一种从次等紫菜中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖的方法
【专利摘要】本发明提供了一种从次等紫菜中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，从新鲜次等紫菜中先提取藻红蛋白，再从提取了藻红蛋白的残渣中提取紫菜硫酸多糖，一次提取过程中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖。本发明可在一次提取中获得藻红蛋白和紫菜硫酸多糖，得到的藻红蛋白纯度高，紫菜硫酸多糖均一性好。本发明操作简便，工艺简单，分离速度快，成本低，提高了次等紫菜的利用效率，实现了资源的重复使用和多次利用。
【专利说明】-种从次等紫菜中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖的方 法
【技术领域】
[0001] 本发明藻类功能物质的提取与分离，具体涉及一种从紫菜中同时提取藻红蛋白和 紫菜硫酸多糖的方法。
【背景技术】
[0002] 紫菜是一类具有重要经济价值的大型海藻，目前有几个种广泛栽培于东南亚沿海 各国。据统计，2006年紫菜年产量约1. 8 X 104吨干品，年产值估计约13亿美元（FA0, 2006)。 我国紫菜产业发展迅速，从分布区域来看，长江W南W坛紫菜为主，主要集中在福建省和广 东省；长江W北W条斑紫菜为主，主要集中在江苏省和山东省。其中江苏省全省紫菜栽培 面积约33万亩，从业人员8万左右，在南通、盐城和连云港海区形成了我国条斑紫菜的主产 区，年产量40亿枚标准制品，行业总产值20亿元左右。生产的紫菜在当地一次和二次加工 后形成产品，销往世界各地，成为我国出口创汇的重要组成部分。
[0003] 在条斑紫菜生产中，次等紫菜因胶含量高、蛋白含量低的原因，导致一次加工产品 质量偏低，二次加工产品口感不好，因而价格偏低，进而影响企业经济效益。该些次等紫菜 常常和加工过程中产生的废弃紫菜一起作为垃圾处理，不仅浪费了资源，又增加了环境负 担。因此，该些次等紫菜的高值化加工及其高附加值物质的提取已经成为紫菜产业可持续 发展的关键。
[0004] 藻胆蛋白是一种水溶性色素蛋白，具有独特的吸收光谱和英光发射光谱，它的存 在补充了叶绿素的光吸收范围，拓宽了藻类对可见光的吸收，更有利于对水生环境的适应。 条斑紫菜藻红蛋白为I型R-藻红蛋白，由于其独特的光谱特性、稳定性W及较高的吸收系 数和量子产额，藻胆蛋白可被用作生化研究的英光探针而运用于细胞和生物大分子的标 记，也可被用作肿瘤治疗的光敏剂，甚至有报道称其具有免疫调节的作用。此外，藻胆蛋白 还可作为天然色素用于食品、化妆品的添加，避免了化学合成色素可能带来的毒性危害。
[0005] 紫菜多糖是其细胞主要组分之一，具有抗凝血、降血脂、抗衰老及免疫调节等作 用。有报道显示紫菜多糖能够通过降低小鼠MDA水平，直接清除体内自由基而提高其抗氧 化能力。因而紫菜多糖是一种比较理想的可被开发成抗衰老食品和药品的重要组分。多糖 分子中存在大量轻基或駿基等极性基团，可W与水分子形成氨键，表现出良好的吸湿和保 湿性能，所W在医药、化妆品、农业等方面也具有广阔的应用前景。从条斑紫菜中可分离到 具有激活巨瞻细胞、增强免疫功能的多糖组分。
[0006] 人们于是想到利用紫菜同时提取藻胆蛋白和紫菜多糖，为此做了大量研究。
[0007] 肖海芳等探索了脉冲超声波同时提取紫菜中蛋白和多糖的工艺（脉冲超声波同 时提取紫菜中蛋白和多糖的工艺研究，食品科学，2007, Vol. 28, No. 06)，朱晓君等探索了用 超声方式同时提取紫菜多糖和藻胆蛋白的工艺（超声辅助同时提取条斑紫菜多糖及藻胆 蛋白工艺的优化，食品科学，2008, Vol. 29, No. 05)。中国专利CN200810018871. 0公开了一 种条斑紫菜多糖和蛋白同步超声波辅助提取方法。但该些提取工艺都是利用紫菜干粉，得 到的藻胆蛋白光谱活性很低，且多糖在提取过程中不可避免地会受到蛋白等其他分子的污 染，成分复杂。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种同时从次等紫菜中提取藻红蛋白及紫菜硫酸多糖的 方法，得到的藻红蛋白纯度高、多糖受污染小，提取工艺简单，提高次等紫菜资源利用率，提 高紫菜产业的经济效益。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0010] 一种从次等紫菜中同时分离提取藻红蛋白和硫酸多糖的方法，从新鲜次等紫菜中 先提取藻红蛋白，再从提取了藻红蛋白的残渣中提取紫菜硫酸多糖，一次提取过程中同时 提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖。
[0011] 其中，具体步骤如下：
[001引 A.藻红蛋白提取
[0013] (1)将新鲜次等紫菜切碎，放入1 %磯酸盐缓冲液使其细胞溶胀破裂；
[0014] 似离也，收集上清液，得到藻红蛋白粗提液，加入固体硫酸馈至终浓度为0. 5M ;
[0015] (3)将藻红蛋白粗提液粟入化en^-s巧harose柱，清洗去除杂蛋白；
[0016] (4)依次用硫酸馈溶液、蒸觸水从化enyl-Sepharose柱洗脱藻红蛋白；
[0017] (5)将步骤（4)中所得的洗脱液分别加入DEAE-Se地arose离子交换柱，先依次用 50mM、lOOmM磯酸盐缓冲液、lOmM醋酸轴、4mM醋酸洗柱，然后用含化C1的磯酸盐缓冲液洗 脱，即得纯化的藻红蛋白；
[0018] B.从残渣中提取紫菜硫酸多糖
[001引 （1)利用提取藻红蛋白后剩余的残渣，在10倍体积1%磯酸盐缓冲液、P册.0酸度 下，控制温度在110?12rc，提取1小时，纱布过滤；向滤渣中加入5倍体积的1 %磯酸盐 缓冲液，重复上述操作，再次进行提取、过滤；然后合并两次滤液，得到多糖粗提液；将多糖 粗提液旋转蒸发浓缩；
[0020] 似向浓缩后的多糖粗提液中加入己醇，收集沉淀，冷冻干燥，得到紫菜硫酸多糖 干粉。
[002。 其中，步骤A(l)中1%磯酸盐缓冲液的抑=6. 0。
[002引其中，步骤A(2)中的离也是在转速为9000?llOOOg、温度为5?1(TC条件下离 也10分钟。
[002引其中，步骤A(4)是依次用0. 20、0. 10、0. 05M硫酸馈溶液、蒸觸水W 3?5ml/min 的速度从化en^-S巧harose柱洗脱藻红蛋白。
[0024] 其中，步骤A(5)中所述的用含化C1的磯酸盐缓冲液洗脱，是依次用含0. 15M化C1 的50mM磯酸盐缓冲液、含0. 20M化C1的50mM磯酸盐缓冲液、含0. 2M化C1的lOOmM磯酸 盐缓冲液洗脱。
[00巧]其中，步骤B(2)是加入4倍体积的己醇进行沉淀。
[0026]本发明将紫菜藻体粉碎，水溶性物质在一定浓度盐离子条件下用 Phen^-Se地arose膨化柱提取，即可得藻红蛋白制品，再用DEAE-Se地arose离子交换柱 对藻红蛋白进行纯化，可得藻红蛋白纯品，然后将提取藻红蛋白剩余的残渣用于紫菜硫酸 多糖的提取。纯化后藻红蛋白光谱纯度大于3. 2,产率为0. 66mg/g ;所得硫酸多糖产率为 32. 9mg/g〇
[0027] 本发明先纯化活性藻红蛋白，再提取硫酸多糖，达到了综合利用生物质的目的，同 时，由于藻胆蛋白的提取，降低了硫酸多糖提取时蛋白的污染和淀粉等糖类的污染。因此， 本方法不仅可W得到光谱纯度高于3. 2的试剂级藻红蛋白，而且可同时得到均一性较好的 硫酸多糖。
[0028] 本发明具有如下优点：
[0029] 1.操作过程简单。提取原料仅需切碎，冻融，过滤，即得粗提液。藻胆蛋白分离前 不需进行预处理。
[0030] 2.本发明用蛋白提取后的残渣进行多糖提取，一方面达到了充分利用资源的目 的，另一方面经过蛋白提取后，减少了多糖提取时的蛋白污染，一举两得。
[0031] 3.藻胆蛋白分离速度快，一个完整的分离过程仅需要3. 5小时，包括柱的平衡所 需之30分钟，上样60分钟，清洗50分钟，洗脱60分钟。
[0032] 4.本发明提出了一种简便高效的紫菜综合利用的方法，纯化后的藻红蛋白光谱纯 度大于3. 2,产率为0. 66mg/g，硫酸多糖得率为32. 9mg/g，多糖均一性好，通过本发明可大 大提高紫菜的利用率。
[0033] 本发明利用次等紫菜同时提取藻胆蛋白和紫菜硫酸多糖，具有所得藻红蛋白光谱 纯度高，紫菜硫酸多糖受污染小的优点。操作简便，工艺简单，分离速度快，成本低，提高了 次等紫菜的利用效率，实现了资源的重复使用和多次利用。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为条斑紫菜粗提液在250-800nm的吸收光谱。
[0035] 图2A为0. 2M硫酸馈溶液从化en厂Se地arose膨化柱洗提的藻红蛋白在 250-800nm的吸收光谱。
[0036] 图2B为0. 1M硫酸馈溶液从化en厂Se地arose膨化柱洗提的藻红蛋白在 250-800nm的吸收光谱。
[0037] 图2C为0. 05M硫酸馈溶液从化en厂Se地arose膨化柱洗提的藻红蛋白在 250-800nm的吸收光谱。
[0038] 图2D为蒸觸水从化en厂Se地arose膨化柱洗提的藻红蛋白在250-800皿的吸收 光谱。
[0039] 图3A为藻红蛋白经离子交换柱纯化后在250-800nm的吸收光谱。
[0040] 图3B为离子交换树脂纯化后藻红蛋白英光发射光谱。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，该些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，该些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
[0042] 实施例1，藻红蛋白的提取及纯化方法
[0043] 1.称取lOOg湿重新鲜次等紫菜切碎后，加入10倍于藻体重量的1 %磯酸盐缓冲 液，4°C过夜，使细胞溶胀。
[0044] 2.在转速为9000g、温度为5?1(TC条件下离也10分钟，收集全部上清液，得到藻 红蛋白粗提液340ml。收集所有残渣放入-2(TC冰箱中保存，W备进行硫酸多糖的提取。
[0045] 测定藻红蛋白粗提液的0D值，然后按照公式R-PE = 155. 80D498. 5-40. 00D614-1 0. 50D651，计算得粗提液中含53. 4mg藻红蛋白，产率为5. 34mg/g。
[0046] 图1为条斑紫菜藻红蛋白粗提液在250-800nm的吸收光谱。
[0047] 3.化en厂Se地arose膨化柱提取。首先用0. 5M硫酸馈溶液平衡化en厂Se地arose 膨化柱。在室温下，在藻红蛋白粗提液加入固体硫酸馈至终浓度为0. 5M，W 15ml/min的速 度从下向上粟入膨化柱，藻胆蛋白被吸附剂捕获。再用0. 5M硫酸馈溶液冲洗柱子，将杂质 和细胞残片冲洗干净，直至流出液没有颜色。
[004引 4.依次用0. 20、0. 10、0. 05M硫酸馈溶液和蒸觸水W 15ml/min的速度从上向下洗 提藻红蛋白。收集全部洗提液，透析后测量其体积、测定250-800nm的吸收光谱。
[0049] 图2A为0. 2M硫酸馈溶液从化en厂Se地arose膨化柱洗提的藻红蛋白在 250-800nm的吸收光谱。
[0050] 图2B为0. 1M硫酸馈溶液从化en厂Se地arose膨化柱洗提的藻红蛋白在 250-800nm的吸收光谱。
[0051 ] 图2C为0. 05M硫酸馈溶液从化eny-Se地arose膨化柱洗提的藻红蛋白在 250-800nm的吸收光谱。
[0052] 图2D为蒸觸水从化en厂Se地arose膨化柱洗提的藻红蛋白在250-800皿的吸收 光谱。
[0053] 0. 20,0. 10,0. 05M硫酸馈溶液从膨化柱洗脱样品的纯度和含量见表1。总蛋白含 量为 91. 2mg，产率为 0. 912mg/g。
[0054] 表1不同硫酸馈浓度洗脱的藻红蛋白得率及纯度
[00 巧]
【权利要求】
1. 一种从次等紫菜中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特征在于，从新鲜 次等紫菜中先提取藻红蛋白，再从提取了藻红蛋白的残渣中提取紫菜硫酸多糖，一次提取 过程中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖。
2. 按权利要求1所述的从次等紫菜中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特 征在于，具体步骤如下： A. 藻红蛋白提取 (1) 将新鲜次等紫菜切碎，放入1 %磷酸盐缓冲液使其细胞溶胀破裂； (2) 离心，收集上清液，得到藻红蛋白粗提液，加入固体硫酸铵至终浓度为0. 5M ; (3) 将藻红蛋白粗提液泵入Phenyl-Sepharose柱，清洗去除杂蛋白； (4) 依次用硫酸铵溶液、蒸馈水从Phenyl-Sepharose柱洗脱藻红蛋白； (5) 将步骤⑷中所得的洗脱液分别加入DEAE-Sepharose离子交换柱，先分别用 50mM、100mM磷酸盐缓冲液、10mM醋酸钠、4mM醋酸洗柱，然后用含NaCl的磷酸盐缓冲液洗 脱，即得纯化的藻红蛋白； B. 从残渣中提取紫菜硫酸多糖 (1) 利用提取藻红蛋白后剩余的残渣，在10倍体积1 %磷酸盐缓冲液、PH6. 0酸度下， 控制温度在110?121°C，提取1小时，纱布过滤；向滤渣中加入5倍体积的1 %磷酸盐缓冲 液，重复上述操作，再次进行提取、过滤；然后合并两次滤液，得到多糖粗提液；将多糖粗提 液旋转蒸发浓缩； (2) 向浓缩后的多糖粗提液中加入乙醇，收集沉淀，冷冻干燥，得到紫菜硫酸多糖干粉。
3. 按权利要求2所述的一种从紫菜中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特 征在于，步骤A(2)中的离心是在转速为9000?llOOOg、温度为5?10°C条件下离心10分 钟。
4. 按权利要求2所述的一种从紫菜中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特 征在于，步骤A(4)是依次用0? 20、0. 10、0. 05M硫酸铵溶液、蒸馏水以3?5ml/min的速度 从Phenyl-Sepharose柱洗脱藻红蛋白。
5. 按权利要求2所述的从紫菜中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特征在 于，步骤八(5)中所述的用含似(：1的磷酸盐缓冲液洗脱，是依次用含0.1511似(：1的5〇1111磷 酸盐缓冲液、含〇. 20M NaCl的50mM磷酸盐缓冲液、含0. 2M NaCl的lOOmM磷酸盐缓冲液洗 脱。
6. 按权利要求2所述的一种从紫菜中同时提取藻红蛋白和紫菜硫酸多糖的方法，其特 征在于，步骤B(2)是加入4倍体积的乙醇进行沉淀。
【文档编号】C08B37/00GK104447967SQ201410697186
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】王广策, 牛建峰, 冯建华, 何林文 申请人:南通中国科学院海洋研究所海洋科学与技术研究发展中心, 中国科学院海洋研究所