一种数字PCR芯片的制作方法

本发明涉及数字pcr技术领域，特别是数字pcr芯片。

背景技术：

聚合酶链式反应（pcr）是一种可将dna片段体外扩增的分子生物技术，数字pcr(dpcr)是一种核酸分子绝对定量的新技术，它不依赖标准曲线和参照样本，无需设对照，可直接检测出目标分子的拷贝数。dpcr原理类似于计算机科学中的“分治算法”，将低模板的试剂分配到大量微孔中，经过统计学分析，大部分微孔中没有或者只有1个目标分子，扩增完成后，通过光学检测模块计数，即为初始模板量。相比于传统的定量pcr，dpcr具有更高的灵敏度、特异性、高耐受性和精确性，此项技术已经在极微量核酸样本检测、cnv分析和复杂样本基因表达检测等方面有着广泛应用。

数字pcr可以有两种检测方法。

其一为乳滴法检测模板量，将含有核酸分子的反应体系形成上万个微滴，微滴体积约为1nl左右，遵循统计学规律，每个微滴最多含有1个核酸分子（个别差异除外），把每个微滴作为一个pcr反应容器，经过循环扩增后，使用微滴分析仪，逐个检验每个微滴是否扩增，对扩增的微滴进行计数，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的比例，计算出模板的拷贝数。这种方法，生成微滴时误差较大，影响检测结果，且成本高。

其二为使用微流控芯片检测，微流控原理为通过外界施加压力将试剂挤入芯片孔道内，但驱动结构复杂、占用空间较大、成本高，流体通道阻力大，很容易有气体残留，这种方式一般需要试剂留有大量余量才能注满芯片，对试剂造成极大的浪费。

材料需要综合考虑导热性、耐热性、生物相容性、透光性，可选用硅和玻璃，这两种材料导热性和透光性都非常好，可以使用传统的微加工技术，如湿法刻蚀、干法刻蚀、深度反应离子刻蚀、光学刻蚀等，也可选择塑料和聚合物，相比于硅和玻璃更容易加工制造，可选择传统的微机械加工和快速成型法，如注塑。

本发明是一种无需外接驱动装置、避免微孔间交叉污染、避免液体蒸发、减少试剂用量、成本低的数字pcr芯片。

技术实现要素：

本发明提供了一种数字pcr芯片。

在一些实施例中，数字pcr芯片结构主要包括：基座、旋转上盖、微阵列反应仓、密封层、密封圈、弹力卡扣、转轴一、转轴二、扭簧，其中基座与旋转上盖之间由转轴一连接，可使两者相互转动；转轴二通过扭簧与基座和弹力卡扣之间相连，可使弹力卡扣与基座之间相互转动。

在一些实施例中，基座上置有微阵列反应仓。

在一些实施例中，微阵列反应仓表面分布400~1亿个微孔，其制作材料包括树脂、塑料、玻璃、石英、硅片、金属和陶瓷，优选硅片，其有益效果是，导热性能好、生物相容性好、适用多种加工方法；

在一些实施例中，微孔容积为0.5pl~1μl，优选4pl~1nl，根据统计学分析，可视为每个微孔内的dna数量≤1。

在一些实施例中，微阵列反应仓分隔为1~100个分区，用于1~100个样品同时进行数字pcr反应。

在一些实施例中，微孔形状为圆形、方形、三角形、六边形、多边形，排布为横纵或密排。

在一些实施例中，微阵列反应仓四周有一凹槽，其有益效果是存放多余的反应试剂。

在一些实施例中，微阵列反应仓的加工方法包括光刻蚀、玻璃陶瓷金属刻蚀、高精度模具注塑、机加工切削、3d打印、沉积和粘合等，优选光刻蚀。

在一些实施例中，微阵列反应仓具有功能化修饰基团或进行表面亲水处理，其有益效果是，使试剂顺利进入微孔内，避免产生气泡。

在一些实施例中，旋转上盖上置有密封层，密封层为低熔点固态直链烷烃。其中低熔点固态直链烷烃常温状态下为固体，其熔点为30℃~70℃，融化后其密度小于反应试剂，不与试剂互溶，不与试剂发生反应，其材料可以是石蜡、固体油脂。

在一些实施例中，密封层或微阵列反应仓外侧有密封圈，其有益效果是，将融化后的固态直链烷烃密封在微阵列反应仓上方。

在一些实施例中，扭簧两端分别固定在旋转上盖和基座上，其有益效果是，自由状态下弹力卡扣压在基座上。

本发明的优势在于，与传统微流控芯片相比，无需外接驱动装置、节省试剂、避免交叉污染、避免液体蒸发、操作简单。

附图说明

图1表示本发明实施例的整体结构示意图。

图2表示本发明实施例的微阵列反应仓结构示意图。

图3表示本发明实施例的加样过程说明图。

图4表示本发明实施例的加样完成示意图。

具体实施方式

以下将实施例和附图相结合，具体说明本发明的技术方案。

本实施例数字pcr芯片为一次性耗材。结构包括基座（11）、旋转上盖（12）、微阵列反应仓（15）、密封层（14）、密封圈（17）、弹力卡扣（18）、转轴一（13）、转轴二（16）、扭簧（19）。其中基座（11）与旋转上盖（12）之间由转轴一（13）连接，可使两者相互转动；转轴二（16）通过扭簧（19）与基座（11）和弹力卡扣（18）之间相连，可使弹力卡扣（18）与基座（11）之间相互转动。

本实施例中，旋转轴一（13）内置滑动轴承，其有益效果是，提高旋转上盖与基座的转动精度。

本实施例中，基座（11）上置有微阵列反应仓（15），其中微阵列反应仓材料为硅片，外形尺寸为25mm×25mm，其中心20mm×20mm表面通过光刻蚀法均匀分布30625个微孔（151），微孔直径0.1mm，深度0.05mm，容积约为0.4nl。微孔四周有一圈0.2mm宽的凹槽（152），用于存放多余的反应试剂，避免试剂溢出。

本实施例中，使用bsa溶液对微阵列反应仓进行亲水处理，可使试剂顺利进入微孔，避免产生气泡。

旋转上盖（12）上置有密封层（14）,密封层为低熔点固态直链烷烃。其中低熔点固态直链烷烃常温状态下为固体，其熔点为30℃~70℃，融化后其密度小于反应试剂，不与试剂互溶，不与试剂发生反应，其材料可以是石蜡、固体油脂，本实施例中低熔点固态烷烃选择石蜡（sigma，货号327204），其熔点为53℃~57℃。

本实施例中，密封层（14）外侧有密封圈（17），密封圈为硅胶材质。

本实施例中，使用3个扭簧（19），每个扭簧两端分别固定在旋转上盖（12）和基座（11）上。

本实施例的加样过程为：将数字pcr芯片（10）水平放置，将试剂（31）滴在微阵列反应仓上，用手旋转旋转上盖（12），使旋转上盖（12）与基座（11）的夹角α逐渐变小，当密封层（14）与试剂（31）接触后，夹角α变小的同时旋转上盖（12）驱使液体进入微孔（151）中；当夹角α接近0度时，密封层（14）可覆盖在微孔区域的上方，手动按起弹力卡扣（18），使弹力卡扣（18）压紧旋转上盖（12），通过扭簧（19）的弹力，挤压密封圈，使其变形后，实现密封。当使用该数字pcr芯片进行pcr扩增时，随着温度升高至53℃，石蜡融化后位于微阵列反应仓上层与密封圈之间，起到密封作用，避免了交叉污染和试剂蒸发。

技术特征：

1.一种数字pcr芯片，其特征在于，其包括基座、旋转上盖、微阵列反应仓、密封层、密封圈、弹力卡扣、转轴一、转轴二、扭簧；

所述基座与所述旋转上盖之间由所述转轴一连接；

所述转轴二通过扭簧与所述基座和所述弹力卡扣之间相连；

所述基座上置有微阵列反应仓；

所述旋转上盖上置有密封层；

所述密封层为低熔点固态直链烷烃；

所述微阵列反应仓，由微孔组成。

2.根据权利要求1所述的数字pcr芯片，其特征在于，所述微阵列反应仓制作材料包括树脂、塑料、硅片、玻璃、石英、金属和陶瓷。

3.根据权利要求1所述的数字pcr芯片，其特征在于，所述微阵列反应仓表面分布400~1亿个微孔，微孔容积为0.5pl~1μl，所述微阵列反应仓分隔为1~100个分区，用于1~100个样品同时进行数字pcr反应。

4.根据权利要求1所述的数字pcr芯片，其特征在于，所述微孔形状为圆形、方形、三角形、六边形、多边形，排布为横纵或密排。

5.根据权利要求3所述的数字pcr芯片，其特征在于，所述微孔加工方法包括光刻蚀、玻璃陶瓷金属刻蚀、高精度模具注塑、机加工切削、3d打印、沉积和粘合。

6.根据权利要求1所述的数字pcr芯片，其特征在于，所述微阵列反应仓具有功能化修饰基团或表面亲水性处理。

7.根据权利要求1所述的数字pcr芯片，其特征在于，所述固态直链烷烃常温状态下为固体，其熔点为30℃~70℃，融化后其密度小于反应试剂，不与试剂互溶，不与试剂发生反应，其材料包括石蜡、固体油脂。

8.根据权利要求1所述的数字pcr芯片，其特征在于，所述密封圈位于微阵列反应仓外侧或密封层外侧。

9.根据权利要求1所述的数字pcr芯片，其特征在于，所述扭簧两端分别固定在旋转上盖和基座上，自由状态下弹力卡扣压在基座上。

10.根据权利要求1所述的数字pcr芯片，其特征在于，用于数字pcr反应中各独立反应体系的分隔与承载。

技术总结
本发明提供了一种数字PCR芯片,其包括基座、旋转上盖、微阵列反应仓、密封层、密封圈、弹力卡扣、转轴一、转轴二、扭簧。其中微阵列反应仓表面均布400~1亿个微孔，用于独立分隔和承载反应试剂体系；旋转上盖与基座绕转轴一相互转动，实现样品填充；旋转上盖上置有密封层和密封圈，用于隔离和密封微阵列反应仓，避免交叉污染和蒸发；弹力卡扣与基座绕转轴二相互转动，通过转轴二内置的扭簧实现压紧和密封。本发明的数字PCR芯片无需外接驱动装置、节省试剂、操作简单。

技术研发人员：任鲁风;李洁昆;蔡亦梅;高静;范东雨
受保护的技术使用者：北京中科生仪科技有限公司
技术研发日：2018.05.28
技术公布日：2019.12.06