一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴将新鲜黄绿蜜环菌干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌；⑵所述干燥后的黄绿蜜环菌粉碎成干粉；⑶在所述干粉中加入水，然后采用微波提取法提取，得到提取液；⑷所述提取液经减压浓缩或有机膜浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液；⑸所述浓缩液中加入无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖；⑹将所述黄绿蜜环菌粗多糖用纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。本发明不但提取时间短、提取率高，而且多糖含量较高，同时节能环保。
【专利说明】一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高含量多糖的制备方法，尤其涉及一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法。
【背景技术】
[0002]黄绿蜜环菌(Amillarialuteo-vriens)，又名黄蘑燕，属担子菌亚门，层菌纲，口蘑目，口蘑科，蜜环菌属。黄绿蜜环菌含有丰富多糖、蛋白质、氨基酸等，具有增强机体免疫功能和抑制肿瘤生长等功效，有较高的营养价值和食疗保健作用。
[0003]微波提取法是近年来发展的一种新型的提取技术，该技术具有提取时间短、提取效率高、节能环保等优点。当前，黄绿蜜环菌多糖的提取方法多为水煮提取，该方法较落后，能耗较大。专利“一种抗癌的黄绿蜜环菌多糖及提取工艺”采用超声提取方法提取黄绿蜜环菌中多糖，其提取多糖并未指出多糖含量及多糖提取率，只是指出该多糖具有抗癌活性。文献“黄绿蜜环菌菌丝体水提物多糖含量测定”中采用回流水提取方法对培养物黄绿蜜环菌菌丝体进行提取，但该菌丝体并非黄绿蜜环菌。专利“黄蘑菇标准化组分制法及其在肝癌治疗中的应用”中的抗癌活性成分是黄蘑菇水提取后的残渣再用丙酮进行提取得到的成分，从植物化学的方面考虑，抗癌活性成分为去除大分子化合物多糖、蛋白后的小分子化合物。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种提取率高的高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法。
[0005]为解决上述问题，本发明所述的一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在3(T80°C干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌；
⑵所述干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为1(T200 um的干粉；
⑶在所述干粉中按KTlOOml:lg的液料比加入水，然后采用微波提取法提取，得到提取液；
⑷所述提取液经减压浓缩或有机膜浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液；
(5)所述浓缩液中加入其体积3飞倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖；
(6)将所述黄绿蜜环菌粗多糖用其质量f10倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入所述黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量3飞倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
[0006]所述步骤⑶中微波提取条件是指微波功率为5(Tl000W，提取温度为4(T90°C，提取时间为15?60min。
[0007]所述步骤⑷中减压浓缩的条件是指真空度为0.0lMPa?0.09MPa，温度为5(T90°C。
[0008]所述步骤⑷中有机膜为反渗透膜或纳滤膜，膜分离操作压力为0.2?20 MPa。
[0009]所述步骤(6)中的干燥是指冷冻干燥、喷雾干燥、烘箱烘干中的任意一种。
[0010]所述冷冻干燥的条件是指冷肼温度为-5(T-20°C，真空度为20Pa?50 Pa。
[0011]所述喷雾干燥的条件是指入料流量为200?1000 mL/h,入料温度为3(T70°C，进风温度为17(T210°C，进风量为16?28 m3/h。
[0012]所述烘箱干燥的温度为4(T70°C。
[0013]本发明与现有技术相比具有以下优点:
1、本发明采用黄绿蜜环菌的超微粉碎物作为提取物，采用微波提取方法提取其多糖，与现有技术相比，不但提取时间短、提取率高(多糖提取率>10%)、而且多糖含量较高，同时污染少、节能环保，为黄绿蜜环菌多糖的开发提供了依据(参见图1)。
[0014]2、由于本发明提取多糖含量高、且多糖对肺癌细胞(NC1-H446)具有抗肺癌活性，可广泛运用于食品、保健品等行业中。
[0015]实验:
⑴配药:药物均由培养基配制，适当超声溶解，0.22微米滤器过滤，-20°c冰箱保存备用。
[0016]⑵收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度3X104/ml，每孔加入10ul (边缘孔用无菌PBS填充)。待细胞贴壁后，分别加入8个浓度梯度的药物(0.02，0.04, 0.08, 0.16,
0.31, 0.63, 1.25，2.50 mg/ml )，设3个复孔，5%C02，37°C孵育48小时，倒置显微镜下观察。
[0017]⑶每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。
[0018]⑷终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul 二甲基亚砜，在酶联免疫检测仪0D492nm处测量各孔的吸光值。
[0019](5)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
[0020](6)实验数据通过GraphPad Prism 5进行分析计算。
[0021]实验结果:黄绿蜜环菌对肺癌细胞(NC1-H446)的IC50为1.03mg/ml。说明黄绿蜜环菌具有良好的抗肺癌活性。
[0022]3、本发明所得的黄绿蜜环菌多糖使用安全，无毒副作用，且制备工艺简单、质量稳定、适合于规模化生产，具有广阔的应用前景和市场价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0024]图1为本发明黄绿蜜环菌多糖的红外光谱图。
【具体实施方式】
[0025]实施例1 一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在30 V干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌。
[0026]⑵干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为10 um的干粉。
[0027]⑶在干粉中按1ml:lg的液料比加入水，然后采用微波提取法在微波功率为50W、提取温度为40°C的条件下提取15min，得到提取液。
[0028]⑷提取液在真空度为0.0lMPa、温度为50°C的条件下经减压浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液。
[0029](5)浓缩液中加入其体积3倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖。
[0030](6)将黄绿蜜环菌粗多糖用其质量I倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量3倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B在冷肼温度为-20°C、真空度为20Pa的条件下冷冻干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
[0031]实施例2 —种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在70 V干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌。
[0032]⑵干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为200 um的干粉。
[0033]⑶在干粉中按100ml:lg的液料比加入水，然后采用微波提取法在微波功率为1000W、提取温度为90°C的条件下提取60min，得到提取液。
[0034]⑷提取液在真空度为0.09MPa、温度为90°C的条件下经减压浓缩脱水至浸膏状，得到浓缩液。
[0035](5)浓缩液中加入其体积6倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖。
[0036](6)将黄绿蜜环菌粗多糖用其质量10倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量6倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B在冷肼温度为_50°C、真空度为50 Pa的条件下干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
[0037]实施例3 —种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在40 V干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌。
[0038]⑵干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为100 um的干粉。
[0039]⑶在干粉中按50ml:1g的液料比加入水，然后采用微波提取法在微波功率为500W、提取温度为60°C的条件下提取30min，得到提取液。
[0040]⑷提取液经纳滤膜浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液。
[0041]其中:膜分离操作压力为20 MPa。
[0042](5)浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖。
[0043](6)将黄绿蜜环菌粗多糖用其质量5倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量5倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B在入料流量为200 mL/h、入料温度为30°C、进风温度为170°C、进风量为16 m3/h的条件下喷雾干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
[0044]实施例4 一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在60 V干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌。
[0045]⑵干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为80 um的干粉。
[0046]⑶在干粉中按70ml:1g的液料比加入水，然后采用微波提取法在微波功率为100W、提取温度为45°C的条件下提取20min，得到提取液。
[0047]⑷提取液经纳滤膜浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液。
[0048]其中:膜分离操作压力为10 MPa。
[0049](5)浓缩液中加入其体积5倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖。
[0050](6)将黄绿蜜环菌粗多糖用其质量8倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量4倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B在入料流量为1000 mL/h、入料温度为70°C、进风温度为210°C、进风量为28 m3/h的条件下喷雾干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
[0051]实施例5 —种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在55 °C干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌。
[0052]⑵干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为150 um的干粉。
[0053]⑶在干粉中按20ml:1g的液料比加入水，然后采用微波提取法在微波功率为300W、提取温度为70°C的条件下提取25min，得到提取液。
[0054]⑷提取液经反渗透膜浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液。
[0055]其中:膜分离操作压力为0.2 MPa。
[0056](5)浓缩液中加入其体积3倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖。
[0057](6)将黄绿蜜环菌粗多糖用其质量4倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量4倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B在温度为40°C的条件下烘箱干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
[0058]实施例6 —种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在65 °C干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌。
[0059]⑵干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为120 um的干粉。
[0060]⑶在干粉中按25ml:1g的液料比加入水，然后采用微波提取法在微波功率为450W、提取温度为55°C的条件下提取25min，得到提取液。
[0061]⑷提取液经反渗透膜浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液。
[0062]其中:膜分离操作压力为20 MPa。
[0063](5)浓缩液中加入其体积3倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖。
[0064](6)将黄绿蜜环菌粗多糖用其质量2倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量4倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B在温度为70°C的条件下烘箱干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
[0065]实施例7 —种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在60 V干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌。
[0066]⑵干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为50 um的干粉。
[0067]⑶在干粉中按30ml:1g的液料比加入水，然后采用微波提取法在微波功率为200W、提取温度为55°C的条件下提取40min，得到提取液。
[0068]⑷提取液在真空度为0.05MPa、温度为70°C的条件下经减压浓缩脱水至浸膏状，得到浓缩液。
[0069](5)浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖。
[0070](6)将黄绿蜜环菌粗多糖用其质量6倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量4倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B在冷肼温度为_35°C、真空度为35 Pa的条件下冷冻干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
[0071]实施例8 一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在80 V干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌。
[0072]⑵干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为30 um的干粉。
[0073]⑶在干粉中按60ml:1g的液料比加入水，然后采用微波提取法在微波功率为600W、提取温度为75°C的条件下提取50min，得到提取液。
[0074]⑷提取液经纳滤膜浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液。
[0075]其中:膜分离操作压力为5 MPa。
[0076](5)浓缩液中加入其体积5倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖。
[0077](6)将黄绿蜜环菌粗多糖用其质量5.5倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量5倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B在入料流量为600 mL/h、入料温度为50°C、进风温度为190°C、进风量为22 m3/h的条件下喷雾干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
[0078]实施例9 一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤:
⑴将新鲜黄绿蜜环菌在50 V干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌。
[0079]⑵干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为180 um的干粉。
[0080]⑶在干粉中按90ml:lg的液料比加入水，然后采用微波提取法在微波功率为800W、提取温度为85°C的条件下提取55min，得到提取液。
[0081]⑷提取液经反渗透膜浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液。
[0082]其中:膜分离操作压力为0.5 MPa。
[0083](5)浓缩液中加入其体积3倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖。
[0084](6)将黄绿蜜环菌粗多糖用其质量9倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量3倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B在温度为55°C的条件下烘箱干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
【权利要求】
1.一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，包括以下步骤: ⑴将新鲜黄绿蜜环菌在3(T80°C干燥至恒重后，得到干燥后的黄绿蜜环菌； ⑵所述干燥后的黄绿蜜环菌用超微粉碎机粉碎至粒径为1(T200 um的干粉； ⑶在所述干粉中按l(TlOOml:lg的液料比加入水，然后采用微波提取法提取，得到提取液； ⑷所述提取液经减压浓缩或有机膜浓缩后脱水至浸膏状，得到浓缩液； (5)所述浓缩液中加入其体积3飞倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物A，即得黄绿蜜环菌粗多糖； (6)将所述黄绿蜜环菌粗多糖用其质量f10倍的纯水溶解，过滤后得到上清液，该上清液中加入所述黄绿蜜环菌粗多糖溶解体积的质量3飞倍的无水乙醇进行沉淀，静止24h后离心，收集沉淀物B，该沉淀物B干燥至恒重，即得多糖含量>80%的黄绿蜜环菌多糖。
2.如权利要求1所述的一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，其特征在于:所述步骤⑶中微波提取条件是指微波功率为5(Tl000W，提取温度为4(T90°C，提取时间为15?60mino
3.如权利要求1所述的一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，其特征在于:所述步骤⑷中减压浓缩的条件是指真空度为0.0lMPa?0.09MPa，温度为5(T90°C。
4.如权利要求1所述的一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，其特征在于:所述步骤⑷中有机膜为反渗透膜或纳滤膜，膜分离操作压力为0.2?20 MPa。
5.如权利要求1所述的一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，其特征在于:所述步骤(6)中的干燥是指冷冻干燥、喷雾干燥、烘箱烘干中的任意一种。
6.如权利要求5所述的一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，其特征在于:所述冷冻干燥的条件是指冷肼温度为-5(T-20°C，真空度为20Pa?50 Pa。
7.如权利要求5所述的一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，其特征在于:所述喷雾干燥的条件是指入料流量为20(Tl000 mL/h，入料温度为3(T70°C，进风温度为170?210°C，进风量为16?28 m3/h。
8.如权利要求5所述的一种高含量黄绿蜜环菌多糖的制备方法，其特征在于:所述烘箱干燥的温度为4(T70°C。
【文档编号】C08B37/00GK104448024SQ201410801646
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】陈晨, 邵赟, 陶燕铎, 文怀秀 申请人:中国科学院西北高原生物研究所