一种低分子肝素的纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种低分子肝素的纯化方法。本发明的技术方案是将所制得的低分子肝素经过以壳聚糖为载体,抗凝血酶Ⅲ为配基的亲和色谱法来纯化，最终得到了一种高纯低分子肝素产品。本发明生产的纯化后的低分子肝素抗Xa活性为646.0IU/mg,比纯化前提高6.3倍,而抗Ha活性极低基本不体现，明显提高了低分子肝素的纯度，从而也大大提高了其抗Xa活性，提高其应用价值。
【专利说明】一种低分子肝素的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生化【技术领域】，具体地说是所制得的低分子肝素再经过以壳聚糖为载体，抗凝血酶III为配基的亲和色谱法来纯化，最终得到了一种高纯低分子肝素产品。
【背景技术】
[0002]肝素是一种天然的抗凝血物质，但未分级的肝素存在许多局限性:半衰期短；需监测凝血酶活性并调整用量；需持续静脉点滴；受血小板IV因子影响，使疗效不稳定；导致骨质疏松和血小板减少等。而低分子肝素与普通肝素比有很大区别，不但能产生良好且持久的抗血栓等作用，临床安全性好，还具有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等功能，同时又可减轻或避免普通肝素的不良作用，从而使用起来更方便。
[0003]目前，低分子肝素在临床上的应用主要有静脉血栓、冠状动脉综合征、弥散性血管内凝血、不稳定性心绞痛和心肌梗死等，而且有相关药效学实验表明其抗血栓作用较普通肝素强，也具有免疫调节作用，现已试用于艾滋病的临床治疗中。
[0004]本发明运用以壳聚糖为载体，抗凝血酶III为配基的亲和色谱法对低分子肝素进行纯化，对其中的抗Xa活性成分进行极大可能的筛选，使提纯后的低分子肝素抗Xa活性为646.0IU/mg,比纯化前提高6.3倍，而抗Ha活性极低，基本不体现，即生产出一种溶血栓能力较强，抗凝血能力较低的新型抗血栓肝素类药物具有较高的应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是生产纯度较高的低分子肝素。
[0006]本发明的技术方案是:将所制得的低分子肝素再经过以壳聚糖为载体，抗凝血酶III为配基的亲和色谱法来纯化，最终得到了一种高纯低分子肝素产品。本发明具有工艺简单，操作安全，成本较低的特点，非常适用于规模化大生产。包括如下步骤:
(1)制备亲和树脂:将壳聚糖在水中进行悬浮溶胀24h，用NaOH溶液调节pH8.0-9.0，加入戊二醛溶液反应2h，抽滤，再用水洗净戊二醛至无味，在低温条件下加入凝血酶，反应5h，反应终止后加入NaCl溶液洗去未偶联的配基，并用水洗至pH为中性，用亲和柱平衡液浸泡15min后，脱气，再装柱；
(2)将低分子肝素用pH为7.5Tris-HCl缓冲液溶解；
(3)上样至亲和色谱柱；
(4)上样后用Tris-HCl缓冲液洗涤；
(5)用氯化钠溶液洗脱；
(6)向洗脱液中加入3倍体积的乙醇低温沉淀；
(7)真空干燥得到高纯低分子肝素。
【具体实施方式】
[0007]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0008]实施例1
将所制得的低分子肝素再经过以壳聚糖为载体，抗凝血酶III为配基的亲和色谱法来纯化，最终得到了一种高纯低分子肝素产品，包括如下步骤:
(I)制备亲和树脂
取10g壳聚糖在100ml双蒸水中进行悬浮溶胀24h，用0.lmol/L的NaOH溶液调节PH8.0-9.0，加入300ml 20%戊二醛溶液反应2h，抽滤，再用双蒸水洗净戊二醛至无味，在低温条件下加入Ig凝血酶，反应5h，反应终止后加入3mol/LNaCl溶液洗去未偶联的配基，并用双蒸水洗至PH为中性，用亲和柱平衡液浸泡15min后，脱气，再装柱。
[0009](2)亲和色谱纯化
采用柱高40cm、内径1.0cm的分离柱，装柱，取10mg低分子肝素用1.5ml 20mmol/LpH为7.5Tris-HCl缓冲液溶解，上样至亲和色谱柱中，上样后用20mmol/LpH为7.5Tris_HCl缓冲液洗涤，再用3mol/L氯化钠溶液洗脱，向洗脱液中加入3倍体积的乙醇，(TC低温沉淀24h，过滤出沉淀物，并用少量纯乙醇洗涤沉淀物，真空干燥后准确称量得到高纯低分子肝素产物质量。
[0010]实施例2
将所制得的低分子肝素再经过以壳聚糖为载体，抗凝血酶III为配基的亲和色谱法来纯化，最终得到了一种高纯低分子肝素产品，包括如下步骤:
(I)制备亲和树脂
取10g壳聚糖在100ml双蒸水中进行悬浮溶胀24h，用0.lmol/L的NaOH溶液调节PH8.0-9.0，加入300ml 30%戊二醛溶液反应2h，抽滤，再用双蒸水洗净戊二醛至无味，在低温条件下加入1.5g凝血酶，反应5h，反应终止后加入3mol/LNaCl溶液洗去未偶联的配基，并用双蒸水洗至PH为中性，用亲和柱平衡液浸泡15min后，脱气，再装柱。
[0011](2)亲和色谱纯化
采用柱高40cm、内径1.0cm的分离柱，装柱，取10mg低分子肝素用2.5ml 20mmol/LpH为7.5Tris-HCl缓冲液溶解，上样至亲和色谱柱中，上样后用20mmol/LpH为7.5Tris-HCl缓冲液洗涤，再用3mol/L氯化钠溶液洗脱，向洗脱液中加入3倍体积的乙醇，(TC低温沉淀24h，过滤出沉淀物，并用少量纯乙醇洗涤沉淀物，真空干燥后准确称量得到高纯低分子肝素产物质量。
[0012]经核算，采用中国药典方法检测可得，低分子肝素抗Xa活性为646.0IU/mg,比纯化前提高6.3倍。
[0013]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.一种低分子肝素的纯化方法，其特征在于:将制得的低分子肝素通过亲和色谱的方法得到高纯度的低分子肝素产品。
2.根据权利要求1所述的制备高纯度低分子肝素的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: 制备亲和树脂:将壳聚糖在水中进行悬浮溶胀24h，用NaOH溶液调节pH8.0-9.0，加入戊二醛溶液反应2h，抽滤，再用水洗净戊二醛至无味，在低温条件下加入凝血酶，反应5h，反应终止后加入NaCl溶液洗去未偶联的配基，并用水洗至pH为中性，用亲和柱平衡液浸泡15min后，脱气，再装柱； 将低分子肝素用pH为7.5 Tris-HCl缓冲液溶解； 将溶解液上柱进行吸附； 加入Tris-HCl缓冲液洗涤； 用氯化钠溶液洗脱，收集洗脱液； 加入乙醇进行低温沉淀，得到沉淀物； 真空干燥得到高纯低分子肝素产品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤(I)中，戊二醛浓度20%-30%;加入凝血酶的量为壳聚糖的0.05%-2%。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，溶解用的Tris-HCl缓冲液体积约为低分子肝素的1%_3%。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述吸附柱为亲和层析柱。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于:所述亲和层析柱包括:CM_SephadexA-25,CM-Sephadex A-50, CM-Sephadex C-25,CM-Sephadex C-50，SP-Sepharose2B, SP-Sepharose 4B, SP-Sepharose 6B，SP-Sepharose CL-2B, SP-SepharoseCL-4B, SP-Sepharose CL-6B。
【文档编号】C08B37/10GK104497172SQ201410807934
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月23日 优先权日:2014年12月23日
【发明者】刘乃山, 宋立明, 刘翠珍 申请人:青岛康原药业有限公司