一种组成型表达碱性果胶酶的毕赤酵母菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种组成型表达碱性果胶酶的毕赤酵母菌株及其应用，属于基因工程
技术领域。
【背景技术】
[0002] 果胶酶是一种复合酶，能够将果胶聚合物分解成不饱和寡聚半乳糖醒酸。该酶分 布广泛，在部分寄生线虫、植物和微生物内都有发现。果胶酶应用广泛，已有40多年的工业 应用史。根据最适反应抑的不同将果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶PGL。其中酸性果胶 酶主要应用于澄清果汁果酒，提取果蔬汁，果实脱皮等方面。P化应用主要应用于纺织、食 品、造纸行业和环境领域。应用酶法作用上述领域相关反应具有环保、节约原料耗材和反应 条件溫和等优点。然而目前对PCiL进行分子改造研究较少，进行商品化的PCiL也很少。
[0003] 目前对碱性果胶酶研究比较多的菌株主要是毕赤酵母、枯草芽抱杆菌和大肠杆 菌。综合比较可表达碱性果胶酶的不同宿主，毕赤酵母表达蛋白易于纯化，产量高，使用较 为广泛。毕赤酵母中表达异源蛋白通常采用甲醇诱导的方式，运样可W使菌株生长期及生 产期分割开来，在前期实现菌体大量生长，在后期实现蛋白高效表达，但是诱导型菌株生产 时也存在诸多不利，如甲醇易挥发，有毒，容易造成安全及环境问题，另外当应用于食品行 业时，甲醇残留是要极力避免的。
[0004] 因此，如何避免甲醇的使用并提高碱性果胶酶的产量，是目前亟需解决的问题。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明实现使用组成型表达载体来完成碱性果胶酶在毕赤酵 母中组成型表达，实现碱性果胶酶更加安全有效生产，并保证了碱性果胶酶的产量。
[0006] 本发明提供了一种组成型表达碱性果胶酶的菌株，为表达碱性果胶酶基因的毕赤 酵母基因工程菌株。
[0007] 本发明的毕赤酵母基因工程菌，WPichia pastoris 05115为宿主、口64口2曰4为载 体表达氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的碱性果胶酶基因。
[000引在本发明的一种实施方式中，所述碱性果胶酶基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母基因工程菌的构建方法，如下：
[0010] (1)通过PCR方法获得祕性果胶酶基因；
[0011] (2)将步骤（1)获得的碱性果胶酶基因连接到毕赤酵母组成型表达载体pGAPZaA 上，得到重组质粒pGAPZaA-PGL
[0012] (3)将步骤(2)获得的重组质粒pGAPZaA-PGL转化PicMa pastoris GS115得到组 成型表达碱性果胶酶的基因工程菌株。
[0013]本发明还提供一种利用所述基因工程菌发酵生产碱性果胶酶的方法，是将基因工 程菌活化后接种到基本发酵培养基YTO中，于30°C、220rpm条件下连续培养。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，连续培养过程中每24h添加1%的葡萄糖，实现碱性 果胶酶的组成型连续表达。
[0015] 本发明还要求保护所述基因工程菌在食品、纺织或造纸方面的应用。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] 本发明的基因工程菌株PicMa pastoris GS115-pGAPZaA-P化实现了碱性果胶酶 在毕赤酵母中组成型表达，在基本培养基YH)中连续培养72h酶活达到25U ? ml/i，为碱性果 胶酶组成型生产奠定了基础。本发明的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用 聚半乳糖醒酸的0-1，4糖巧键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。
[001引说明书附图
[0019] 图1.克隆表达质粒图谱；其中泳道1为pGAPZaA，泳道2为pGAPZaA-PGL，泳道3为 pGAPZaA-PGL经Kpn I和Not I双酶切的产物；
[0020] 图2.碱性果胶酶SDS-PAGE分析；其中泳道1、2分别为Pichia pastoris GS115-pGAPZaA-PGL胞外样品及胞内样品。
【具体实施方式】：
[0021] 培养基：
[0022] 种子培养基YPD:膜蛋白腺20g ? [1、酵母粉IOg ? [1、葡萄糖20g ? [1。
[0023] 碱性果胶酶酶活测定：
[0024] 采用分光光度法测定。单位酶活定义:单位时间裂解聚半乳糖醒酸产生Iwnol的不 饱和聚半乳糖醒酸所用的酶量。酶活测定条件为:酶活力检测：发酵液SOOOrpm离屯、lOmin， 胞外PGL即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。P化反应体系：含0.2%聚半乳糖醒酸 (底物）的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol ? L-i，0.44mmol ? [1 的CaCl2，pH9.4)2血，待测样品20 化，无活性的酶液为空白对照。P化反应条件为:将反应体系置于45 °C下水浴15min，用3mL憐 酸溶液(0.03mol ? [I)终止反应，在235nm处测定吸光度值。
[00巧]实施例1:重组菌的构建及鉴定
[0026] 提取出发菌株质粒，设计引物，通过PCR的方法获得碱性果胶酶基因，将其克隆至 表达载体pGAPZaA上，获得重组质粒pGAPZaA-PGL(克隆表达质粒图谱见附图1)，将重组载体 转化Pichia pastoris GS115,经筛选鉴定获得重组菌株Pichia pastoris GS115-pGAPZaA-PGLo
[0027] 引物如下(序列分别如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示）：
[0028] PGL 上游：CTGCAGGGTACCGCTGATTTAGGCCACCAGACGT
[00 巧]PGL下游：AAATATGCGGCCGCTTAATTTAATTTACCCGCACCCG
[0030]毕赤酵母的转化采用电转化法。具体步骤如下：挑取酵母受体菌的单菌落接种于 25mL YPD液体培养基中，30°C摇床过夜；W5%接种量转接50mL YP的夜体培养基，30°C摇床 培养至OD = 1.3-1.5;4°C离屯、5000巧m，5min，弃上清；用50mL冰预冷无菌水将菌体重悬;4°C 离屯、5000rpm，5min，弃上清；用25mL冰预冷无菌水将菌体重悬；4°C离屯、5000;rpm，5min，弃上 清;再用5血Imol ? [1的冰预冷的山梨醇洗涂1次，重悬，4°C，500化pm离屯、5min，弃上清;加 入适量体积Imol ? 1/1的冰预冷的山梨醇，重悬;分装至无菌EP管中，每管80ul，W备转化。将 提取的重组表达载体pGAPZaA-P化用酶AvrII线性化，在80山酵母感受态细胞中加入用合适 酶切位点线性化的质粒I-扣g冰上放置15分钟，迅速加入0.2cm电击杯中（冰预冷），1500v电 击，迅速加入1血冰预冷的山梨醇，涂含有200ug ? mL-iZeocin的YPDS平板，培养3-4天后挑取 单克隆。
[0031] 实施例2:基因工程菌株的发酵及酶活测定
[0032] 培养方法:菌株在种子活化后接种到基本发酵培养基YPD，于3(TC、220rpm条件下 连续培养，每24h添加1%的葡萄糖，实现碱性果胶酶的组成型连续表达。
[0033] 对发酵上清酶活进行测定。酶活测定条件为:发酵液8000巧m离屯、lOmin，胞外PGL 即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。PCiL反应体系:含0.2%聚半乳糖醒酸(底物）的 甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol ? L-i，0.44mmol ? [1的CaCl2,抑9.4)2mL，待测样品20化，无活 性的酶液为空白对照。P化反应条件为:将反应体系置于45°C下水浴15min，用3mL憐酸溶液 (0.03mol ? [I)终止反应，在235nm处测定吸光度值。
[0034] 结果显示，本发明的组成型表达碱性果胶酶工程菌Pichia pastoris GS115-pGAPZaA-P化，实现了碱性果胶酶在毕赤酵母中组成型表达，在摇瓶中的酶活为25U ? mL-i (7化），该产量为在基本培养基YH)中的初始产量，在经过培养基优化及培养条件优化后极 有潜力实现碱性果胶酶高效连续工业化生产。
[0035] 实施例3:发酵产物蛋白电泳
[0036] 选用碧云天SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒配制12%分离胶和5%浓缩胶，具体操作方 法见产品说明书。样品与5X上样缓冲液W体积比4:1混合，沸水浴lOmin，冷却后上样。电泳 时，80V恒压电压，待指示剂进入分离胶后，电压调至150V，待指示剂至胶底时结束电泳。用 考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色，染色化后脱色(SDS-PAGE图谱见图2)。
[0037] 虽然本发明已W较佳实施例公开如上，但其并非用W限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该W权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pGAPZaA为载体，Pichia pa StOriSGS115为宿主表达氨基酸序列如SEQIDN0.2所示的碱性果胶酶基因。2. 根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述碱性果胶酶基因的核苷酸序列 如SEQ ID N0.1 所示。3. -种发酵生产碱性果胶酶的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的基因工程 菌。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法是将基因工程菌活化后接种至基 本发酵培养基YH)中，于30 °C、220rpm条件下连续培养。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，连续培养过程中每24h补加1 %葡萄糖。6. 权利要求1的基因工程菌生产得到的碱性果胶酶。7. 权利要求6的碱性果胶酶在食品、纺织、环境或造纸方面的应用。8. 权利要求1的基因工程菌在食品、纺织、环境或造纸方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种组成型表达碱性果胶酶的毕赤酵母菌株及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将碱性果胶酶基因克隆连接到毕赤酵母组成型表达载体pPGAZaA，并转化至Pichia pastoris GS115菌株中，经筛选鉴定得到一株不需诱导而组成型分泌表达碱性果胶酶的菌株GS115?pGAPZaA?PGL，该菌株在基本培养基YPD中表达碱性果胶酶的酶活为25U·mL?1(72h)，实现碱性果胶酶在毕赤酵母中组成型表达，后期再经过培养基及培养条件优化将实现碱性果胶酶高效连续生产，为碱性果胶酶的大规模连续生产奠定了良好的基础。本发明的碱性果胶酶可在碱性条件下催化通过反式消去作用聚半乳糖醛酸的α?1,4糖苷键裂解，广泛应用于食品、纺织和造纸等行业。
【IPC分类】C12N15/81, C12N9/88, C12N1/19, D06M16/00, A23L29/00, D21C5/00, C12R1/84
【公开号】CN105713850
【申请号】CN201610168307
【发明人】刘松, 陈双全, 陈坚, 堵国成
【申请人】江南大学