以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法。以亲水性多孔微球为层析基质，采用烯丙基溴活化，偶联氨基苯并咪唑，得到以氨基苯并咪唑为功能配基的介质。层析基质中依次加入二甲基亚砜和烯丙基溴进行活化；活化的层析基质和N-溴代丁二酰亚胺反应，进行溴代醇化；将溴代醇化后的层析基质与氨基苯并咪唑溶液混合，偶联氨基苯并咪唑配基；最后采用乙醇胺水溶液对未反应的溴代醇化末端进行封闭，得到以氨基苯并咪唑为功能基团的疏水性电荷诱导层析介质。本发明的新型层析介质制备过程简便，抗体吸附容量高，具有非盐依赖吸附的特性，通过改变溶液pH至弱酸性即可实现解吸和回收，可以用于疏水性电荷诱导层析分离抗体。
【专利说明】以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法，属于生物 化工领域中的蛋白层析分离技术。
【背景技术】
[0002] 抗体能与相应抗原特异性结合，产生各种免疫效应。随着生物技术的迅猛发展和 抗体工程技术不断突破，单克隆抗体、多克隆抗体以及基因工程抗体已经广泛应用于生物 学和医学领域。抗体用途主要包括疾病治疗、体外诊断和检测、肿瘤定位显像以及作为亲和 配基用于分离纯化等。
[0003] 抗体产品往往纯度要求较高，同时还必须保持生物活性，因此传统的分离过程往 往难以满足要求。蛋白A或蛋白G亲和层析介质能够特异性结合抗体，但蛋白类亲和配基 易被料液中蛋白酶降解脱落，污染产品，且重复使用次数低，介质价格昂贵，操作成本极高， 限制了其大规模应用。而传统的离子交换层析和疏水相互作用层析等方法虽然能够结合抗 体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，纯化效果有限。因此，开发具有抗体选择性的非 蛋白类配基成为研究热点。
[0004] 目前报道的针对抗体分离的非蛋白配基较多，有仿生亲和配基Ligand 22/8 (J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 2000,740:1)、多肤配基TG19318(J. Mol. Recognit. 1998，11: 128)、D2AAG(J. Chromatogr. A 2012,1225 :158)和服1?群（了.〇11'〇11^仂81·· A 2009,1216 :910)等。这些配基往往过于关注特异性和亲和力，而造成抗体洗脱条件较 为苛刻或者收率较低。Burton和Harding提出疏水电荷诱导层析（Hydrophobic charge induction chromatography, HCIC)，通过疏水作用力吸附蛋白，采用调节溶液pH使得蛋 白和配基产生静电排斥来协助洗脱C/ X，1998，814: 71)。Boschetti等 (^/(〇s6?Aaraiio/72000, 9:211)提出了利用含巯基杂环化合物为配基吸附抗体，结合静电 排斥协助洗脱，专利（US Patent 5, 652, 348)描述了相关介质及其制备方法。中国专利 (CN101279243 ;CN101279244 ;CN101284224)也报道了在HCIC介质空间臂中引入砜基，提高 介质对抗体的选择性。这些介质主要采用含巯基的杂环化合物为配基，通过配基的巯基位 点与基质偶联，偶联效率较低，且洗脱时只能借助杂环上的质子化氮原子与蛋白间的排斥 力进行洗脱，静电排斥力有限，完全洗脱的pH较低，易造成抗体活性的损失。因此，开发性 能更优良的HCIC介质，对于抗体的大规模分离纯化有着重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质及其制备方法。
[0006] 以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质包括层析基质和配基，所述的层析基质为 带有羟基的亲水性多孔微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的氨基苯并咪唑，所述的氨基 苯并咪唑为2-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑或5-氨基苯并咪唑。
[0007] 当氨基苯并咪唑为2-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：
【权利要求】
1. 一种以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质，其特征在于包括层析基质和配基，所 述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，配基为经烯丙基溴活化后偶联的氨基苯并咪 唑，所述的氨基苯并咪唑为2-氨基苯并咪唑、4-氨基苯并咪唑或5-氨基苯并咪唑， 当氨基苯并咪唑为2-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：
当氨基苯并咪唑为4-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：
当氨基苯并咪唑为5-氨基苯并咪唑时，层析介质的结构组成为：
2. 根据权利要求1所述的以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质，其特征在于所述的 层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性微球。
3. 根据权利要求1或2所述的以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质，其特征在于所 述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。
4. 根据权利要求1所述的以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质，其特征在于所述的 层析介质的配基密度为40-150 μ mol/ml。
5. -种如权利要求1所述的以氨基苯并咪唑为功能配基的层析介质的制备方法，其特 征在于包括如下步骤： 1) 将层析基质抽干后，加入0. 2-1倍层析基质质量的20% (v/v)二甲基亚砜、0. 1-1倍 层析基质质量的烯丙基溴和〇. 1-0. 5倍层析基质质量的氢氧化钠，25°C下150rpm摇床中活 化8-48小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化层析基质； 2) 将活化层析基质和0. 1-0. 5倍层析基质质量的N-溴代丁二酰亚胺混合进行溴代醇 化，25°C下150rpm摇床中反应1-5小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到溴代醇化的基质； 3) 将溴代醇化的基质和0. 1-0. 3倍层析基质质量的氨基苯并咪唑以及0. 5-1M碳酸钠 缓冲液混合，碳酸钠缓冲液的pH为10-12, 25°C下150rpm摇床中反应8-24小时，得到氨基 苯并咪唑偶联后的介质； 4)将氨基苯并咪唑偶联后的介质抽滤，去离子水洗涤，加入到含有1-5倍层析基质质 量的乙醇胺中，25°C下150rpm摇床中反应2-8小时，去离子水洗涤，得到以氨基苯并咪唑为 功能配基的疏水性电荷诱导层析介质。
【文档编号】C08B15/06GK104096544SQ201410199994
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】林东强, 童红飞, 姚善泾 申请人:浙江大学