衰退乃至死亡为主要特征的神经系统疾病已经成为严重危害人类生命健康和生活质量的重大疾病，引起了国际生物医药领域的广泛和深入关注。神经系统疾病具有复杂的病理过程，大量研究表明其受氧化应激和蛋白质异常聚集等因素的影响。比如，当神经系统受到氧化胁迫时，其内源性活性氧自由基水平增加，将促使细胞内氧化还原代谢失衡，导致抗氧化酶活性降低并损伤脂质、蛋白质和DNA等生物大分子，引起细胞损伤和凋亡。此外，多种神经系统疾病相关的蛋白质异常聚集形成的产物也会诱发氧化、炎症等多种胁迫反应，由此导致神经元的慢性和持续性损伤、坏死而产生神经病变症状。因此，通过缓解氧化胁迫和抑制疾病蛋白质异常聚集是研究神经保护作用的重要策略。
[0003]我国具有丰富的中药材资源，为神经保护方面的防治研究提供了庞大的药用和保健资源库。石菖蒲为天南星科多年生草本植物石菖蒲的干燥根茎，性温味辛苦，归心胃经，具有开窍豁痰、化湿开胃、醒神益智、理气活血、散风祛湿等功效，是用于治疗癫病、痴呆及改善学习记忆的传统中药之一，具有显著的药用保健价值。现代研究表明，中药多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老和神经保护等广泛的药理活性和功能，在保健品领域具有巨大的开发和应用潜力。然而，目前对石菖蒲多糖活性功能的研究开发尚较少，缺乏其在神经系统疾病方面的相关研究。因此，积极开发具有神经保护作用的中药多糖将对神经系统疾病的治疗具有重大的意义，也将为多糖和中药产品的深入开发应用做出贡献。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品(也称为健康食品或功能食品)中的应用。
[0005]其中所述的神经保护作用是指对以氧化应激和蛋白质异常聚集为主要病理特征的神经系统疾病的防治作用。
[0006]本发明中所述的石菖蒲多糖可通过以下方法制备获得:以石菖蒲为原料，经含脱月旨、水提醇沉、离子交换和透析工序制备获得石菖蒲多糖，所获石菖蒲多糖具有神经保护作用，能制备具有神经保护作用的保健食品。
[0007]在石菖蒲多糖的制备过程中，各工序的具体参数如下:
[0008]脱脂时，采用乙醇为脱脂溶剂，石菖蒲和乙醇的质量体积比为l:2g/mL?l:20g/mL，温度为50?90°C，时间为I?IOh ;水提时，石菖蒲和水的质量体积比为l:2g/mL?l:20g/mL，提取温度为50?100°C，水提取时间为I?IOh ;醇沉时，采用乙醇沉淀提取液，乙醇和提取液的体积比为3:1?5:1。[0009]离子交换时，将醇沉物溶解后进行阴离子交换，依次采用水和洗脱液洗脱，洗脱液经透析后再通过浓缩和干燥处理，获得石菖蒲多糖。
[0010]所述的阴离子交换的材料优选为纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或树脂；透析袋的截留分子量为1.0?5.0kD。
[0011]阴离子交换时，洗脱液优选为醋酸盐、磷酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、钠盐、钾盐、铵盐或甘氨酸。
[0012]本发明所述石菖蒲首选其药用部位根或根茎。
[0013]本发明提供的石菖蒲多糖具有神经保护作用，主要表现在能够在哺乳动物细胞和整体动物水平上缓解由氧化应激和蛋白质的异常聚集引发的神经毒性，因此可用于防治与氧化应激和蛋白质异常聚集有关的神经系统疾病。
[0014]本发明具有如下优点:
[0015](I)本发明的制备方法周期短、试剂消耗少，工艺简单，稳定高效，适合工业化生产。
[0016](2)本发明制备的石菖蒲多糖在细胞和动物水平上对氧化应激和蛋白质异常聚集诱发的神经毒性均具有抑制作用，表明其可应用于具有神经保护功效的保健食品中，从而为中药现代化和多糖产品深入应用提供了新方向，也可为延缓衰老和防治神经系统疾病做出贡献。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]下面通过【具体实施方式】及药效学研究结果对本发明作进一步说明。
[0018]图1为实施例4中石菖蒲多糖抑制H2O2诱导神经细胞氧化毒性的数据表征图，表征0.5mg/mL和lmg/mL的石菖蒲多糖缓解H2O2对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的氧化毒性，其中*表示P〈0.05 ；
[0019]图2表示实施例5中石菖蒲多糖提高SH-SY5Y细胞内超氧化物歧化酶活性并降低脂质过氧化产物MDA积累的数据表征图，其中图2A表征lmg/mL石菖蒲多糖提高SH-SY5Y细胞内SOD的活性，图2B表征lmg/mL石菖蒲多糖降低MDA的含量，其中*表示p〈0.05 ；
[0020]图3表示实施例6中石菖蒲多糖抑制H2O2诱导SH-SY5Y细胞凋亡的数据表征图，表征石菖蒲多糖抑制H2O2诱导SH-SY5Y细胞的凋亡，其中*表示p〈0.05 ；
[0021]图4表示实施例7中石菖蒲多糖抑制转基因秀丽线虫CL2355体内β-淀粉样蛋白聚集神经毒性的数据表征图，表征lmg/mL和2mg/mL的石菖蒲多糖改善β_淀粉样蛋白聚集介导的CL2355秀丽线虫神经元趋化功能损伤，其中*表示ρ〈0.05。
【具体实施方式】
[0022]下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
[0023]实施例1
[0024]本实例提供的是一种石菖蒲多糖，其通过以下方法制备获得:将石菖蒲根茎粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加入乙醇，70°C加热搅拌回流3h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在95°C下加热搅拌提取3h，收集水提物。60°C减压浓缩，离心除去残留药渣和不溶性杂质，得到澄清的浓缩提取液。将4倍体积的乙醇加入上述提取液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集沉淀并经过真空冷冻干燥。将沉淀物溶于水后过DEAE-sepharose阴离子交换葡聚糖凝胶柱，依次采用水和1.0mol/LNaCl溶液洗脱，收集1.0mol/L NaCl溶液的洗脱液，采用3.5kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得石菖蒲多糖。
[0025]实施例2
[0026]本实例提供的是一种石菖蒲酸性多糖，其通过以下方法制备获得:将石菖蒲根茎粉碎后按照料液比1:20 (g/mL)加入乙醇，80°C加热搅拌回流3h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比1:10 (g/mL)加水，在100°C下加热搅拌提取3h，收集水提物。55°C减压浓缩，离心除去残留药渣和不溶性杂质，得到澄清的浓缩提取液。将4倍体积的乙醇加入上述提取液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集沉淀并经过真空冷冻干燥。将沉淀物溶于水后过DEAE-s印hadex A-25阴离子交换纤维素柱，依次采用水和2.0mol/L KCl溶液洗脱，收集2.0mol/L KCl溶液的洗脱液，采用3.5kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得石菖蒲多糖。
[0027]实施例3
[0028]本实例提供的是一种石菖蒲酸性多糖，其通过以下方法制备获得:将石菖蒲根茎粉碎后按照料液比1:5 (g/mL)加入乙醇，85°C加热搅拌回流3h，减压过滤除去溶剂，回收药材。按照料液比1:15 (g/mL)加水，在90°C下加热搅拌提取4h，收集水提物。50°C减压浓缩，离心除去残留药渣和不溶性杂质，得到澄清的浓缩提取液。将5倍体积的乙醇加入上述提取液中，混匀后于4°C下过夜静置沉淀，离心收集沉淀并经过真空冷冻干燥。将沉淀物溶于水后过D900型阴离子交换树脂，依次采用水和1.0mol/L氯化铵溶液洗脱，收集1.0mol/L氯化铵溶液的洗脱液，采用2.5kD透析袋进行透析，透析截流液经过减压浓缩和真空冷冻干燥即获得石菖蒲多糖。
[0029]实施例4
[0030]H2O2是一种氧化性很强的神经毒性物质，可诱导强烈急性的细胞氧化损伤，而抑制其对细胞的氧化损伤能够有效缓解神经毒性。将实施例1制得的石菖蒲多糖，按照0.25mg/mL、0.5mg/mL和lmg/mL浓度加入以100 μ mol/L H2O2造模的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中。对照组采用H2O2造模处理，但多糖溶液用细胞完全培养基代替。在37°C下孵育24h后，加入MTT溶液继续孵育4h。孵育结束后弃上清，加入DMSO后振摇15min，测定细胞在570nm处的吸光值。细胞存活率为多糖组吸收值与对照组吸光值的比值。细胞活力值以mean±SD表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0031]图1显示，H2O2在100 μ mol/L时能够显著降低细胞活力，而石菖蒲多糖在0.5mg/mL和lmg/mL浓度时均能够显著降低H2O2诱导的神经细胞毒性，表明其具有良好的体外抗氧化和神经保护作用。
[0032]实施例5
[0033]将实施例1中制得的石菖蒲多糖，按照lmg/mL浓度加入到以100 μ mol/L H2O2造模的SH-SY5Y细胞中，对照组仅采用H2O2造模处理。在37°C下孵育24h，收集细胞后裂解，取上清测定细胞内总蛋白量。取50mmol/L PBS(pH7.4)、130mmol/L甲硫氨酸溶液、0.75mmol/L NBT溶液、20 μ mol/L核黄素溶液和100 μ mol/L EDTA-Na2溶液各150 μ 1，混匀后加入0.75ml细胞裂解液，在80yE/(m2s)的光照强度下反应20min。对照组同上处理，用等体积的PBS代替细胞裂解液。空白组与对照组同样处理，但避光反应20min。反应结束后，在560nm处测定各组的吸光值。超氧化物歧化酶SOD活力计算公式如下:SOD活力(U/mgprotein) = [2 X (Acontrol - A
polysaccharide) I ^control ^-blank^ ]/Cp0 式^中，Ap0]_ySaccharide、Acontrol 和 Ablank
分别表示多糖组、对照组和空白组的吸光值，Cp表示蛋白质浓度。SOD活力以mean±SD表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0034]结果如图2A显示，100 μ mol/L H2O2能够显著降低细胞内SOD活性，而石菖蒲多糖在lmg/mL浓度时能够提高SOD活性。
[0035]将实施例1中制得的石菖蒲多糖，按照lmg/mL浓度加入到以100 μ mol/L H2O2造模的SH-SY5Y细胞中，对照组仅采用H2O2造模处理。在37°C下孵育24h后，收集细胞后裂解，取上清测定细胞内总蛋白量。取0.6ml 5%三氯乙酸溶液、0.4ml 0.67%TBA溶液和0.6mL细胞裂解液，混匀后置于100°C反应30min。反应结束后迅速置于冰上冷却，离心后取上清，在450nm、532nm和600nm处测定吸光值。脂质过氧化产物MDA含量计算公式为:MDA含量(nM/mg protein) = {[6.45X (A532 -A600)] - 0.56XA45J/Cp。式中，A450、A532 和 A600 分别表示各组在450nm、532nm和600nm处的吸光值,Cp表示蛋白质浓度。MDA含量以mean 土 SD表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0036]结果如图2B 显示，100 μ mol/L H2O2能够显著增加细胞内MDA含量，而lmg/mL石菖蒲多糖能够降低MDA含量。上述结果显示石菖蒲多糖能够改善由于氧化应激造成的细胞内抗氧化酶活性降低和脂质氧化损伤程度，进一步表明其具有良好的抗氧化和神经保护作用。
[0037]实施例6
[0038]大量研究表明，细胞凋亡是氧化胁迫、蛋白质聚集毒性损伤神经元的重要途径。例如，活性氧自由基可以激活细胞凋亡，进而破坏细胞组成并扰乱其正常生理功能，引起神经细胞损伤。反之，抑制细胞凋亡将有助于缓解氧化胁迫等损伤。将实施例2中制得的石菖蒲多糖，按照lmg/mL浓度加入到以lOOymol/L H2O2造模的SH-SY5Y细胞中，对照组仅采用H2O2造模处理。在371:下孵育2411后，收集细胞加入50(^1^ PBS悬浮细胞，加入5 μ LAnnexin V-FITC溶液混匀，再加入5 μ L碘化丙啶溶液，室温下避光反应约IOmin后于流式细胞仪上进行检测，激发波长和发射波长分别为488nm和530nm。凋亡率以mean±SD表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0039]采用Annexin V/PI双染法可以检测细胞凋亡状态，在Annexin V/PI双染的流式细胞散点图中，左上象限为细胞碎片(FITC-/PI+)，左下象限为正常细胞(FITC-/P1-)，右上象限为凋亡晚期和坏死细胞(FITC+/PI+)，右下象限为凋亡早期细胞(FITC+/P1-)。图3显示，100 μ mol/L H2O2能够显著诱导SH-SY5Y细胞凋亡，而lmg/mL石菖蒲多糖能够有效抑制细胞凋亡程度，表明其能够缓解H2O2对神经的氧化损伤，具有神经保护作用。
[0040]实施例7
[0041]转基因秀丽线虫CL2355是在神经元中表达Αβ42 ( β -淀粉样蛋白42片段，β -amyloid peptide42,A^ 42)蛋白，其聚集能够产生显著的神经毒性,可导致秀丽线虫对化学物质的趋化识别能力下降，因此可以通过抑制蛋白聚集来缓解其神经毒性。将实施例3制得的石菖蒲多糖，按照lmg/mL和2mg/mL浓度分别加入LI期CL2355秀丽线虫幼虫中，对照组加入等体积的S Medium,置于16°C培养36h后，于23°C再次培养36h。在9cm的培养平板中间用lmol/L甘油划直线,在一边半圆形区域加入1.5μ I 0.5%苯甲醒的乙醇溶液和1.5μ1 lmol/L NaN3溶液，标记为A区。在另一半圆区域的相同位置加入1.5 μ I乙醇和1.5μ1 lmol/L NaN3溶液，标记为B区。将CL2355秀丽线虫转到平板中央后于23°C孵育lh，然后分别统计A区和B区秀丽线虫的数量，趋化率=(A区数目-B区数目)/秀丽线虫总数。数据以mean±SD表示，采用T检验比较多糖组和对照组的差异性。
[0042]图4显示，石菖蒲多糖在lmg/mL和2mg/mL浓度时均能够提高转基因秀丽线虫CL2355的趋化率，说明石菖蒲多糖能够通过抑制疾病蛋白质异常聚集来有效的改善神经元功能，从而发挥神经保护作用。
[0043]经上述哺乳动物细胞和秀丽线虫疾病模型试验证实，石菖蒲多糖能够显著缓解过氧化氢对神经细胞的氧化胁迫毒性(见实施例4)，增强抗氧化酶活性并降低脂质过氧化产物含量(见实施例5)，抑制神经细胞凋亡(见实施例6)，还能够抑制β -淀粉样蛋白的神经毒性(见实施例7)，表明其具有良好的神经保护作用。
[0044]实施例8
[0045]将实施例1制得的石菖蒲多糖，根据需要添加适量乳清蛋白、麦芽糊精制备成为具有神经保护功效的粉末状态健康食品或保健食品，还可以添加其它常规辅料制成常规剂型。
[0046]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
【权利要求】
1.石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用。
2.根据权利要求1所述的石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用，其特征是:所述的神经保护作用是指对以氧化应激和蛋白质异常聚集为主要病理特征的神经系统疾病的防治作用。
3.根据权利要求1所述的石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用，其特征是:所述的石菖蒲多糖通过以下方法制备获得:以石菖蒲为原料，经含脱脂、水提醇沉、离子交换和透析工序制备获得，所述石菖蒲多糖具有神经保护作用，能制备具有神经保护作用的保健食品。
4.根据权利要求3所述的石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用，其特征是:脱脂时，采用乙醇为脱脂溶剂，石菖蒲和乙醇的质量体积比为l:2g/mL?l:20g/mL，温度为50?90°C，时间为I?IOh ;水提时，石菖蒲和水的质量体积比为l:2g/mL?l:20g/mL，提取温度为50?100°C，水提取时间为I?IOh ;醇沉时，采用乙醇沉淀提取液，乙醇和提取液的体积比为3:1?5:1。
5.根据权利要求3所述的石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用，其特征是:离子交换时，将醇沉物溶解后进行阴离子交换，依次采用水和洗脱液洗脱，洗脱液经透析袋透析后再通过浓缩和干燥处理，即获得石菖蒲多糖。
6.根据权利要求5所述的石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用，其特征是:所述阴离子交换的材料为纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶或树脂。
7.根据权利要求5所述的石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用，其特征是:洗脱液为醋酸盐、磷酸盐、巴比妥酸盐、柠檬酸盐、钠盐、钾盐、铵盐或甘氨酸。
8.根据权利要求5所述的石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用，其特征是:透析袋的截留分子量为1.0?5.0kD。
9.根据权利要求3所述的石菖蒲多糖在制备具有神经保护作用的保健食品中的应用，其特征是:所述石菖蒲是指石菖蒲的药用部位根或根茎。
【文档编号】C08B37/00GK103609936SQ201310574725
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】马方励, 李海峰, 胡明华, 梁明, 马忠华, 汪强强, 张婉婉 申请人:无限极（中国）有限公司