唾液端粒检测技术的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种新的端粒检测技术--唾液端粒检测技术及其配套的唾液采集试剂盒。
【背景技术】
[0002]目前常用的端粒长度检测技术主要有端粒限制性片段法、流式原位杂交法和定量PCR法，但每种方法都有严重的局限性，严重制约了端粒相关研究的开展。端粒限制性片段法(TRF)是目前科研实验室最为流行的检测端粒平均长度的金标准。TRF是端粒检测的金标准，它技术重复性高、变异系数在2%以下。但是这种技术消耗大量的人力、价格昂贵，不适合于大规模的研究或者是常规个人端粒检测。最重要的是，它不适于检测非常短的端粒。另一个应用最为广泛的方法是MMQPCR，这种方法操作相对简单价格廉价，但是也有一些局限性，如:动态范围窄，PCR检测效率在预测范围外，检测重复性较差。因此，寻找一种较TRF法简单廉价、较MMQPCR重复性更好的技术将极大地促进端粒检测领域的发展。与现有的血液端粒检测技术相比，我们发明的唾液端粒检测试剂盒，无论在样本的采集，还是在技术的重复性、特异性和检测结果方面都具有明显的优势。我们的技术还经过特殊的改进，无需进行样本DNA纯化可直接检测；在分析结果方面，已有端粒技术提供的是端粒长度平均值，而不是与最短端粒值，我们提供两种级别的测试:一个是提供平均端粒长度的测试，另一个是提供端粒长度分布，专用于最短的端粒检测。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是:克服上述端粒检测技术的缺陷和血液采集给患者带来的不适感和感染的风险，提供一种新的操作简单，重复性好，能检测最短端粒长度和端粒长度分布的新技术。此外，我们还发明了与这种技术相配套的端粒采集试剂盒。
[0004]为了实现上述目的，本发明包括两项内容:唾液端粒检测技术和配套的唾液采集试剂盒。我们发明的唾液端粒检测技术是基于qPCR技术，计算某一个qPCR体系中端粒信号与某单拷贝基因信号的比值(T/S)，T/S值反映端粒的长度分值，将比值与参考标准值进行对比即可获得所测端粒的绝对长度。
[0005]进一步的，与传统PCR技术相比，我们的技术采用两个相邻寡核苷酸与三元复合物中的同一条链结合，减少引物二聚体和错配现象。传统PCR通常采用两个寡核苷酸引物退火到目标扩增子的反义互补链，每个引物都允许聚合酶向另一个引物的方向延伸，对于重复DNA序列(如端粒重复序列)来说，PCR将面临一种大的挑战，因为与重复序列反向链互补的引物将会互相结合，形成二聚体。MMQPCR通过设计多种、均匀间隔的与端粒重复序列不配对的引物解决这个难题。但是，MMQPCR的这一设计需要初始、低温的退火循环，对照引物可能发生错配现象。
[0006]进一步的，我们发明的QPCR方法可避免发生低温退火以及其它MMQPCR相关的问题。我们采用相邻的DNA寡核苷酸与端粒重复序列三元复合物中的同一条链结合。上游的寡核苷酸势必与紧邻它的另一个结合，使得聚合酶利用另一个寡核苷酸作为模板，沿着3’段延伸。聚合延伸产生的扩增子包括一个中央端粒序列和每端的合成设计序列，这作为标准的PCR扩增的引物位点。我们将这种方法叫做APQPCR。类似于标准的PCR，这种相邻的杂交保证了高水平的特异性。目前，这种方法还没文献进行报道。
[0007]进一步的，我们发明的唾液采集试剂盒操作简单、里面添加的防腐剂允许常温下样本的长时间运输，防腐剂成分之一 SDS还可以抑制DNA的降解，有利于获得高质量的DNA样本。我们计划整合我们的唾液端粒检测技术与唾液收集试剂盒为商业化的唾液端粒检测试剂盒，出售给科研人员和医院等客户。
[0008]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明新颖、快捷、无创、操作简单、精确度高、成本低，完全修正了一般通用技术的上述弊端，从根本上考虑科研和临床的特殊需求，无需纯化DNA，从实验重复性和特异性方面解决一般通用技术所面临的问题。
【附图说明】
[0009]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】加以详述:
[0010]图1本发明的技术原理示意图:
[0011]图2本发明采用的相邻引物端粒扩增子示意图；
[0012]图3本发明技术的端粒扩增子示意图，其中F表示:正向引物，T表示:端粒序列，BI表示:桥接1，B2表示:桥接2，R表示:反向引物；
[0013]图4本发明技术采用水解探针进DNA反应端粒扩增子示意图，其中人基因组进行10倍系列稀释后，采用水解探针进行的4个标准DNA反应端粒扩增子Y=-3.337*Log(X)+25.20，R2 = 0.997，Efficiency = 99.4% ；
[0014]图5本发明的检测服务流程示意图。
【具体实施方式】
[0014]现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的技术原理，因此其仅显示与本发明有关的构成。
[0015]如图1所示的本发明的技术原理，本发明是基于qPCR技术，计算某一个qPCR体系中端粒信号与某单拷贝基因信号的比值(T/S)，T/S值反映端粒的长度分值，将比值与参考标准值进行对比即可获得所测端粒的绝对长度。
[0016]在本实施例中，为了避免传统PCR实验时引物二聚体的产生，我们采用相邻DNA寡核苷酸与三元复合物同一条链结合，促进一个寡核苷酸聚合酶延伸，而另一个作为模板。延伸后产生的一个扩增子由中央端粒序列和末端合成序列构成。
[0017]在本实施例中，我们的技术在发展早期阶段不需要低温退火，因此可避免常规PCR初始循环低温退火导致的配对错误。
[0018]在本实施例中，我们还设计并测试了一种新型水解探针，这种探针可桥接寡核苷酸连接处。这种桥接探针设计保证只有全扩增子可被水解探针检测到。目前结果显示，这种方法比小于2个数量级MMQPCR方法要好的多。
[0019]本发明样本收集方便，无侵入性，随时随地，不局限于门诊；收集的唾液样品无需冷藏便能稳定存储和运送，客户在短时间内获取自己的端粒检测结果。
[0020]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用说明书及附图内容所作的等效结构，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1.唾液端粒检测技术，其特征在于，包括唾液端粒检测技术和配套的唾液采集试剂盒，所述的唾液端粒检测技术是在qPCR的基础上，做了多处特殊的改进，用于检测患者唾液端粒信息，监测患者身体健康情况及评估端粒相关衰老疾病的治疗效果和愈后；所述唾液采集试剂盒用于收集患者的唾液，便于短期储存运输，里面添加的防腐剂成分保证唾液DNA不发生降解，得到高质量的DNA样本，用于后续的唾液端粒分析。2.根据权利I要求所述的唾液端粒检测技术，其特征在于:所述唾液端粒检测技术包括基于qPCR改进的相邻寡核苷酸qPCR技术。3.根据权利2要求所述的唾液端粒检测技术，其特征在于:采用相邻DNA寡核苷酸与三元复合物同一条链结合，促进一个寡核苷酸聚合酶延伸，而另一个作为模板。延伸后产生的一个扩增子由中央端粒序列和末端合成序列构成。4.根据权利2要求所述的唾液端粒检测技术，其特征在于:我们的技术在发展早期阶段不需要低温退火，因此可避免常规PCR初始循环低温退火导致的配对错误。5.根据权利2要求所述的唾液端粒检测技术，其特征在于:我们设计并测试了一种新型水解探针，这种探针可桥接寡核苷酸连接处。这种桥接探针设计保证只有全扩增子可被水解探针检测到。
【专利摘要】本发明是“唾液端粒检测技术”，本发明是基于qPCR技术，计算某一个qPCR体系中端粒信号与某单拷贝基因信号的比值(T/S)，T/S值反映端粒的长度分值，将比值与参考标准值进行对比即可获得所测端粒的绝对长度。与传统PCR技术相比，我们采用两个相邻寡核苷酸与三元复合物中的同一条链结合，减少引物二聚体和错配现象。与已有的端粒检测技术相比，本技术具有简便、快捷的优势，并能获得准确、可重复的实验结果。通过我们的发明来检测端粒的长度，可准确的分析判断出人体的健康状况、患病情况。目前国内尚无这项技术，完全依靠进口。因此，本发明是一种新颖、快捷、无创伤、先进的检测技术，有着良好的发展前景和巨大的市场空间。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105713958
【申请号】CN201410614022
【发明人】王正东
【申请人】四川澜博生物科技有限公司