一种以二元羧酸-n-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，其特点是将牛皮胶原海绵用pH为7.4的磷酸盐缓冲液在冰浴下搅拌溶解，得到4-6mg/mL的胶原溶液。再将二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯按其活性酯基的摩尔数与胶原溶液中自由氨基的摩尔数之比为1-2∶1混合，在冰浴中搅拌1-3min，然后将胶原混合溶液置于温度37℃的水浴锅中恒温4～8h，使胶原自聚集成纤维，得到以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶。本发明制备得到的胶原凝胶产品用于药物缓释。
【专利说明】一种以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原 凝胶的方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方 法，属于蛋白质的资源化利用领域。 【背景技术】
[0002] 胶原是细胞外基质的主要成分，主要给细胞提供抗张力和弹性，在细胞的迁移和 发育中起着重要的作用。胶原具有独特的三股螺旋结构，赋予了其优异的生物学性能，如低 免疫原性、良好的生物相容性、细胞再生性和可降解性，因此被广泛的应用于生物医学材料 领域。
[0003] 在生理条件下，胶原溶液中分子间的相互作用可以使其自聚集成胶原纤维，自聚 集的胶原纤维之间会形成网络结构并将溶液中的溶剂束缚在其内部使其不能自由移动，从 而形成胶原凝胶，它被广泛的应用于药物缓释领域。然而，胶原本身自聚集成胶原纤维而形 成的凝胶的稳定性还不够，一般在胶原凝胶中引入交联剂使其进一步固定。在动物体内胶 原纤维的共价交联由赖氨酰氧化酶催化完成的,它能将赖氨酸和羟赖氨酸的ε -氨基氧化 成醛基，醛基之间或醛基与周围的氨基之间发生反应形成交联键。我们运用这种仿生 的方法，在胶原中加入交联剂进一步固定胶原纤维，提高胶原凝胶的性能。
[0004] 戊二醛和碳化二亚胺（EDC)是目前应用最为广泛的胶原凝胶的交联剂。Shell等 人的研究表明在胶原凝胶中加入〇. 2%的戊二醛，可以使凝胶的弹性模量从4320Pa大幅度 增大到7230Pa，但用交联后的胶原凝胶培养细胞时会抑制细胞的繁殖。（Sheu Μ T，Huang J C，Yeh G C，et al. Characterization of collagen gel solutions and collagen matrices for cell culture.Biomaterials，2001，22(13):1713_1719·)所以说，给胶原凝 胶中引入戊二醛会增加其细胞毒性，这在很多文献中都被证实。Hideki Mori等人以125mM 的EDC为交联剂，胶原成纤维和交联同时进行，将胶原凝胶的弹性模量由44. IPa提高到 798Pa〇 (Η· Mori，Κ·Shimizu，Μ· Hara. Dynamic viscoelastic properties of collagen gels in the presence and absence of collagen fibrils. Materials Science and Engineering C，2012, 32 :2007-2016.)这种交联剂有着较低的细胞毒性，但是，这种交联 剂没有成为交联键的一部分，交联是"零长度交联"，用量较大（若达到相同的交联度，其 用量是含有六个碳原子交联剂用量的近百倍）。（Grabarek Z.Gergely J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry, 1 990, 185(1):131-135.)
[0005] 羧酸-N-轻基琥拍酰亚胺酯是一类新型低毒的蛋白质类交联剂。Hirofumi Saito 等人制备出了柠檬酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯（CAD)和苹果酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯（MAD)。 该交联剂有较高的反应活性和良好的生物相容性。但用这种交联剂制备得到的胶原凝胶， 与未加交联剂的胶原凝胶相比其弹性模量没有提高，CAD交联甚至会降低胶原凝胶的弹性 模量° (H. Saito, T. Taguchi. et al. pH-responsive swelling behavior of collagen gels prepared by novel crosslinkers based on naturally derived di_or tricarboxylic acids. Acta Biomaterialia, 2007, 3:89 - 94.)这种胶原凝胶不稳定，容易破碎，不利于药 物缓释领域中的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有胶原凝胶性能的不足而提供了一种以二元羧酸-N-羟 基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，其特点是用二元羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)、二环己基碳二亚胺（DCC)合成了一种天然、无毒的交联剂，并将该交联剂用于胶原 凝胶的改性，制备热稳定、吸水性、机械性能更好的胶原凝胶，用于药物缓释领域。
[0007] 本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为摩尔 份数。
[0008] 以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法包括以下步骤：
[0009] 1)胶原溶液的制备
[0010] 将牛皮胶原海绵用pH为7. 4的磷酸盐缓冲液，在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为 4-6mg/mL的胶原溶液；
[0011] 2)胶原凝胶的制备
[0012] 将二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯按其活性酯基的摩尔数与胶原溶液中自由氨 基的摩尔数之比为1-2 : 1混合，在冰浴中搅拌l_3min，再将胶原混合溶液置于温度37°C 的水浴锅中恒温4?8h，使胶原自聚集成纤维，得到基于二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯交 联的胶原凝胶。
[0013] 所述二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备：
[0014] 将二元羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺按照物质的量比为 0.5-1 : 1-2 : 1-2混合，按每1份N-羟基琥珀酰亚胺加入35?70份丙酮溶解配制成溶 液；并在常温下反应12-24h，过滤，收集沉淀，沉淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶，真空 干燥得到二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
[0015] 二元羧酸为丙二酸、己二酸或癸二酸中的任一种。
[0016] 以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法制备得到以二 元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶。
[0017] 以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶用于药物缓释。
[0018] 性能测试
[0019] 1、.热稳定性测试
[〇〇2〇] 将l〇mg胶原凝胶封存于铝坩埚中，并以10mg的磷酸盐缓冲液为参比，在氮气保护 下，以5°C/min的升温速率从30?80°C扫描样品，并记录样品的差热分析（DSC)曲线，吸 热曲线的峰值作为胶原凝胶的热变性温度。结果详见图1所示。结果表明，联剂交联后的 胶原凝胶的热稳定性较未交联的胶原凝胶有很大改善，为45. 97°C?54. 47°C。
[0021] 2.、含水量测试
[0022] 先将胶原凝胶在室温下置于50mL去离子水中，浸泡3天，每天换液两次，让其充分 吸水。接着用滤纸轻轻擦拭凝胶表面，除去吸附在其表面的水，再称量凝胶的重量，记为凝 胶的湿重。最后将凝胶冷冻干燥后称重，记为凝胶的干重。按照公式：
[0023] 含水量（％ )=(凝胶的湿重-凝胶的干重）/凝胶的干重X100%
[0024] 结果详见表1所示。结果表明，胶原凝胶的含水量为18000 %?28000%，胶原凝 胶具有优良的吸水性，使用以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂也不会降低胶原凝 胶的含水量，仍具有优良的吸水性。
[0025] 3、·动态粘弹性测试
[0026] 将胶原凝胶置于Gemini200型流变仪平行板夹具中（直径为40mm，板间距为 2000mm)，对其应力应变扫描后，在线性粘弹性区域内选择应变大小为2%，并设定温度为 20°C，再测定不同胶原凝胶的动态粘弹性随频率（0. 01?10Hz)的变化曲线。结果详见表2 所示。结果表明，胶原凝胶的弹性特征远远大于粘性特征，主要表现为弹性凝胶，不易破碎， 在1Hz时，弹性模量在150. 98Pa?398. 27Pa。
[0027] 本发明具有如下优点：
[0028] 1、本发明制备的二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯作为交联剂有着良好的生物相 容性和反应活性，且毒性低。
[0029] 2、本发明是以丙二酸、己二酸和癸二酸为原料制备不同碳链长度的二元羧 酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯作为胶原凝胶的交联剂，将二元羧酸作为交联键的一部分留在胶 原纤维内部，将两个或两个以上的胶原分子用羧酸的碳骨架连接起来，从而提高胶原凝胶 的稳定性。与"零长度交联"的碳化二亚胺（EDC)相比，达到相同交联度的用量要低很多。
[0030] 3、本发明的胶原凝胶是在生理条件下制备出来的，制备出的胶原凝胶除具有优良 的低免疫原型、生物相容性，可降解性，还具有优良的吸水性、热稳定性及弹性特征，用于组 织工程和药物缓释等领域。 【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为DSC曲线图 【具体实施方式】
[0032] 下面通过实施例对本发明做具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本 发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员，可以 根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
[0033] 实施例1 :
[0034] 将牛皮胶原海绵用pH为7. 4的磷酸盐缓冲液在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为 5mg/mL的胶原溶液；将己二酸、NHS、DCC按照物质的量比为0. 5 : 1 : 1. 1混合，按每1份 N-羟基琥珀酰亚胺加入50份丙酮溶解配制成溶液，在常温下搅拌反应20h，过滤，收集沉 淀，沉淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶，真空干燥得到己二酸-N-琥珀酰亚胺酯。将己二 酸-N-琥珀酰亚胺酯酯溶解在二甲基亚砜中，按照[NHS-己二酸]/[NH 2]比例为1.5 : 1 滴加到胶原溶液中，在冰浴中搅拌lmin后，将胶原混合溶液置于温度37°C的水浴锅中恒温 6h，使胶原自聚集成纤维，得到胶原凝胶。得到的胶原凝胶的热稳定性为49. 97°C，含水量为 24000 %，弹性特征远大于粘性特征，在1Hz时弹性模量为288. 82Pa。
[0035] 实施例2 :
[0036] 将牛皮胶原海绵用pH为7. 4的磷酸盐缓冲液在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为 4mg/mL的胶原溶液；将癸二酸、NHS、DCC按照物质的量比为0. 5 : 2 : 2混合，按每1份N-羟 基琥珀酰亚胺加入35份丙酮溶解配制成溶液，在常温下搅拌反应12h，过滤，收集沉淀，沉 淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶，真空干燥得到癸二酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。将癸二 酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在二甲基亚砜中，按照[NHS-癸二酸]/[NH 2]比例为2 : 1滴 加到胶原溶液中，在冰浴中搅拌1. 5min后，将胶原混合溶液置于温度37°C的水浴锅中恒温 4h，使胶原自聚集成纤维，得到胶原凝胶。得到的胶原凝胶的热稳定性为54. 47°C，含水量为 28000 %，弹性特征远大于粘性特征，在1Hz时在弹性模量为398. 27Pa。
[0037] 实施例3 :
[0038] 将牛皮胶原海绵用pH为7. 4的磷酸盐缓冲液在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为 6mg/mL的胶原溶液；将丙二酸、NHS、DCC按照物质的量比为1 : 1. 1 : 1.2混合，按每1份 N-羟基琥珀酰亚胺加入70份丙酮溶解成溶液，在常温下搅拌反应24h，过滤，收集沉淀，沉 淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶，真空干燥得到丙二酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。将丙二 酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在二甲基亚砜中，按照[NHS-丙二酸]/ [NH2]比例为1:1滴加 到胶原溶液中，在冰浴中搅拌3min后，将胶原混合溶液置于温度37°C的水浴锅中恒温8h， 使胶原自聚集成纤维，得到胶原凝胶。得到的胶原凝胶的热稳定性为45. 97°C，含水量为 18000%，弹性特征远大于粘性特征，在1Hz时弹性模量为150. 98Pa。
[0039] 应用实例：
[〇〇4〇] 将实施例1制备的胶原凝胶应用于四环素的药物缓释。先制得四环素溶液的标准 曲线。将胶原凝胶浸泡于含有四环素的pH为7. 4的磷酸盐缓冲液中，其中四环素在缓冲液 中的质量分数为40%，静置48h，得到含有四环素的胶原凝胶，并检测浸泡胶原凝胶前后缓 冲液的吸光值，测定四环素的载药量。称取5mg的胶原凝胶置于透析袋中，随后将透析袋放 入装有50mL的pH为7. 4的磷酸盐缓冲液的离心管中，于温度37°C水浴中振摇，开始每隔半 小时，5h后每隔lh取lmL缓冲液测定四环素的含量，同时加入lmL缓冲液于离心管中。测 得四环素的载药量为35%，四环素的最终释放量为59. 3%。
[0041] 表1为水含量测试结果
[0042]
【权利要求】
1. 一种以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，其特征是该 方法包括以下步骤： 1) 胶原溶液的制备 将牛皮胶原海绵用pH为7. 4的磷酸盐缓冲液，在冰浴下搅拌溶解，配制成浓度为 4-6mg/mL的胶原溶液； 2) 胶原凝胶的制备 将二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯按其活性酯基的摩尔数与胶原溶液中自由氨基的 摩尔数之比为1-2 : 1混合，在冰浴中搅拌l_3min，再将胶原混合溶液置于温度37°C的水 浴锅中恒温4?8h，使胶原自聚集成纤维，得到基于二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯交联的 胶原凝胶。
2. 如权利要求1所述以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方 法，其特征在于二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备： 将二元羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺按照物质的量比为 0.5-1 : 1-2 : 1-2混合，按每1份N-羟基琥珀酰亚胺加入35?70份丙酮溶解配制成溶 液；并在常温下反应12-24h，过滤，收集沉淀，沉淀用二甲亚砜溶解，过滤，滤液结晶，真空 干燥得到二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
3. 如权利要求1或2所述以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的 方法，其特征在于二元羧酸为丙二酸、己二酸或癸二酸中的任一种。
4. 如权利要求1?3之一所述以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝 胶的方法制备得到以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶。
5. 如权利要求3所述以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备的胶原凝胶用于 药物缓释。
【文档编号】C08H1/00GK104109253SQ201410341143
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】李国英, 解朵, 刘文涛 申请人:四川大学