一种重组仙台病毒的纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，设及一种可满足重组仙台病毒载体疫苗规模化生 产的仙台病毒纯化方法。
【背景技术】
[0002] 仙台病毒基因组是一条负链RNA，长度为15384个核巧酸，共包括6个基因。核蛋 白 NPOiucleoprotein)、憐酸化蛋白 P (地OS地oprotein)、聚合酶大亚基 LQarge protein) 和RNA共同构成核蛋白复合物RNP。基质蛋白！(matrix protein)用于病毒颗粒的组装。 血凝素神经氨酸酶HN化emagglutinin-neuraminidase)和融合蛋白F(fusion protein)是 位于病毒胞膜上的糖蛋白，主要参与病毒粒子与宿主细胞的吸附和侵入等过程。
[0003] Leader(Id)和traileHtr)分别是仙台病毒基因组中特有的前导序列和末端 序列。六个基因头尾相连排列在基因组中，每一个基因作为一个表达单元（开放式阅读 框），其中又可W分为几个独立的区域，分别是基因起始区域GS (Gene Start)、不转录区域 UTR (Untranslate region)和基因结束区域 GE (Gene Elnd), IQntergenic motif)是重复 的3bp片段排列在基因和基因的连接处。
[0004] 仙台病毒的包装过程：pSeV质粒进入细胞后，在辅助病毒乃巧-3(化erst, T. R. et al, Proc.化tl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126, 1986)T7 聚合酶的作用下开始复制正链 RNA， 在辅助质粒pTM-N、pTM-P和pTM-L合成的N、P和L蛋白的作用下复制成负链RNA，也就是 仙台病毒基因组，然后开始表达M蛋白，HN蛋白，F蛋白，并最终包装成完整的病毒颗粒，W 出芽形式形成具有感染能力的仙台病毒。
[0005] 随着反向遗传学技术的发展，仙台病毒被开发为胞质表达传播缺陷性的病毒载 体，临床前研究已证实其携带外源基因对某些疾病，如呼吸道疾病、缺血性损伤和肿瘤等具 有很好的治疗作用。
[0006] 由于仙台病毒属于负单链RNA病毒，病毒的复制和组装等全部生活周期均在细胞 质中完成，复制时也没有DNA链合成过程，而仅W其本身为模板进行正、负链RNA的合成和 转录翻译，尚没有发现其具有整合进入细胞核DNA中的机制和迹象，因此使用起来有较大 的安全保障，解决了长期W来基因治疗中产生的安全性问题；其次，由于该病毒外膜含有仙 台病毒所特有的F蛋白，因此可W高效地将其RNP转入细胞，复制转录后产生足够的目的蛋 白产物，来达到治疗的目的；另外，由于其感染效率高，使用剂量小，因此治疗过程中由病毒 本身引起的副作用要比其它载体系统小得多，安全性更高；目前已经发现，仙台病毒可W感 染包括肌细胞、神经细胞和上皮细胞在内的几乎所有类型的细胞，运一特点使其应用面进 一步拓宽，可被广泛用于基因治疗和基因免疫等各个领域。
[0007] 在临床前研究中，重组仙台病毒载体在重度下肢缺血基因治疗制剂、阿尔茨海默 病（早老性痴呆症）疫苗和艾滋病疫苗中都表现出了极好的治疗效果。
[0008] 重组病毒在应用之前，都要在宿主细胞中增殖之后，从宿主细胞中裂解并进行纯 化。选择一种合适的纯化方法对获得高纯度的重组病毒至关重要。
[0009] 本发明提供一种重组仙台病毒纯化方法，该方法可满足规模化生产重组仙台病毒 载体疫苗，为大规模生产安全、有效的重组仙台病毒载体疫苗奠定了理论基础。
【发明内容】
[0010] 一种重组仙台病毒的纯化方法，其特征在于包括W下步骤：
[0011] (1)真空过滤病毒初始液 阳〇1引 似亲和层析
[0013] (3)超滤
[0014] (4)核酸酶处理
[0015] (5)凝胶过滤层析；
[0016] (6)测定病毒滴度及进行SDS-PAGE电泳。
[0017] 其中，真空过滤病毒初始液选择0. 45 y m滤膜过滤。
[0018] 滤膜过滤后，将包含病毒的滤液进行亲和层析。亲和层析优选使用横酸化纤维素 进行。该层析介质配基为横酸基多糖，可W和仙台病毒表面HN蛋白特异性结合，在低离子 强度下可W吸附大部分仙台病毒，并可在高离子强度下将其洗脱下来，同时对病毒活性影 响不大。收集的病毒培养液W低离子强度的憐酸盐缓冲液稀释后直接上亲和层析柱，低离 子强度的憐酸盐缓冲液优选含75mM化Cl溶液。用低离子强度的憐酸盐缓冲液冲洗柱子后， 再W高离子强度的憐酸盐缓冲液洗脱，优选为含IM化Cl的憐酸盐缓冲液，收集洗脱液。
[0019] 然后将病毒洗脱液进行超滤浓缩，超滤膜包优选截留分子量为500K的超滤膜包。
[0020] 超滤浓缩后用核酸酶处理浓缩液，W去除浓缩液中的宿主DNA杂质。
[0021] 本发明所述核酸酶是Benzonase。
[0022] 核酸酶处理病毒液后，继续进行凝胶过滤，凝胶过滤柱优选为Se地arose 4 FF层 析柱，收集病毒峰即为病毒终液。
[0023] 病毒终液滴度测定采用血凝试验（HA)法和细胞感染单位（cell infectious unit, CIU)法。
[0024] HA测定法：仙台病毒外膜表面存在可与红细胞表面唾液酸残基结合的HN蛋白，该 蛋白同时兼具唾液酸酶活性，可裂解细胞表面糖蛋白上的唾液酸残基，但在低溫下HN主要 表现出的是唾液酸的结合活性，因此可W用来测定病毒的血凝滴度。在一定范围内，测定孔 中细胞密度小于或等于病毒浓度时可出现完全血凝，一旦病毒数目低于细胞数目，则出现 不完全血凝。因此进行滴毒测定时可W将出现完全血凝的孔定为血凝终点，此孔中的病毒 粒子数与细胞数相等，由此可W计算出样品中病毒粒子的密度。
[00巧]如附图1所示，血球完全凝集者为阳性（全黑色圆圈），本发明的纯化方法纯化的 病毒终液的病毒粒子密度为：8X107X2048 = 1.64xl〇iiVP/ml 阳0%] CIU测定方法：纯化的病毒液为非传播型缺陷病毒，可W感染宿主细胞化C-MK2， 在其中复制并产生无感染能力的子代病毒粒子。感染后的细胞W间接免疫法染色后，通过 巧光显微计数确定被检样品中有活性的病毒粒子数目。采用CIU分别测定刚从细胞中裂解 得到的病毒初液和经本发明所述纯化方法纯化得到的病毒终液的滴度，病毒初液的滴度为 2. 31E+11，病毒终液的滴度为1. 45E+11，用本发明的纯化方法的纯化效率达到62. 45%。
[0027] 同时，本发明还对纯化的病毒终液进行SDS-PAGE电泳，结果可观察到仙台病毒典 型的7条条带。
【附图说明】
[00測图1显示的是本发明纯化得到的重组仙台病毒SDS-PAGE结果，泳道1代表分子量 标准（购于Promega)，泳道2代表纯化的重组仙台病毒。
[0029] 图2显示的是HAU法测病毒滴度结果图，全黑圈代表血球完全凝集，圆圈中有点的 代表不完全凝集或不凝集。
【具体实施方式】 阳〇3〇] 实施例1
[0031] 真空过滤病毒初始液
[0032] 1.将收集的仙台病毒上清液3000ml在真空条件下进行过滤，滤膜孔径为 0. 45 Ji m ；
[0033] 2.收集滤液，将滤液用IOmM pH7. 2的憐酸盐溶液稀释2倍至6000ml。
[0034] 实施例2 阳0对亲和层析
[0036] 1.用400ml憐酸盐缓冲液（包含1. 5M化Cl溶液）洗涂亲和层析柱，保持流速为 37ml/min ；
[0037] 2.在4°C下用400ml蒸馈水洗涂亲和层析柱；
[0038] 3.在4°C条件下，用400ml 0.1 M化OH溶液清洗层析柱；
[0039] 4.在4°C下用400ml蒸馈水洗涂亲和层析柱；
[0040] 5.用柱管中的循环水冷却层析柱，然后用冰冷的洗涂溶液（含有75mM化Cl的憐 酸盐缓冲液）洗涂；
[0041] 6.将过滤得到的病毒液上样；
[0042] 7.用650ml冰冷的洗涂溶液洗涂亲和层析柱；
[00创 8.用360ml冰冷的洗脱液（含有IM化Cl的憐酸盐缓冲液）洗脱； W44] 9.收集波长280皿峰值处的洗脱液，体积约为150-200ml。 W45] 实施例3 阳046] 超滤
[0047] 1.用500ml 0.1 M的化OH清洗超滤系统，然后用相同体积的蒸馈水和憐酸缓冲液 DPBS (不含 Ca27Mg2〇 洗涂；
[0048] 2.调节压力累的压力为20psi，并开启压力累；
[0049] 3.收集超滤后的病毒液；
[0050] 4.关闭压力累，在小瓶中加入180ml SmM MgCVDPBS溶液；
[0051] 5.重复步骤2-3,收集病毒液。 阳0巧 实施例4
[0053] 核酸酶处理
[0054] 将核酸酶加入超滤后的病毒液中，使核酸酶的浓度为100U/ml，37°C消化30min 阳0对实施例5
[0056] 凝胶过滤
[0057] 1.用4°C冷水循环冷却凝胶过滤柱，并用500ml 4°C蒸馈水洗涂柱子，保持流速为 5ml/min ；
[0058] 2.用500ml 0.1 M化OH溶液清洗层析柱，4°C过夜； W59] 3.用1000 ml冰冷的DPBS平衡层析柱； W60] 4.上样；
[0061] 5.用1000 ml冰冷的DPBS溶液洗脱病毒液；
[0062] 6.冰上收集第一个洗脱峰，用0. 22 y m的微孔滤膜过滤病毒洗脱液； 阳06引 7.将病毒液分装为IOml/瓶，用干冰/乙醇迅速降溫，并-80°C保存。
[0064] 实施例6 阳0化]病毒滴度测定
[0066] 6. IHA 测定法
[0067] 1.将待检样品从-80°C冰箱中取出，立即放于37°C水浴锅中，待冰完全融化前取 出，放于4°C冰箱中待用。
[0068] 2.取U型底96孔板放在生物安全柜中，从第一孔加 PBS SOul/孔，共16个孔。
[0069] 3.取待检样品50ul加在第一孔，用加样器反复混匀，再取50ul加到下一孔中，如 此依次稀释到第15孔，在第15孔中取出50ul弃掉；第16孔设为阴性对照。
[0070] 4.向各孔中加入新鲜配制的鸡红细胞，8X107cells/ml，50ul/孔。顺序为先加阴 性孔（第16孔），再依从稀到浓的顺序加入鸡红细胞，盖上盖子，轻轻拍打板子侧面，使之混 匀。 阳07U 5. 4°C放置1小时，观察结果，照化记录。
[0072] 6.结果判定：血球完全凝集者判为阳性，凝集终点为最后一个完全凝集的孔，病 毒滴度按W下公式计算：
[0073] 病毒滴度=凝集终点孔的病毒稀释度
[0074] 病毒粒子密度=8 X IO^X病毒滴度 阳0巧]6. 2CIU测定法
[0076] 1. W 2 X IO6AScm2培养瓶接种LLC-MK2细胞，培养S天后，消化细胞，于试验前72 小时接种细胞于六孔板。 阳077] 2.将待检样品从-80°C冰箱中取出，立即放于37°C水浴锅中摇动，待冰即将完全 融化前取出，放于4°C冰箱中待用。
[0078] 3.取无菌EP管7支，分别标记。按下表向各管中加入病毒稀释液，并参考W下方 式将样品用含有1 % BSA的DPBS (预冷）稀释2 X IO6倍。 阳0巧1
[0080] 4.取出六孔板，镜检确认细胞已长满，形态良好，符合实验要求。
[0081] 5.吸去培养液，每孔加入1ml DPBS洗一遍，吸干DPBS ; 阳0間 6.每孔中加7号管样品各100 y 1，摇匀，置37°C，5%的％培养箱培养1小时；
[0083] 7.吸去病毒上清，加入DPBS洗一遍，吸干DPBS ;
[0084] 8.加入2ml的MEM，37°C，5 %的C〇2培养箱培养48小时； 阳0财 9.固定：取出6孔板，吸去培养液，用DPBS洗一遍，吸干，每孔中加入1ml DPBS(37°C溫浴）和lna-20°C预冷的甲醇，常溫下预固定Imin后，吸去预固定液。再向每孔 加入lna-20°C预冷的甲醇，4°C固定10分钟，吸去甲醇，再用DPBS (lml/孔）洗一遍，室溫风 干5min，待用。
[0086] 10.加一抗：将孔中细胞W DPBS(37°C溫浴，Iml/孔）润湿后，甩出，每孔加入 0. 5ml兔抗仙台病毒抗体，37°C培养1小时；
[0087] 11.加二抗：吸去孔中一抗溶液，W DPBS-0. 1% Triton X-IOO 洗孔 3 次，Iml/ 孔， 每次解育3分钟。吸出DPBS-0. 1%化iton X-100。每孔加入0. 5ml FITC标记的羊抗兔 IgG, 37°C培养1小时，培养期间用锡锥纸包住避光，； 阳0蝴 12.洗涂：吸去孔中二抗溶液，W DPBS-0. 1 % Triton X-IOO洗孔3次，Iml/孔，每 次解育3分钟；
[0089] 13.甩去孔中DPBS-0. 1% Triton X-100,每孔加入1ml DPBS，用锡锥纸包住避光。
[0090] 14.显微镜计数：在5 X物镜下分别计数各孔中有巧光的细胞数，每个有巧光的细 胞代表一个CIU，按W下公式计算样品的CIU浓度： W91]样品 CIU 浓度=AX10X2Xl〇6(CIU/mU 阳09引其中，A为6个孔中的有巧光的细胞平均数。 阳〇9引 实施例7
[0094] SDS-PAGE 电泳 阳0巧]采用10% SDS-PAGE法进行，加样量为5. OX IO8CIU, SDS-PAGE电泳后，用考马斯 亮蓝染色，脱色，判断电泳后是否含有仙台病毒的7条特征条带。实验结果如图1所示，经 SDS-PAGE电泳后，可观察到仙台病毒典型的7条条带。
【主权项】
1. 一种重组仙台病毒的纯化方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 真空过滤病毒初始液； (2) 亲和层析； (3) 超滤； (4) 核酸酶处理； (5) 凝胶过滤层析； (6) 测定病毒滴度及进行SDS-PAGE电泳。2. 权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析选用磺酸化纤维素进行，低 离子强度的磷酸盐缓冲液为75mM NaCl溶液，高离子强度的磷酸盐洗脱液为1M NaCl溶液。3. 权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述超滤中超滤膜包为截留分子量为 500K的超滤膜包。4. 权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述核酸酶为Benzonase。5. 权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述凝胶过滤层析的过滤柱为Sepharose 4FF 柱。6. 权利要求1所述的纯化方法在重组仙台病毒载体疫苗生产中的应用。
【专利摘要】本发明主要涉及一种仙台病毒纯化方法，适合用于重组仙台病毒载体疫苗规模化生产，其特征在于，该方法主要包括真空过滤、亲和层析、超滤、核酸酶处理和凝胶过滤层析步骤。该方法具有操作简单、质量稳定、收率高等特点。
【IPC分类】C12R1/93, A61K39/155, A61P31/14, C12N7/02
【公开号】CN105713882
【申请号】CN201410734206
【发明人】张锋, 唐仁陶, 杨延新, 于崇勋, 王明晓, 李银贵
【申请人】石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司