本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种活体箱形水母蛋白类毒素的粗纯方法。
背景技术：
箱形水母（chironexfleckeri）属腔肠动物门、钵水母纲、立方水母目、箱形水母科。箱形水母是一种淡蓝色的透明水母，形状像个箱子，有4个明显的侧面，有数十根触须，每条触须上布满了储存毒液的刺细胞，是世界上毒性最强的水母，根据美国国家科学基金会提供的数据，单是在菲律宾，每年就有20～40人死于箱形水母的毒刺。箱形水母毒素具有溶血活性、神经毒性、皮肤肌肉毒性，是极具潜力的海洋药物开发资源，但由于其巨大的毒性，为进一步研究及未来生产带来困难，如何安全获得其毒素也是各国科学家研究的重点之一。
目前获得水母毒素的方法主要是用自动降解法来分离刺丝囊，将水母触角在4℃下，一定量的海水或nacl溶液中放置1～4天，等待水母自动降解后，采用离心法回收得到小球状的刺丝囊，此法得到的刺丝囊细胞最纯净，活性最好，中国专利申请号201010149779.5名称为一种水母毒素去溶血毒性的方法，即采用此方法获得水母粗毒提取液。但此法具有较多缺点，如水母触角只能一次性利用，不能循环持续使用，即便水母触手可以再生，也需7-10天才能再生完成，耗时较长，不利于工业化水母毒素采集的实现。而水母在有触手的情况下，再生刺丝囊仅需2天时间，如果能单独采集刺丝囊，不损伤水母触手，那将缩短采集周期，有利于实现连续化、工业化生产，本发明正是为实现这一目的而产生。
技术实现要素：
本发明提供一种活体箱形水母蛋白类毒素的粗纯方法。
为实现上述发明目的，本发明公开的技术方案特征包含如下步骤：
a)淀粉凝固体制备：淀粉20～30%（w/w），增稠剂0～20%（w/w），纯化水补齐至100%（w/w），加热煮沸，期间不停搅拌，待无沉淀时，停止加热，入模（模底铺设尼龙纱网）晾至室温，即为淀粉凝固体；
b)覆网：在淀粉凝固体未完全凝固时，外测使用尼龙纱网固定，以增加淀粉凝固体的抗破损性能；
c)毒素收集：使用覆网淀粉凝固体模仿水母食物，接近箱形水母，诱导水母对其进行防御和捕猎，等待一段时间后回收覆网淀粉凝固体；
d)酶解：对回收的覆网淀粉凝固体进行解剖，取外层厚度1～5mm淀粉凝固体压碎，使用组氨酸修饰的淀粉酶，于20～35℃进行酶解，加入一定量的纯化水，酶解至无大块淀粉固体残留时停止，获得酶解液；
e)离心：保持4℃，对酶解液进行离心，以除去未酶解的残渣，保留离心上清液；
f)镍柱层析：保持4℃，将上清液进行循环上样于镍柱层析柱，保留最终的滤出液，除去淀粉酶，最后洗脱层析柱回收淀粉酶；
g)超滤除杂：保持4℃，使用截留量为1kd的水性膜对步骤f）中的滤出液进行超滤，除去盐、葡萄糖等小分子杂质，并对水母毒素进行浓缩，保留超滤液即为水母毒素粗纯液。
所述的淀粉包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉、红薯淀粉。
所述的增稠剂包括但不限于黄原胶、卡拉胶、明胶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：只对箱形水母刺丝囊及其毒性物质进行采集，对水母损害小，其再生时间短，仅需2天，生产可持续性极具优势，为未来工业化利用水母毒素提供了条件；使用酶法分解淀粉凝固体时间较水母自溶时间更短，利于缩短生产时间；收集的刺丝囊及其毒素，受外界蛋白污染可能性小，初步纯化分离出的蛋白仅为水母毒素蛋白，为后续进一步纯化创造良好的基础。
具体实施方式
实施例1：
将玉米淀粉25g、黄原胶3g、纯化水72g加入不锈钢锅中加热煮沸，不停搅拌至无沉淀后，倒入长20cm，宽12cm，深2cm的不锈钢方槽中冷却凝固，方槽中铺上已洗净网孔孔径为2mm的尼龙纱网，未凝固完全时，再覆盖上一层尼龙纱网，凝固后，小心脱模。将覆网淀粉凝固体固定在不锈钢或塑料延长棍上，接近自然水域中或人工养殖的活体箱形水母8只，轻微搅动，诱导水母对其进行防御行为，每只收集10min后，回收覆网淀粉凝固体，用纯化水稍冲洗，小心撕取下尼龙网，将两面5mm厚度的淀粉凝固体用不锈钢刀切下，使用不锈钢板将其压碎完全，加入200ml纯化水，加入组氨酸修饰的α-淀粉酶10000u，设置温度25℃，酶解5h，无大块淀粉固体残留，4℃离心，保留上清液，向上清液中加入tris-hcl，使终浓度为20mmol/l，加入nacl，使终浓度为5mol/l，使用金属镍亲和层析法进行纯化，流速1ml/min，重复过柱一次，以除去淀粉酶。于4℃对回收的过柱液进行超滤浓缩，以除去淀粉酶水解出的单糖及多糖以及缓冲液中的盐，使用截留量为1kd的水性纤维素膜，向超滤液中加入纯化水1l，浓缩至体积为50ml时停止浓缩，即为水母毒素粗纯液。
实施例2：
将土豆淀粉26g、卡拉胶2g、纯化水72g加入不锈钢锅中加热煮沸，不停搅拌至无沉淀后，倒入长20cm，宽12cm，深2cm的不锈钢方槽中冷却凝固，方槽中铺上已洗净网孔孔径为2mm的尼龙纱网，未凝固完全时，再覆盖上一层尼龙纱网，凝固后，小心脱模。将覆网淀粉凝固体固定在不锈钢或塑料延长棍上，接近自然水域中或人工养殖的活体箱形水母6只，轻微搅动，诱导水母对其进行防御行为，每只收集10min后，回收覆网淀粉凝固体，用纯化水稍冲洗，小心撕取下尼龙网，将两面5mm厚度的淀粉凝固体用不锈钢刀切下，使用不锈钢板将其压碎完全，加入300ml纯化水，加入组氨酸修饰的α-淀粉酶10000u，设置温度25℃，酶解4h，无大块淀粉固体残留，4℃离心，保留上清液，向上清液中加入tris-hcl，使终浓度为20mmol/l，加入nacl，使终浓度为5mol/l，使用金属镍亲和层析法进行纯化，流速1ml/min，重复过柱一次，以除去淀粉酶。于4℃对回收的过柱液进行超滤浓缩，以除去淀粉酶水解出的单糖及多糖以及缓冲液中的盐，使用截留量为1kd的水性纤维素膜，向超滤液中加入纯化水1l，浓缩至体积为50ml时停止浓缩，即为水母毒素粗纯液。