一种零背景的平末端克隆载体pUB857及其构建方法和应用与流程

本发明涉及一种零背景的平末端克隆载体pub857及其构建方法和应用，具体涉及一种用温敏型启动子ci857-pr控制毒素基因ccdb的表达以此作为反筛选标记的pub857克隆载体及其在基因克隆和基因文库构建中的应用，属于生物
技术领域：
。技术背景随着现代生物技术的发展，各种分子克隆技术应运而生。分子克隆技术，即在分子层次上克隆特定dna序列用以表达目标蛋白的方法，常采用酶切或pcr的方式获得目的dna片段，纯化后用体外重组的方法将目的dna序列插入克隆载体，而后通过转化方式将重组质粒导入适合的寄主菌中，如dh5α，dh10b等，再从筛选的宿主菌中提取和酶切鉴定所需的重组质粒，最终获得目的基因。基因的克隆一般采用下列技术：酶切—酶连、融合pcr以及同源重组。传统的重组克隆筛选依赖于繁琐耗时的菌落pcr或酶切验证，难以满足目前高通量基因筛选与功能验证的要求。采用毒素基因作为反筛选标记以避免空载体的干扰，能显著减少工作量和缩短工作时间。dna促旋酶是细菌中的一种2型拓扑异构酶，以四聚体的形式存在，分别由gyra和gyrb基因所编码的2个a亚基和2个b亚基所形成。该酶在dna分子由超螺旋状态变化成弛缓型状态的过程中起决定作用，是维持dna分子稳定存在所必须的一种酶。其中，ccdb是由101个氨基酸所编码的一种基因毒素蛋白，可与大肠杆菌dna促旋酶直接结合，使其失去活性，从而导致dna分子不会产生超螺旋，从而无法修复己切割的dna，最终导致细胞凋亡(bernardp,couturierm.cellkillingbythefplasmidccdbproteininvolvespoisoningofdna-topoisomeraseiicomplexes[j].journalofmolecularbiology,1992,226(3):735-745.)。温敏型启动子pr受阻遏蛋白ci857的调控，当温度低于30℃时，阻遏蛋白ci857能稳定地抑制ccdb基因的表达，而当温度在37℃时，阻遏蛋白ci857因热失活而导致毒素基因ccdb的表达(villaverdea,etal.fineregulationofci857-controlledgeneexpressionincontinuouscultureofrecombinantescherichiacolibytemperature[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,1993,59(10):3485-3487.)。技术实现要素：针对基因克隆中的实际问题和需求，本发明提供了一种零背景的平末端克隆载体pub857，该零背景平末端快速连接载体用温敏型启动子ci857-pr控制毒素基因ccdb的表达以此作为反筛选标记的pub857克隆载体，可以高效克隆平末端pcr产物和任何具有平末端的dna片段。本发明的技术方案如下：一种零背景的平末端克隆载体pub857，为利用pvuii酶切puc19质粒形成线性dna链，同时在酶切位点连接ccdb和ci857-pr形成的全长序列为seqidno.9的克隆载体，所述的ccdb开放阅读框上设计有smai酶切位点。进一步地，本发明还提供上述零背景的平末端克隆载体pub857的构建方法，包括引物设计、基因克隆和载体构建，通过合成引物pcr扩增ci857-pr目的片段和ccdb目的片段，并将puc19质粒dna用限制性内切酶pvuii进行酶切，回收线性化片段puc19，最后将ccdb、ci857-pr、线性化puc19片段进行连接，得到克隆载体pub857。本发明利用温敏性启动子元件ci857-pr控制细菌毒素基因ccdb的表达，并在ccdb开放阅读框上设计smai酶切位点，以用于克隆任意dna片段。当目的dna片段插入ccdb的smai酶切位点后会破坏原有毒素基因的表达，由此可使转化子在37℃正常生长，而自连产生的空载体，其转化子在37℃培养时会大量表达毒素基因ccdb，导致细胞凋亡，从而实现“零背景”的克隆效果。本发明的零背景平末端克隆载体pub857可用于克隆任意pcr产物，并且以ccdb作为反筛选标记时克隆阳性率可以达到100％。此外，该克隆载体也可用于基因组文库的高效构建，同时能有效避免空载体干扰，是后基因组时代高通量基因筛选与功能验证的一种有效工具。附图说明图1为pub857载体的酶切验证图，m表示marker，a表示pub857载体经ndei单酶切的条带，b表示pub857载体经ndei和pcii双酶切的条带。图2为构建完成的pub857质粒图谱。图3为dh5α/pub857分别在30℃(a)和37℃(b)的生长曲线。图4为dh5α/pub857分别在30℃(a)和37℃(b)培养平板上生长状况。图5为pub857-ble转化子的博莱霉素抗性验证结果，amp100(a)，ble50(b)。图6为采用pub857载体克隆蜡状芽孢杆菌16srrna基因的菌落pcr验证结果图。图7为采用pub857载体用于蜡状芽孢杆菌基因文库构建后的酶切图谱。具体实施方式为了进一步阐明本发明的适用范围，以下结合实施例和附图对本发明加以说明，但该载体的应用不局限本发明所定范围。本发明所述的质粒pcp20，puc19，e.colitop10f’以及大肠杆菌dh5α均由商业购买。实施例一：一种零背景的平末端克隆载体pub857的构建方法一种零背景的平末端克隆载体pub857的构建方法，包括以下步骤：(1)引物设计：人工设计合成特异性引物序列cifor：5’-tggccgattcattaatgcagaccagaacaccttgccgatc-3’；cirev：5’-gtgtaaaccttaaactgcatgctatacaacctccttagtacatgc-3’ccdbfor:5’-gcatgtactaaggaggttgtatagcatgcagtttaaggtttacac-3’；ccdbrev:5’-tcttcgctattacgccagctatattccccagaacatcagg-3’(2)pcr扩增：pcr反应体系配制如表1所示。表1pcr反应体系配制表试剂名称储备液溶度加入pcr反应体系的体积(μl)5×q5pcrbuffer5×105×enhancer5×10dntp10mmol/l1forwardprimer10μmol/l2.5reverseprimer10μmol/l2.5q5酶5u/μl0.5dna模板20ng/μl2ddh2o加ddh2o至终体积50μlpcr程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s,72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。采用pcp20质粒dna为模板和cifor/cirev引物用以扩增ci857-pr目的片段，而采用e.colitop10f’菌株的基因组dna为模板和ccdbfor/ccdbrev引物用以扩增ccdb目的片段。所述ccdb目的片段长度为346bp，ci857-pr目的片段长度为872bp。载体构建：将上述扩增的ccdb和ci857-pr目的片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并切胶回收。将puc19质粒dna用限制性内切酶pvuii进行酶切，胶回收线性化片段puc19。将ccdb、ci857-pr、puc19片段用gibsonassembly的方式进行连接，并将连接产物转化至大肠杆菌dh5α中，涂布在含有100μg/ml的氨苄青霉素lb平板上，于30℃培养18h，挑选克隆于氨苄青霉素液体培养基中，在30℃培养8h，提取质粒，并用限制性内切酶smai酶切验证，获得克隆载体pub857。琼脂糖凝胶电泳参见《分子克隆》中琼脂糖凝胶电泳的方法，胶回收采用qiagen胶回收试剂盒，化学转化法参见《分子克隆》中氯化钙制备和感受态转化大肠杆菌的方法。连接体系和方法参见gibsonassembly。质粒经ndei单酶切后的大小为3502bp的核酸片段，经ndei和pcii双酶切后的大小分别为2062bp和1440bp的核酸片段，验证图如图1所示。构建完成的pub857质粒图谱如图2所示。含有pub857质粒的大肠杆菌dh5α在30℃(a)及37℃培养时的生长曲线如图3所示。含有pub857质粒的大肠杆菌dh5α在30℃(a)及37℃(b)培养平板上生长状况如图4所示。实施例二：一种零背景的平末端克隆载体pub857用于克隆博莱霉素抗性基因的应用一种零背景的平末端克隆载体pub857用于克隆博莱霉素抗性基因的应用，包括以下步骤：(1)细菌培养：在氨苄100μg/ml的液体培养基中接种含有质粒pub857的dh5α，于30℃培养8h；在博莱霉素50μg/ml的液体培养基中接种含有质粒pdgicz的dh5α，于37℃培养8h。分别提取pub857和pdgicz两种质粒。(2)引物设计：人工设计合成特异性引物序列blefor：5’-tggtctgatcggatcctcag-3’blerev：5’-gttaggatccttgatatggc-3’(3)pcr扩增：pcr反应体系是5×q5pcrbuffer10μl，5×enhancer10μl，dntp(10mmol/l)1μl，引物(10μmol/l)各2.5μl，质粒dna(约20ng/μl)1μl，q5dna聚合酶(5u/μl)0.5μl，加h2o至50μl。pcr程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s,72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。采用pdgicz质粒dna为模板和blefor/blerev引物，用以扩增博莱霉素抗性基因(bler)，该目标dna片段为420bp。(4)载体酶切：将pub857质粒dna用限制性内切酶smai进行酶切，胶回收线性化片段pub857。(5)平末端连接：将线性化pub857与bler片段以摩尔比1:3的比例进行连接，在t4连接酶的作用下，于16℃连接1h，然后转化到dh5α化学感受态细胞中，于37℃培养12h即可。试验结果表明：采用ccdb基因作为筛选标记时，只有成功插入博莱霉素抗性片段的克隆可以在37℃的培养条件下存活，而自连的载体会因为ccdb基因的表达而凋亡；在转化的amp平板上随机挑选60个单克隆，于博莱霉素固体培养基上划线，结果显示利用ccdb作为筛选标记，使得阳性克隆率达到了100％，验证结果如图5所示。实施例三：一种零背景的平末端克隆载体pub857用于克隆蜡状芽孢杆菌16srrna基因一种零背景的平末端克隆载体pub857用于克隆蜡状芽孢杆菌16srrna基因，包括以下步骤：(1)细菌培养：在氨苄100μg/ml的液体培养基中接种含有pub857质粒的dh5α，于30℃培养8h；同时在lb液体培养基中接种蜡状芽孢杆菌，于37℃培养8h。分别提取pub857质粒dna和蜡状芽孢杆菌基因组dna。(2)引物设计：16s通用引物27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’(3)pcr扩增：pcr反应体系是5×q5pcrbuffer10μl，5×enhancer10μl，dntp(10mmol/l)1μl，引物(10μmol/l)各2.5μl，质粒dna(约20ng/μl)1μl，q5dna聚合酶(5u/μl)0.5μl，加h2o至50μl。pcr程序是98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s,72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸10min。采用蜡状芽孢杆菌基因组dna为模板和27f/1492r引物用以扩增大小为1.6kb的16srrna基因片段。(4)载体酶切：将pub857质粒dna用限制性内切酶smai进行酶切，胶回收线性化片段pub857。(5)平末端连接：将线性化pub857与16srdna片段以摩尔比1:3的比例进行连接，在t4连接酶的作用下，于16℃连接1h，然后转化到dh5α化学感受态细胞中，于37℃培养12h即可。试验结果表明：利用温度敏感型启动子ci857-pr来控制ccdb基因作为反向筛选标记，结果显示成功插入芽孢杆菌16srdna片段的克隆可以在37℃的培养条件下存活，自连的载体会因为毒素基因ccdb的表达而凋亡；在amp转化平板中随机挑选6个单克隆进行菌落pcr验证，验证结果为阳性，证明ccdb阳性克隆率为100％，电泳结果如图6所示。实施例四：一种零背景的平末端克隆载体pub857用于基因组文库构建的应用一种零背景的平末端克隆载体pub857用于基因组文库构建的应用，包括以下步骤：(1)细菌培养：在氨苄100μg/ml的液体培养基中接种含有质粒pub857的dh5α，于30℃培养8h；同时在lb液体培养基中接种蜡状芽孢杆菌，于37℃培养8h。分别提取pub857质粒和蜡状芽孢杆菌基因组dna。(2)载体酶切：将pub857质粒dna用限制性内切酶smai进行酶切，胶回收线性化片段pub857。(3)基因组dna酶切：将基因组dna用限制性内切酶alui进行部分酶切，胶回收dna片段。(4)平末端连接：将线性化pub857与经alui部分酶切的蜡状芽孢杆菌基因组dna以摩尔比1:3的比例进行连接，在t4dna连接酶的作用下，于16℃连接1h，然后转化到dh5α化学感受态细胞中，于37℃培养12h即可。试验结果表明：利用温度敏感型启动子ci857-pr来控制毒素基因ccdb作为反向筛选标记，成功插入dna片段的克隆可以在37℃的培养条件下存活，自连的载体会因为毒素基因ccdb的表达而凋亡；随机挑选10个克隆进行酶切验证，酶切图谱显示所有克隆均含有40kb左右插入片段(如图7所示)。采用pub857平末端载体用于基因文库构建时的连接效率可高达107cfu/μg。当前第1页12