一种2-苯乙醇的生物制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种2-苯乙醇的生物制备方法，属于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002]2-苯乙醇，又称β-苯乙醇、二苯基乙醇，是一种具有玫瑰花香的芳香醇，其味淡雅细腻，多存在于玫瑰、水仙、百合、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、奶酪、饼干、葡萄酒等食品中的风味物质，该物质在碱性环境以及对空气的氧化作用稳定，其衍生酯类物质，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香产品。是一种具有玫瑰花香的芳香醇，其味淡雅细腻，多存在于玫瑰、水仙、百合、茉莉等植物精油中，2-苯乙醇也是面包、奶酪、饼干、葡萄酒等食品中的风味物质，该物质在碱性环境以及对空气的氧化作用稳定，其衍生酯类物质，如乙酸苯乙酯等也是重要的芳香产品。
[0003]目前生物转化生产2-苯乙醇的菌株主要集中在酵母。常见的2-苯乙醇酵母生产菌株包括:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，马克斯克鲁维酵母(KluyveromycesmarXianus)，解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)等。高浓度的2_苯乙醇(Log Pow =1.36)对微生物细胞有一定的毒性。研究表明浓度为2g/L的2-苯乙醇就能完全抑制马克斯克鲁维酵母的生长(Fabre CE,Blanc PJ,Goma G.Product1n of 2-phenylethyl alcoholby Kluyveromyces marxianus[J].B1technol Prog，1998，14:270-274.);2.5g/L 2-苯乙醇能使得酿酒酵母生物量降低75%，3g/L 2-苯乙醇几乎能完全抑制酿酒酵母菌株生长(Seward RJ1Willets MG1Dinsdale,et al.The effects of ethanol,hexan-l-ol,and 2-phenylethanol on cider yeast growth,viability,and energy status；Synergisticinhibit1n[J].J I Brewing.1996,102(6):439-443.)。最终导致2-苯乙醇的产率较低，发酵液中2-苯乙醇的浓度大都低于4g/L。
[0004]产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)是我国拥有自主知识产权的一株具有优良发酵性能的工业菌株，能在55%葡萄糖或15%NaCl的高渗透压培养基上正常生长繁殖，具有耐高渗和高抗逆性的特点。
【发明内容】
[0005]本发明为解决上述的技术问题，提供了一种以耐高渗透压的产甘油假丝酵母为生产菌株生产2-苯乙醇的方法。
[0006]—种2-苯乙醇的生物制备方法，步骤如下:
[0007](I)挑取I环产甘油假丝酵母接入种子培养基中，在30°C，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。
[0008](2)将步骤(I)得到的液态种子按4% (v/V)的接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度为30 0C，转速为500r/min，时间为50h，发酵结束。
[0009]根据本发明优选的，所述步骤(I)中种子培养基为酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水;根据本发明优选的，所述步骤(2)中发酵培养基为L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2P04 5g/L，酵母粉4g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，余量为水。
[0010]本发明的有益效果:
[0011]1.本发明所选的产甘油假丝酵母菌株2-苯乙醇耐受性高，可达4g/L。进一步克服了2-苯乙醇在发酵过程中对菌株的毒害作用，有利于该菌株在2-苯乙醇工业生产中的应用。
[0012]2.本发明所选的产甘油假丝酵母菌株具有2-苯乙醇产量高，转化率高的特点，经检测，该菌株可利用7g/L的L-苯丙氨酸生成5g/L的苯乙醇，转化率为0.71(g/g)。
【附图说明】
[0013]图1是产甘油假丝酵母在含不同浓度2-苯乙醇培养基中的生长情况。
[0014]图2是产甘油假丝酵母菌株产2-苯乙醇样品的气相色谱-质谱联用图谱。a是产甘油假丝酵母菌株产2-苯乙醇样品的气相色谱图；b是产甘油假丝酵母菌株产2-苯乙醇样品的质谱图。
[0015]图3是产甘油假丝酵母发酵合成2-苯乙醇的过程曲线。
【具体实施方式】
[0016]下面通过实施例对本发明进一步详细描述。
[0017]实例I
[0018]挑取I环产甘油假丝酵母接入种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30 0C，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按4%(v/v)的接种量接入含有不同浓度的2-苯乙醇培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，2-苯乙醇的浓度分别为Og/L，1.0g/L，2.0g/L，3.0g/L，3.5g/L，4.0g/L。装液量为50mL/250mL，控制培养温度为30°C，转速为200r/min，在不同时间取样测定酵母的生长量0D6Q()(附图1)。
[0019]实例2
[0020]挑取I环产甘油假丝酵母接入种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30 0C，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按4%(v/v)的接种量接入接入发酵培养基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2PO4 5g/L，无氨基酸酵母氮源YNB 0.17g/L,MgSO4.7H20 0.5g/L，余量为水)中，装液量为30mL/250mL，控制发酵温度为30 V，转速为200r/min，时间为50h，发酵结束。
[0021]产物确认采用气相色谱-质谱联用检测，将实施例2制得的发酵液4°C，10，000r/m离心lOmin，取上清液于分液漏斗，加入相同体积的正戊烷与环己烷的混合溶液(2:1，v: V)混匀，萃取过夜，将有机相添加无水硫酸钠脱水，取上清液供气-质联用检测。
[0022]气相色谱-质谱(GC-MS)仪(BrokerSC1N SQ，USA)，色谱柱DB-wax，( 30m X
0.25mm，0.25ym)，进样量0.2yL，载气为He，流速0.8mL/min，进样口温度为260 °C，柱温箱起始温度为50°C，保留lmin，以10°C/min程序升温至230°C，保留5min至终点。连接杆温度250°C，质量扫描范围33-400m/z，电离电压70eV。使用Nist 98谱库进行图谱检索。质谱离子图解析结果附图2所示。
[0023]实例3
[0024]挑取I环产甘油假丝酵母接入种子培养基(酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水)中，在30 0C，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。将得到的液态种子按4%(v/v)的接种量接入接入含有2.5L发酵培养基(L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2PO4 5g/L，酵母粉4g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，余量为水)的5L发酵罐中，控制发酵温度为30 0C，转速为500r/min，时间为50h，发酵结束。
[0025]发酵液中2-苯乙醇的测定方法，采用高效液相色谱法(HPLC)分析，具体如下:将发酵液10，000r/min离心，离心后再用0.45μηι微孔滤膜过滤处理，高效液相色谱仪(Agilent,USA)，色谱柱为C18柱(250mmX 4.6mm，10ym；Ailite，中国)，流动相为甲醇:水=50:50(v/V)，流动相流速0.7mL/min，柱温30°C，检测波长260nm，进样1yL检测。发酵结束后2-苯乙醇的浓度为5g/L(附图3)，转化率为0.71(g/g)。
[0026]以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种2-苯乙醇的生物制备方法，其特征在于，通过选取耐高渗透压的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)，转化L-苯丙氛酸发酵生产2_苯乙醇。2.如权利要求1所述2-苯乙醇的制备方法，其特征在于，所述的酵母菌株为耐高渗透压，同时对2-苯乙醇的耐受性可达4g/L的产甘油假丝酵母。3.如权利要求1或2所述2-苯乙醇的制备方法，步骤如下: (1)挑取I环产甘油假丝酵母接入种子培养基中，在30°C，200r/min条件下，振荡培养18h，得到液态种子。 (2)将步骤(I)得到的液态种子按4%(v/v)的接种量接入发酵培养基中，控制发酵温度为30 0C，转速为500r/min，时间为50h，发酵结束。4.如权利要求3的方法，其特征在于，所述步骤(I)中种子培养基为酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，余量为水。5.如权利要求3的方法，其特征在于，所述步骤(2)中发酵培养基为L-苯丙氨酸7g/L，葡萄糖90g/L，KH2P04 5g/L，酵母粉4g/L，MgS04.7H20 0.5g/L，余量为水。
【专利摘要】本发明公开了一种2?苯乙醇的生物制备方法。即选取耐高渗透压的产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes CCTCC M 93018)转化L?苯丙氨酸发酵生产2?苯乙醇。该酵母对2?苯乙醇的耐受性可达4g/L，有效克服了2?苯乙醇对宿主生产菌的生长抑制，2?苯乙醇的产量达到5g/L、转化率达到0.71(g/g)。本发明的制备方法具有操作方便、转化效率高、生产成本低、工业化应用前景广等特点。
【IPC分类】C12R1/72, C12P7/22
【公开号】CN105713933
【申请号】CN201610256845
【发明人】诸葛斌, 王玉芹, 陆信曜, 宗红
【申请人】江南大学