用于癌症诊断的CDK4基因外显子基因群及诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及一组用于癌症诊断的CDK4基因外显子基因群及其引用，以及一种基于所述CDK4基因外显子基因群的癌症诊断试剂盒。

(二)

背景技术：

据世界卫生组织统计，目前癌症的死亡率已超过冠状动脉心脏病和脑卒中成为死亡率排名第一的慢性疾病，严重威胁人类健康。世界范围内，2012年全球新发癌症病例1410万，死亡820万，肺癌和乳腺癌分别位居男性和女性恶性肿瘤发病和死亡首位。癌症的发病机制依旧不明确，但与人口增长和老龄化、微生物感染、吸烟、饮食习惯、家族肿瘤史和环境污染等密切相关。我国恶性肿瘤发病率总体呈上升趋势，每年以3％-5％的速度递增。由于恶性肿瘤细胞具有容易侵袭和转移的特点，且临床就诊者多为中晚期患者，延误了早期治疗的最佳时机，导致治疗方法选择有限和治疗效果不理想。未经治疗的癌症患者五年生存率极低，约为0-14％，因此早期诊断、获得根治性切除是患者长期生存的唯一方式。

癌症诊断方法包括光学和形态学的检查等，但是由于肿瘤的发生和转移是一个多步骤，涉及到多个基因的过程，即使同一个肿瘤中也存在不同特性的细胞，生长速率，免疫特性和侵袭转移性不同，因此癌症诊断的准确度和灵敏度不高。随着癌症的发病机制的研究越来越广泛，分子生物标记物在其中的重要性越来越明显。这些标记物已成为癌症诊断和治疗的重要靶点。

Cyclin-Dependent Kinase 4(CDK4)基因位于12q13-q14，是细胞周期G1期的重要调控因子，属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族。抑制CDK4基因的表达可导致白血病细胞的终末分化，而CDK4基因的过表达则会导致细胞生长失去控制最终恶性转化。CDK4基因核苷酸序列共4721bp。其中包含8个外显子，分别是：Exon 1，1-273bp；Exon 2，274-510bp；Exon 3，511-646bp；Exon 4，647-814bp；Exon 5，815-924bp；Exon 6，925-975bp；Exon 7，976-1111bp；Exon 8,1112-2002。

基因扩增是指细胞内特定基因拷贝数特异性大量增加的现象，按扩增范围的不同进而分为全基因组扩增及特定基因簇的扩增，常见于生物发育及肿瘤发生等过程，是癌基因激活的主要机制。细胞内选择性复制DNA，从而产生大量的拷贝，最终可能导致基因产物的过表达，过表达程度随肿瘤类型的不同而存在差异。发明人在癌症患病人群中发现，与癌旁正常组织相比，癌组织中的CDK4基因的一个或多个外显子发生扩增，即外显子不同程度的扩增引起CDK4基因核苷酸序列的改变，进而导致表达产物增加，这将有助于恶性肿瘤的精确诊断。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一组用于癌症诊断的CDK4基因外显子基因群及其引用，以及一种基于所述CDK4基因外显子基因群的癌症诊断试剂盒。

本发明采用的技术方案是：

一组用于癌症诊断的CDK4基因外显子基因群，由以下基因序列组成：

SEQ ID No.1所示的Exon 1片段：

ccccatacacccgagctcggtccggagcagctggacgcagagggcccgaccatagacacaggccgcaagctagagaggccccctcacccccaccctcaccatgtgaccagctgccaaagag

SEQ ID No.2所示的Exon 2片段：

gagccagtggctgaaattggtgtcggtgcctatgggacagtgtacaaggcccgtgatccccacagtggccactttgtggc

cctcaagagtgtgagagtccccaatggaggaggaggtggaggaggccttcccatcagcacagttcg

SEQ ID No.3所示的Exon 3片段：

gatcgtttcggctggcaagcctggtgggggtgccttgtccagatatgtccttaggtcctggtctacatgctcaaacaccagggttaccttgatctcccggtcagtt

SEQ ID No.4所示的Exon 4片段：

agcttgactgttccaccacttgtcaccagaatgttctctggcttcagatctcggtgaacgatgcaattggcatgaaggaa

atctaggcctcttagaaactggcg

SEQ ID No.5所示的Exon 5片段：

tcgacgaaacatctctgcaaagatacagccaacactccacatgtccacaggtgttgcatatgtggactgcagaagaacttcgggagctcggtaccagagtgta

SEQ ID No.6所示的Exon 6-7片段：

tcccgactcctccatctcaggtaccaccgactgcactgggcggggccctctggggggaaaggctccacggggcagggatacatctcgaggccagtcatcctctggaggcagcccaatcaggctgtgggggacaggagaactctggtcaggagggtcctccagttcccatccccatgggcagagccagttgccatcctgggttcagcagaaagaggactcagaatagaaaatctttttctc

ccatgttggtcacttactcaaagattttgcccaactggtcggcttcagagtttccac

SEQ ID No.7所示的Exon 8片段：

tccaaatcgcacaatggcaaagccaaacagaggaagaaacattaaaaaaaaaaaaaagaccattatttctttgttttgtt

tttcctgtataaaaaaggaccccaaatataaaggtagggaaagggacaagagggaa

Exon 1完整序列如下：

Exon 2完整序列如下：

Exon 3完整序列如下：

Exon 4完整序列如下：

Exon 5完整序列如下：

Exon 6完整序列如下：

gcctct cttctgtgga aactctgaag ccgaccagtt gggcaaaatc tttga

Exon 7完整序列如下：

Exon 8完整序列如下：

本发明还涉及所述的CDK4基因外显子基因群在制备癌症诊断试剂盒中的应用。

具体的，所述应用为：以所述CDK4基因外显子基因群为基因诊断标记物，设计相应扩增引物，添加相应PCR扩增试剂组成癌症诊断试剂盒。

本发明还涉及基于所述CDK4基因外显子基因群的癌症诊断试剂盒，主要包括PCR特异性扩增引物和PCR反应试剂，其特征在于所述PCR特异性扩增引物序列如下：

Exon 1：

上游引物：5’-CTCTTTGGCAGCTGGTCAC-3’；

下游引物：5’-CCCCATACACCCGAGCTC-3’；

Exon 2：

上游引物：5’-AGTGGCTGAAATTGGTGTCG-3’；

下游引物：5’-CGAACTGTGCTGATGGGAAG-3’；

Exon 3：

上游引物：5’-AACTGACCGGGAGATCAAGG-3’；

下游引物：5’-GATCGTTTCGGCTGGCAAG-3’；

Exon 4：

上游引物：5’-CGCCAGTTTCTAAGAGGCCT-3’；

下游引物：5’-AGCTTGACTGTTCCACCACT-3’；

Exon 5：

上游引物：5’-TACACTCTGGTACCGAGCTC-3’；

下游引物：5’-TCGACGAAACATCTCTGCAA-3’；

Exon 6-7：

上游引物：5’-GTGGAAACTCTGAAGCCGAC-3’；

下游引物：5’-TCCCGACTCCTCCATCTCA-3’；

Exon 8：

上游引物：5’-TTCCCTCTTGTCCCTTTCCC-3’；

下游引物：5’-TCCAAATCGCACAATGGCAA-3’。

所述试剂盒通过检测CDK4基因外显子扩增及该基因表达产物的表达水平进行诊断，所述试剂盒主要包括：检测CDK4基因不同外显子扩增的特异性引物(RT-PCR诊断试剂盒或荧光定量PCR诊断试剂盒)，以及检测用试剂(相应PCR反应所需要的试剂)。所述癌症诊断包含判断受试者是否已患癌症，也包含判断受试者是否存在患有癌症的风险。

所述试剂盒可包括扩增内源对照基因GAPDH的特异性引物：

上游引物：5’-AACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3’；

下游引物：5’-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3’。

所述试剂盒还可包括CDK4基因外显子基因群标准品：

SEQ ID No.1所示的Exon 1片段；

SEQ ID No.2所示的Exon 2片段；

SEQ ID No.3所示的Exon 3片段；

SEQ ID No.4所示的Exon 4片段；

SEQ ID No.5所示的Exon 5片段；

SEQ ID No.6所示的Exon 6-7片段；

SEQ ID No.7所示的Exon 8片段。

以CDK4基因外显子基因群标准品作为对照，可对待测样本中CDK4外显子扩增进行定量检测。所述癌症优选为肠癌或乳腺癌。

所述基因检测试剂盒PCR反应试剂为常规PCR反应所需试剂，包括dNTP、Mg²⁺、Taq酶(热启动酶)、PCR缓冲液、SYBR GreenⅡ等。

本发明首次发现了CDK4基因外显子不同程度的扩增与癌症密切相关，通过检测受试者组织中CDK4的基因外显子的扩增程度，可以判断受试者是否已患有癌症或是否存在患有癌症的风险，从而给临床医师提供预防或治疗方案。

本发明的有益效果主要体现在：本发明发现了一种癌症新的分子诊断指标CDK4基因外显子扩增，提供了其在制备癌症诊断试剂盒中的应用，以及一种癌症诊断试剂盒，与传统的检测手段相比，分子标志物的诊断更及时、更特异，从而提高癌症患者的5年生存率，降低死亡率，应用前景广阔。

(四)附图说明

图1为乳腺癌和肠癌肿瘤标本中CDK4基因Exon 2的扩增曲线的代表图；

图2为CDK4基因Exon 1-8在5对乳腺癌组织和对应的癌旁正常乳腺组织中的扩增情况(**P<0.01)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：荧光定量PCR法检测CDK4基因Exon 2在不同癌组织(肠癌和乳腺癌)和对应的癌旁(肠及乳腺)正常组织的扩增情况

1、分别收集1对肠癌和乳腺癌癌组织和对应癌旁肠及乳腺正常组织的样本，所有组织标本均由厦门大学附属第一医院标本库提供，每例患者标本均有明确的诊断记录，并通过伦理委员会的同意，收集标本后冻存于液氮。

2、DNA样品的制备

(1)样品的前处理：从液氮罐中取出样本，将30mg样本放入2ml的无菌EP管中，加入600μL DNA提取液和20mg/ml蛋白酶K，用消毒的剪刀充分剪碎后65℃温育1小时。

(2)12000rpm离心4min，取上清，加入新的1.5ml EP管。

(3)加入600μL酚氯仿后剧烈颠倒混匀30s，12000rpm离心4min，取上层含有DNA的水相，加入新的1.5ml EP管。

(4)加入700μL的异丙醇和150μL 3M的乙酸钠，剧烈颠倒混匀30s，12000rpm离心4min。弃上清，可观察到管底有白色DNA沉淀。

(5)洗涤：加入1mL 75％乙醇(灭菌双蒸水配制)，12000rpm离1min，弃上清后重复该步骤。

(6)干燥：吸干管中的乙醇，室温下干燥DNA沉淀2～3min。

(7)溶解：加入50μL灭菌双蒸水溶解DNA沉淀。

(8)测定浓度：用Nanodrop 2000紫外分光光度计检测DNA样品的浓度。

3、荧光定量PCR检测：

(1)在八连管中，每管配制荧光定量PCR反应液，总体积20μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ10μL，CDK4Exon 2上游引物0.8μL，CDK4Exon2下游引物0.8μL，ROX DyeⅡ0.4μL，DNA模板2μL，RNase Free dH₂O6μL。

(2)封盖后放入PCR检测仪(ABI ViiA7)中，程序设定为：50℃2min，95℃10min，接着40个循环：95℃15s，58℃60s。

4、结果：荧光定量PCR扩增曲线图显示，与对应的远处正常组织相比，CDK4基因Exon 2在肠癌和乳腺癌癌组织中出现不同程度的扩增(图1)。

实施例2：荧光定量PCR法检测CDK4基因Exon 1-8在5对乳腺癌癌组织和对应的癌旁正常组织的扩增情况

1、收集5对乳腺癌癌组织和对应癌旁正常组织的样本，所有组织标本均由厦门大学附属第一医院标本库提供，每例患者标本均有明确的诊断记录，并通过伦理委员会的同意，收集标本后冻存于液氮。

2.DNA提取和荧光定量PCR方法同实施例1。

3、数据分析：实验均按照重复3次完成，采用相对定量2^-△△Ct(△△Ct＝(癌组织CDK4Exon1-8Ct值-癌组织Exon1-8GAPDH Ct值)-(正常组织CDK4Exon1-8Ct值-正常组织Exon1-8GAPDH Ct值))的方法进行统计分析，GAPDH作为内参基因，数据利用GraphPad 5.0软件进行分析，所有统计结果均以P<0.05认为存在显著差异。

4.结果：与正常乳腺组织相比，癌组织CDK4基因Exon 1-7发生不同程度的显著的扩增，Exon 8的变化无统计学意义(图2)。

上述实施例的介绍仅用来理解本发明的方法及其核心内容。特别需要指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行改进和修饰，但这些改进和修饰也将属于本发明权利要求的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学附属第一医院

厦门稀土材料研究所

<120> 用于癌症诊断的CDK4基因外显子基因群及诊断试剂盒

<130>

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

gtgctgcgaa gtggaaacca tccgccgcgc gtaccccgat gccaacctcc tcaacgaccg 60

ggtgctgcgg gccatgctga aggcggagga gacctgcgcg ccctcggtgt cctacttcaa 120

<210> 2

<211> 146

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

gagccagtgg ctgaaattgg tgtcggtgcc tatgggacag tgtacaaggc ccgtgatccc 60

cacagtggcc actttgtggc cctcaagagt gtgagagtcc ccaatggagg aggaggtgga 120

ggaggccttc ccatcagcac agttcg 146

<210> 3

<211> 106

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

gatcgtttcg gctggcaagc ctggtggggg tgccttgtcc agatatgtcc ttaggtcctg 60

gtctacatgc tcaaacacca gggttacctt gatctcccgg tcagtt 106

<210> 4

<211> 104

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

agcttgactg ttccaccact tgtcaccaga atgttctctg gcttcagatc tcggtgaacg 60

atgcaattgg catgaaggaa atctaggcct cttagaaact ggcg 104

<210> 5

<211> 103

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

tcgacgaaac atctctgcaa agatacagcc aacactccac atgtccacag gtgttgcata 60

tgtggactgc agaagaactt cgggagctcg gtaccagagt gta 103

<210> 6

<211> 297

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

tcccgactcc tccatctcag gtaccaccga ctgcactggg cggggccctc tggggggaaa 60

ggctccacgg ggcagggata catctcgagg ccagtcatcc tctggaggca gcccaatcag 120

gctgtggggg acaggagaac tctggtcagg agggtcctcc agttcccatc cccatgggca 180

gagccagttg ccatcctggg ttcagcagaa agaggactca gaatagaaaa tctttttctc 240

ccatgttggt cacttactca aagattttgc ccaactggtc ggcttcagag tttccac 297

<210> 7

<211> 136

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

tccaaatcgc acaatggcaa agccaaacag aggaagaaac attaaaaaaa aaaaaaagac 60

cattatttct ttgttttgtt tttcctgtat aaaaaaggac cccaaatata aaggtaggga 120

aagggacaag agggaa 136

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<212> DNA

<213> Unknown

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<223> 人工序列

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ctctttggca gctggtcac 19

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<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

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<223> 人工序列

<400> 9

ccccatacac ccgagctc 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

agtggctgaa attggtgtcg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

cgaactgtgc tgatgggaag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

aactgaccgg gagatcaagg 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 13

gatcgtttcg gctggcaag 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 14

cgccagtttc taagaggcct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 15

agcttgactg ttccaccact 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

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<223> 人工序列

<400> 16

tacactctgg taccgagctc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 17

tcgacgaaac atctctgcaa 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 18

gtggaaactc tgaagccgac 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

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tcccgactcc tccatctca 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 20

ttccctcttg tccctttccc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 21

tccaaatcgc acaatggcaa 20