具有保肝作用的海胆黄多糖及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有保肝作用的海胆黄多糖及其制备方法和应用。本发明通过对海胆黄多糖的提取分离工艺进行改进，在现有的制备方法上，采用性能更好的DEAE Sepharose Fast Flow填料，在DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析前进行超滤除杂，同时在Sephacryl-400凝胶柱层析后采用超滤替代现有的透析。本发明着重于海胆黄多糖在制备预防和/或治疗爆发性肝炎药物中的应用。经过药理实验研究表明，本发明提供的海胆黄多糖，能显著提高爆发性肝炎小鼠的存活率，显著降低爆发性肝炎小鼠血清AST、ALT及肝组织MDA含量，增强肝脏SOD、GSH-Px、CAT活力及GSH活性，显著降低促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO水平，提高抗炎症因子IL-10水平，对肝脏损伤具有显著的保护作用，可望开发成新的保肝作用的药物或保健品。
【专利说明】具有保肝作用的海胆黄多糖及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多糖，具体涉及一种从光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus) 中提取分离得到的具有保肝作用的海胆黄多糖及其制备预防或治疗爆发性肝炎药物或保 健品中的应用，属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 爆发性肝炎又叫急性坏死型肝炎，临床上亦称急性重型肝炎或急性肝衰竭（acute liver failure，ALF)，是在慢性肝炎或肝硬化的基础上，机体对化学、物理、生物等因素的 免疫应答而导致肝细胞的损害、坏死，其发病率占肝炎发病率的0. 2-0. 4%，临床死亡率高， 尚缺乏特异性的治疗措施。急性肝炎是爆发性肝炎的主要原因是机体免疫应答异常，人体 免疫系统功能的变化与爆发性肝炎的发生、发展有着密切的关系。因此寻找肝炎的免疫治 疗方法已成为当前研宄的热点。目前国内外学者多应用D-半乳糖糖胺（D-galactosamine， D-GalN)造成原发性肝损伤，结合腹腔内注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)模拟肠源 性内毒素血症建立肝衰竭模型，其与HBV所致肝功能衰竭有较高的临床相关性，是目前比 较公认的急性肝衰竭动物模型之一。因此，LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭模型被广泛用于 研宄临床急性肝衰竭的潜在机制，开发应对内毒素有效的治疗药物。
[0003] LPS/D-GalN诱导的急性肝衰竭模型的相关机制如下，D-GalN是肝细胞的磷酸尿 嘧啶核苷（UTP)的干扰剂，进入体内后与磷酸尿苷结合形成磷酸尿苷-半乳糖胺，致使磷 酸尿苷耗竭，从而限制核酸、糖蛋白、脂糖等物质的生物合成，限制了细胞器及酶的生成和 补充，细胞器受损、膜损害、钙离子内流入细胞，造成肝细胞的弥漫性坏死和炎症。脂多糖 是G-细菌重要的致病物质，属病原性相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP)。LPS 通过激活单核-巨细胞系统（mononuclear phagacytic system， MPS)，引起IL-I β，IL-6, TNF-α等大量炎症因子的释放，造成肝细胞凋亡及炎性细胞的侵 润，最终导致全身过度炎症反应及脑、心、肾、肝等重要器官的衰竭。啮齿类动物多对LPS具 有自然抗性，而D-GalN能使LPS的炎症效应放大约104以上，大大减弱这种自然抗性，现多 用D-GalN联合小剂量LPS建立急性肝衰竭动物模型。
[0004] 目前临床上常用的抗肝炎保肝药物分为三类，即抗病毒药物、保护肝细胞的药物 和调节免疫功能的药物。这些药物中有些价格昂贵，有些具有较大的副作用，有的效果不显 著，有重复性差。因此，研发安全有效的预防或治疗急性肝衰竭药物成为当前药物研宄的 热点。
[0005] 海胆是属于棘皮动物门海胆纲的一种低等海洋无脊椎动物，主要有紫海胆、棘冠 海胆等品种。海胆黄是雌性海胆的生殖腺，在中医里被称为"云丹"。传统医学认为海胆黄 具有治疗瘰疬痰核、积痰不化、胸胁胀痛等证。海胆黄中含有丰富的蛋白质、多糖、脂肪酸及 各种微量元素，具有增强人体免疫力，防治心血管疾病的作用，具有极高的研宄价值。
[0006] 据 马益华(Yihua Ma, Yingying Xing，et al. Extraction, preliminary characterization and immunostimulatory activity in vitro of a polysaccharide isolated from Strongylocentrotus nudus eggs[J]· Carbohydrate Polymers，2014， 111，576-583)等人报道，海胆黄多糖是从产于黄渤海的光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus)中提取出来的一种多糖，对其理化性质进行了分析，利用化学分析和波谱技术对其 结构进行鉴定，表明海胆黄多糖具有α-1，4_糖苷键主链和α-1，3_糖苷键侧链，是从海胆 黄中分离到的一种结构新颖的葡聚糖。各国科学家早在七十年代初九对各类多糖进行研 宄，发现多糖对肿瘤、心血管疾病等都具有一定的疗效。1969年日本学者Chihara等首次 从香菇子实体的热水浸提物中分离到一种具有明显的抗肿瘤活性的多糖β-葡聚糖，并在 Nature上报到了他们的研宄成果。1978年香菇多糖进入临床应用，作为免疫调节剂和肿瘤 放化疗治疗的辅助药物，效果显著。目前，很多生物活性多糖，如云芝、茯苓、灵芝等多种真 菌中提取的多糖及许多动植物多糖均具有广泛的免疫活性和抗肿瘤活性。大量研宄表明， 多糖还具有抗氧化、抗炎、抗病毒、保肝等活性。
[0007] 本发明涉及的海胆黄多糖系从光棘球海胆中分离纯化得到均一多糖组分，高效液 相结果表明海胆黄多糖纯度达99%。药效学研宄结果表明，海胆黄多糖能显著提高爆发性 肝炎小鼠的存活率，显著降低AST和ALT。本发明所述的海胆黄多糖基于抗炎和抗氧化的保 肝药理学作用尚未记载和报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种从海胆黄（Strongylocentrotus nudus)中提取分离 的多糖。
[0009] 本发明另一个目的在于提供海胆黄多糖的制备方法及该多糖在调节机体免疫功 能药物和保肝药物中的应用，尤其是作为预防或治疗爆发性肝炎药物的应用。
[0010] 目前文献公开的制备方法主要包括：光棘球海胆黄脱脂、热水浸提、木瓜蛋白 酶-Sevage除蛋白、醇沉、Cellulose DE-52离子交换柱层析、Sephacryl-400凝胶柱层析、 真空干燥，本发明在此技术上进行如下改进，采用性能更好的DEAE Sepharose Fast Flow 填料替换现有的在Cellulose DE-52填料，在DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析 前进行超滤除杂，同时在Sephacryl-400凝胶柱层析后采用超滤替代现有的透析，在整个 分离纯化过程中使用AKTA纯化设备。本发明的方法分离得到海胆黄多糖产率高，纯度高， 制备成本低，适合规模化生产。
[0011] 技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
[0012] 具有保肝作用的海胆黄多糖，是主链由α-1，4-糖苷键组成，侧链由α-1，3-糖苷 键组成的重复单元结构，所述的重复结构单元结构如下：
[0013]
【权利要求】
1. 本发明提供了一种海胆黄多糖的制备方法和它的保肝作用；它能抗炎和抗氧化，抑 制肝细胞凋亡和坏死，能保护肝细胞和肝干细胞，增强肝细胞抵抗损害的能力和保护肝功 能等作用。
2. 根据权利要求1所述的海胆黄多糖的制备方法，其特征在于按如下步骤实现： (1) 原料预处理：将光棘球海胆切开，小心剥离海胆黄，纱布过滤除去水分，向海胆黄 中加入等体积的丙酮进行脱脂处理，得到海胆黄丙酮粉； (2) 热水浸提：海胆黄丙酮粉经过90°C热水浸提5小时，浸提三次，减压浓缩到五分之 一的体积； (3) 脱蛋白：向步骤（2)中的浓缩液中加入0.6%的木瓜蛋白酶，60°C酶解20小时， 90°C加热15min ;用Sevage法除去提取液中的蛋白质，50°C减压蒸馏除去有机试剂并浓缩 提取液； (4) 醇沉：向步骤（3)中的去蛋白液中缓慢加入5倍体积预冷至4°C的无水乙醇，并在 4°C下静置过夜沉淀多糖，用无水乙醇洗涤沉淀3次，最后再用丙酮洗涤1次，真空常温干 燥，得到海胆黄粗多糖； (5) 超滤除杂：将步骤⑷中的粗多糖溶于水，将其制成50mg/ml的水溶液，离心取上 清；选择截留分子量为l〇〇k的超滤膜，超滤粗多糖溶液，除去色素等杂质； (6) DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱分级：将步骤（5)中的超滤液，经过平衡好 的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱，蒸馏水洗脱，分部收集，苯酷-硫酸法逐管测定 糖的含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分，冷冻干燥得到多糖CP ; (7) S印hacryl S-400凝胶柱分级：将步骤（6)中的多糖冻干粉溶于0.05mol/L NaCl溶 液配成20mg/ml，过0? 22um滤膜，经过Sephacryl S-400柱层析分离，用0? 05mol/L的NaCl 溶液洗脱，分部收集，硫酸-苯酚逐管检测糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分； (8) 超滤脱盐浓缩：选择截留分子量为100k的超滤膜对步骤（7)中收集的组分进一步 超滤脱盐和浓缩； (9) 冷冻干燥：将步骤（8)中的超滤液冷冻干燥，得到海胆黄多糖。
3. 权利要求2所述的海胆黄多糖的制备方法，其特征在于：所述海胆为光棘球海胆 (大连紫海胆），在DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱前采用超滤除杂，Sephacryl S-400凝胶柱后采用超滤脱盐替代现有的透析，该制备得到的海胆黄多糖分子量为 6. 78X 105Da〇
4. 权利要求1所述的具有保肝作用的海胆黄多糖在制备保肝药物制剂或保健品中的 应用，尤其是在预防或治疗爆发性肝炎药物或保健品中的应用。
5. 根据权利要求4所述的具有保肝作用的海胆黄多糖，其特征在于，将海胆黄多糖和 药学上可接受的载体制备成注射剂和粉针剂。
【文档编号】C08B37/00GK104497162SQ201510009047
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月5日 优先权日:2015年1月5日
【发明者】奚涛, 邢莹莹, 邱军, 陆圆圆, 周长林 申请人:中国药科大学