一种浓缩纯化肝素的生产工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种浓缩纯化肝素的生产工艺，属于生物工程领域。采用扩张柱床离子交换树脂法。改变了使用传统的离子交换固定柱床吸附技术原料液中不能含有不溶性颗粒的限制，并可将肝素与杂质蛋白、核酸及其余硫酸多糖分离，浓缩，纯化一次完成。减少工序，缩短时间，降低成本，提高效率和质量。
【专利说明】一种浓缩纯化肝素的生产工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种浓缩纯化肝素的生产工艺，属于生物工程领域，具体是一种采用扩张柱床离子交换吸附层析技术浓缩纯化肝素的生产工艺。
技术背景
[0002]肝素(heparin)是1916年Mclean研宄凝血机制时从肝脏组织中发现的一种酸性粘多糖。1939年，Brinkhous等证明了肝素具有抗凝血活性，从此，肝素作为天然抗凝血物质而受到世界各国的重视。
目前，非氧化法制备肝素比较常用的方法是离子交换树脂法。离子交换树脂的性能和工艺是决定收率的关键，要选择好树脂的处理方法和处理时间，使其最大限度地进行肝素的交换吸附。国内离子交换树脂法普遍采用分批吸附的方法，上柱、除杂、洗脱分开进行。这种方法柱效低，对树脂损害大，操作步骤多，费用高，活性成分提取率低。
【发明内容】
[0003]本发明公开了一种纯化肝素的生产工艺。
[0004]本发明的技术方案为:一种浓缩纯化肝素的生产工艺，其步骤如下:
(I)粗品制备:
a)猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜或肝、肺等脏器的组织匀浆液中加入NaCI，搅拌、静置、过滤。
[0005]b)在 ρΗ7.5-10.5，40-50 °C 下酶解数小时，NaOH 调 pH 至 8.0-10.0，升温至50-55°C，保温2-4h，不断搅拌，然后快速升温到92-95°C，保持10_15min，趁热用80目滤网过滤，得到滤液(I)备用。
c)扩张床柱Streamline50装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂。控制温度40-65°C，用蠕动泵调pH为7.5-10.5，适量MTris-HCl缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。保持PH值不变，将适量滤液(I)加MTris-HCl缓冲液配制成NaCI为2_6%，pH为7.5-10.5的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中先平衡树脂，然后反复进行离子交换，流速约为每小时2倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止。
d)然后配制适量的的2.5-6.5%氯化钠溶液，MTris-HCl缓冲液调节pH3_5，以2?3个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以5-6倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度15-30°C。
e)关掉蠕动泵，使D254树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。
[0006]f)按洗脱液体积加入1.0倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。
g)次日吸除乙醇。沉淀物用1.5-2.5%氯化钠溶液溶解，调pH至6.0。按溶液体积加
0.7倍乙醇，沉淀过夜。
h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得肝素。
(2)精品制备:
a)将肝素粗品以1: 10的比例溶于3%的氯化钠溶液中，然后再用2%的氢氧化钠溶液调PH至7.5-11.5，于室温静置数小时，真空抽滤，去沉淀物，滤液待用。
b)在上述清液中加入0.05-0.2%胰蛋白酶，在pH7.5-10.5，35_45°C酶解数小时，升温98-100°C，10-15min，趁热真空抽滤，滤液备用。
c)扩张床柱Streamline50装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂，用蠕动泵将PH7-10，适量MTris-HCl缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。
d)控制温度40-60°C，将适量滤液加MTris-HCl缓冲液配制pH为7.5-10.5的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持PH值与温度恒定，流速约为每小时2倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止。
e)然后配制适量的预冷的2.5-6.5%氯化钠溶液，MTris-HCl缓冲液调节ρΗ1_3，以2?3个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以5-6倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度3-6 °C，流速约为每小时2.5柱床体积。
f)关掉蠕动泵，使树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。
[0007]g)按洗脱液体积加入1.0倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。
h)次日吸除乙醇。沉淀物用2 %氯化钠溶液溶解，调pH至6.0。
[0008]i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得精品肝素。
有益效果:
本发明用浓缩纯化肝素的生产工艺最后得到效价高于180U/mg，收率高于80%的高纯度肝素钠。达到中国药典标准。
【具体实施方式】
[0009]实施例1
a)猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜的组织匀浆液50g左右加水至250L，加入NaCI，搅拌、静置、过滤。
b)滤液加入0.25%胰蛋白酶，在pH8.5，40 °C下酶解数小时，NaOH调pH至9.0，升温至50°C，保温2h，不断搅拌，然后快速升温到92-95°C，保持10_15min，趁热用80目滤网过滤，滤液(I )备用。
c)取适量强碱性D254干树脂，在蒸馏水中充分浸泡，溶胀后滤干，加等体积乙醇或丙酮搅拌I小时，用蒸馏水洗净滤干，加4倍量的2mol/l的盐酸溶液搅拌2小时，用蒸馏水洗至中性，滤干；加2倍量2mol/l的氢氧化钠溶液搅拌2小时，蒸馏水洗至中性，滤干；最后用2倍量2mol/l的盐酸溶液搅拌2小时，水洗至中性。
d)取10g已处理好的强碱性D254树脂加入扩张床柱Streamline50，用蠕动泵以每小时2倍柱床体积的流速将pH为8.0的适量MTris-HCl缓冲液(II )自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。控制温度40°C (平衡)。
e)将适量滤液(I)加缓冲液(II )，配置成料液(III)。调整料液(III)NaCI浓度达到3%左右，NaOH调pH至8.0。用蠕动泵将料液(III)通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持恒定的PH值，温度为18°C。流速约为每小时2.5倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止(上样)。，
f)配制10个柱床体积的6%氯化钠溶液，MTris-HCl缓冲液调节pH3_5，以2?3个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以5-6倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度15-25°C，流速约为每小时2.5柱床体积。(向上冲洗，除杂)。
g)关掉蠕动泵，使D254树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用用约4倍柱床体积的4%氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约2倍柱床体积的3%氯化钠溶液(用量先多后少)同法洗脱2次。合并全部洗脱液，调节PH为6 (洗脱)。
h)按洗脱液体积加入1.0倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化钠溶液溶解，调pH至6.0。按溶液体积加0.7倍乙醇，沉淀过夜。
i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得肝素成品。
实施例2
a)将1g肝素粗品溶于3%的10ml氯化钠溶液中，然后再用2%的氢氧化钠溶液调pH至9，于18°C静置6小时，真空抽滤，滤液待用。
[0010]b)在上述清液中加入0.03 %胰蛋白酶，在pH8.5，40 °C下酶解4小时，升温98-100°C，10min，趁热真空抽滤，滤液(I )备用。
[0011]c)取适量强碱性D254干树脂，在蒸馏水中充分浸泡，溶胀后滤干，加等体积乙醇或丙酮搅拌I小时，用蒸馏水洗净滤干，加4倍量的2mol/l的盐酸溶液搅拌2小时，用蒸馏水洗至中性，滤干；加2倍量2mol/l的氢氧化钠溶液搅拌2小时，蒸馏水洗至中性，滤干；最后用2倍量2mol/l的盐酸溶液搅拌2小时，水洗至中性。
[0012]d)取30g已处理好的强碱性D254树脂加入扩张床柱Streamline50 (5cm内径)、用蠕动泵以每小时2倍柱床体积的流苏将pH为8.0的适量MTris-HCl缓冲液(II )自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡(平衡)。
[0013]e)调整pH值9不变，将适量滤液(I )加缓冲液(II )，使粗品氯化钠浓度达到3%左右(III)。用蠕动泵将料液(III)通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持恒定的PH值，保持温度20°C。流速约为每小时2倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止(上样)。
[0014]f)配制约10个柱床体积的预冷的6 %氯化钠溶液，用MTris-HCl缓冲液调节PH1.2，缓冲液平衡/扩张柱床后，以5-6倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度5°C度以下，流速约为每小时2.5柱床体积。(向上冲洗)。
[0015]g)关掉蠕动泵，使D254树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用用约4倍柱床体积的pH为8的4%氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约2倍柱床体积的3%氯化钠溶液(用量先多后少)同法洗脱2次。合并全部洗脱液，调节pH为6 (洗脱)。
[0016]h)按洗脱液体积加入1.0倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化钠溶液溶解，调pH至6.0。按溶液体积加0.7倍乙醇，沉淀过夜。
[0017]i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得精品肝素。
[0018]实施例3
a)猪、牛、羊等哺乳动物的肝、肺等脏器的组织匀浆液30g左右加水至250L，加入NaCI至5%，搅拌、静置、过滤。
[0019]b)在上述清液中加入0.4%木瓜蛋白酶，在pH8.5，40°C下酶解4小时，升温98-100°C，10分钟，趁热真空抽滤，滤液(I )备用。
[0020]c)取适量强碱性D254干树脂，在蒸馏水中充分浸泡，溶胀后滤干，加等体积乙醇或丙酮搅拌I小时，用蒸馏水洗净滤干，加4倍量的2mol/l的盐酸溶液搅拌2小时，用蒸馏水洗至中性，滤干；加2倍量2mol/l的氢氧化钠溶液搅拌2小时，蒸馏水洗至中性，滤干；最后用2倍量2mol/l的盐酸溶液搅拌2小时，水洗至中性。
[0021]d)取10g已处理好的强碱性D254树脂加入扩张床柱Streamline50 (5cm内径)、用蠕动泵以每小时2倍柱床体积的流速将pH为8.0的适量MTris-HCl缓冲液(II )自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。控制温度40°C (平衡)。
[0022]e)将适量滤液(I )加缓冲液(II )，配置成料液(III)。调整料液(III) NaCI浓度达到3%左右，NaOH调pH至8.0。用蠕动泵将料液(III)通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持恒定的PH值，温度为18°C。流速约为每小时2.5倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止(上样)。
[0023]f)配制10个柱床体积的6%氯化钠溶液，MTris-HCl缓冲液调节pH3_5，以2?3个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以5-6倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度15-25°C，流速约为每小时2.5柱床体积。(向上冲洗，除杂)。
[0024]g)关掉蠕动泵，使D254树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用用约4倍柱床体积的4%氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约2倍柱床体积的3%氯化钠溶液(用量先多后少)同法洗脱2次。合并全部洗脱液，调节PH为6(洗脱)。
[0025]h)按洗脱液体积加入1.0倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。次日吸除乙醇。沉淀物用2%氯化钠溶液溶解，调pH至6.0。按溶液体积加0.7倍乙醇，沉淀过夜。
[0026]i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得肝素成品。
【权利要求】
1.一种浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于其工艺步骤如下: (1)粗品制备: a)猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜或肝、肺等脏器的组织匀浆液中加入NaCI，搅拌、静置、过滤； b)在ρΗ7.5-10.5，40-50 °C 下酶解数小时，NaOHi周 pH 至 8.0-10.0，升温至 50-55。。，保温2-4h，不断搅拌，然后快速升温到92-95°C，保持10-15min，趁热用80目滤网过滤，得到滤液⑴备用； c)扩张床柱Streamline50装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂； 控制温度40-65°C，用蠕动泵调pH为7.5-10.5，适量MTris-HCl缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡； 保持pH值不变，将适量滤液⑴加MTris-HCl缓冲液配制成NaCI为2_6%，pH为7.5-10.5的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中先平衡树脂，然后反复进行离子交换，流速约为每小时2倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止； d)然后配制适量的的2.5-6.5%氯化钠溶液，MTris-HCl缓冲液调节pH3_5，以2?3个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以5-6倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度15-30 0C ； e)关掉蠕动泵，使D254树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱； f)按洗脱液体积加入1.0倍量的预冷乙醇，沉淀过夜； g)次日吸除乙醇； 沉淀物用1.5-2.5%氯化钠溶液溶解，调pH至6.0 ; 按溶液体积加0.7倍乙醇，沉淀过夜； h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物； 沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水； 真空干燥后得肝素； (2)精品制备: a)将肝素粗品以1: 10的比例溶于3%的氯化钠溶液中，然后再用2%的氢氧化钠溶液调PH至7.5-11.5，于室温静置数小时，真空抽滤，去沉淀物，滤液待用； b)在上述清液中加入0.05-0.2%胰蛋白酶，在pH7.5-10.5，35_45°C酶解数小时，升温98-100°C，10-15min，趁热真空抽滤，滤液备用； c)扩张床柱Streamline50装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂，用蠕动泵将PH7-10，适量MTris-HCl缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡； d)控制温度40-60°C，将适量滤液加MTris-HCl缓冲液配制pH为7.5-10.5的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持PH值与温度恒定，流速约为每小时2倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止； e)然后配制适量的预冷的2.5-6.5%氯化钠溶液，MTris-HCl缓冲液调节ρΗ1_3，以2?3个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以5-6倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度3-6 °C，流速约为每小时2.5柱床体积； f)关掉蠕动泵，使树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱； g)按洗脱液体积加入1.0倍量的预冷乙醇，沉淀过夜； h)次日吸除乙醇； 沉淀物用2%氯化钠溶液溶解，调pH至6.0 ; i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物； 沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水； 真空干燥后得精品肝素； 如权利要求1所述:扩张柱床离子交换色谱技术的原料为猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜、肝、肺脏等脏器和粗品肝素。
2.如权利要求1所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于:步骤(I)中c扩张柱床温度控制为40-65 °C。
3.如权利要求1所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于:步骤(I)中c扩张柱床Ph 调控在 7.5-10.5。
4.如权利要求1所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于:步骤(I)中d使用的氯化钠质量百分浓度为2.5-6.5%。
5.如权利要求1所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于:步骤(2)中a氢氧化钠调节Ph范围为7.5-11.5。
6.如权利要求1所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于:步骤(2)中c强碱性阴离子交换树脂作为吸附介质。
7.如权利要求1所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于:步骤(2)中e温度控制的范围为3 — 6°C。
【文档编号】C08B37/10GK104479050SQ201410813643
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月24日 优先权日:2014年12月24日
【发明者】刘乃山, 刘忠凯, 迟培升 申请人:青岛九龙生物医药有限公司