基于III型聚酮合酶的新型丙二酰-CoA生物传感器及其用途的制作方法

文档序号:20122705发布日期:2020-03-20 05:46阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于丙二酰-coa检测的重组微生物,在其中iii型聚酮合酶编码基因插入所述微生物的基因组中,或在其中引入了含有所述iii型聚酮合酶编码基因的重组载体。

2.权利要求1的重组微生物,其中所述iii型聚酮合酶是:

源自选自灰色链霉菌、天蓝色链霉菌、阿维链霉菌、红色糖多孢菌、波赛链霉菌和针孢链霉菌的微生物的rppa;

源自荧光假单胞菌的phld(聚酮合酶);

源自地中海拟无枝菌酸菌的dpga(聚酮合酶);

源自掌叶大黄的als(芦荟酮合酶);或

源自木立芦荟的pcs(5,7-二羟基-2-甲基色酮合酶)、oks(八酮合酶)、pks3(芦荟酮合酶)、pks4(八酮合酶2)或pks5(八酮合酶3)。

3.权利要求1的重组微生物,其中编码所述iii型聚酮合酶的基因与选自tac、trc、t7、bad、λpr和anderson合成启动子的启动子可操作地连接。

4.权利要求1的重组微生物,其中所述重组微生物选自大肠杆菌、根瘤菌属、双歧杆菌属、红球菌属、假丝酵母属、欧文氏菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、凝聚杆菌属、黄单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、不动杆菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、链霉菌属、双歧杆菌属、蓝细菌和圆杆菌属。

5.一种筛选丙二酰-coa产生诱导物质的方法,其包括以下步骤:

(a)培养权利要求1的重组微生物;

(b)向所述重组微生物中添加候选物质;

(c)将添加所述候选物质后的所述重组微生物的培养上清液的颜色与没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液的颜色进行比较;并且

(d)当添加所述候选物质后所述重组微生物的培养上清液显示出比没有添加所述候选物质的所述重组微生物的培养上清液更深的红色时,选择所述候选物质作为所述丙二酰-coa产生诱导物质。

6.权利要求5的方法,其中步骤(c)中颜色之间的比较是通过肉眼进行。

7.权利要求5的方法,其中步骤(c)中颜色之间的比较是通过测量吸光度来进行,并且步骤(d)包括当添加所述候选物质后测量的吸光度高于未添加所述候选物质的情况下测量的吸光度时,选择所述候选物质作为所述丙二酰-coa产生诱导物质。

8.一种筛选参与增加丙二酰-coa产生的基因的方法,所述方法包括以下步骤:

(a)将改变重组微生物中的基因表达的基因调节文库引入权利要求1的重组微生物中,从而构建所述重组微生物中的基因表达发生改变的重组微生物文库;

(b)培养所述构建的重组微生物文库,测量所述重组微生物文库的培养上清液的吸光度,培养所述重组微生物然后将所述基因调节文库引入,并比较所述重组微生物文库的培养上清液的颜色与在将所述基因调节文库引入之前所述重组微生物的培养上清液的颜色;并且

(c)当所述重组微生物文库的培养上清液显示出比在将所述基因调节文库引入之前的重组微生物的培养上清液更深的红色时,选择引入所述重组微生物文库中的基因作为参与增加丙二酰-coa产生的基因。

9.权利要求8的方法,其中步骤(b)中颜色之间的比较是通过肉眼进行。

10.权利要求8的方法,其中步骤(b)中的颜色之间的比较是通过测量吸光度来进行,并且步骤(c)包括当所述重组微生物文库的培养上清液的吸光度高于在将所述基因调节文库引入之前所述重组微生物的培养上清液的吸光度时,选择在所述重组微生物文库中引入的基因。

11.权利要求8的方法,其中所述基因调节文库是选自以下的文库:srna文库、基因组文库、cdna文库、grna文库和用于构建敲除或突变菌株的寡核苷酸文库。

12.一种产生具有增加的丙二酰-coa产生能力的重组微生物的方法,所述方法包括调节通过权利要求8至11中任一项的方法筛选的基因在具有丙二酰-coa产生能力的微生物中的表达。

13.权利要求12的方法,其中所述筛选的基因是选自以下项的一种或多种基因:

fabf(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶ii);

yfcy(β-酮酰-coa硫解酶);

xapr(xapab的转录激活因子);

cytr(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupc和nupg的转录阻遏物);

fabh(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶iii);

mqo(苹果酸脱氢酶);

yfid(丙酮酸甲酸裂解酶亚基);

fmt(10-甲酰基四氢叶酸:l-甲硫氨酰基-trna(fmet)n-甲酰基转移酶);

pyrf(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶);

araa(l-阿拉伯糖异构酶);

fadr(fad调节子的负调节因子和faba的正调节因子);

paba(氨基脱氧分支酸合酶,亚基ii);

purb(腺苷酸琥珀酸裂解酶);和

hyci(参与加工hyce的c末端的蛋白酶),

并且减少所述基因的表达。

14.权利要求12的方法,其中所述微生物是选自以下项的微生物:大肠杆菌、根瘤菌属、双歧杆菌属、红球菌属、假丝酵母属、欧文氏菌属、肠杆菌属、巴氏杆菌属、曼氏杆菌属、放线杆菌属、凝聚杆菌属、黄单胞菌属、弧菌属、假单胞菌属、固氮菌属、不动杆菌属、劳尔氏菌属、土壤杆菌属、红杆菌属、发酵单胞菌属、芽孢杆菌属、葡萄球菌属、乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、链霉菌属、双歧杆菌属、蓝细菌和圆杆菌属。

15.一种具有增加的丙二酰-coa产生能力的重组微生物,其中选自以下基因的一种或多种基因:

fabf(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶ii);

yfcy(β-酮酰-coa硫解酶);

xapr(xapab的转录激活因子);

cytr(deo操纵子、udp、cdd、tsx、nupc和nupg的转录阻遏物);

fabh(3-氧代酰基-[酰基-载体-蛋白质]合酶iii);

mqo(苹果酸脱氢酶);

yfid(丙酮酸甲酸裂解酶亚基);

fmt(10-甲酰基四氢叶酸:l-甲硫氨酰基-trna(fmet)n-甲酰基转移酶);

pyrf(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶);

araa(l-阿拉伯糖异构酶);

fadr(fad调节子的负调节因子和faba的正调节因子);

paba(氨基脱氧分支酸合酶,亚基ii);

purb(腺苷酸琥珀酸裂解酶);和

hyci(参与加工hyce的c末端的蛋白酶)在具有丙二酰-coa产生能力的微生物中的表达与在野生型微生物中的表达相比降低。

16.一种使用丙二酰-coa作为底物或中间体产生有用物质的方法,所述方法包括以下步骤:

(a)构建重组微生物,其中在权利要求15的重组微生物中另外引入参与所述有用物质产生的基因或增加所述基因的表达,或者另外使参与所述有用物质产生的基因缺失或减少所述基因的表达;

(b)培养所构建的微生物;并且

(c)从所培养的微生物回收所述有用物质。

17.权利要求16的方法,其中所述有用物质是选自以下项的一种或多种:

放线菌紫素、多柔比星、道诺霉素、土霉素、雷帕霉素、洛伐他汀、sek4、sek4b、sek34、sek15、sek26、fk506、dmac、阿克拉菌酮、阿克拉酸、ε-紫红霉酮、芦荟苦素、芦荟宁、芦荟苷、5,7-二羟基-2-甲基色酮、红霉素、利福霉素、阿维菌素、格尔德霉素、伊维菌素、多西环素、安曲霉素、青霉酸、卡奇霉素、埃博霉素、特曲霉素、富伦菌素、三乙酸内酯、6-甲基水杨酸或芦荟酮的聚酮化合物;

松属素、二氢山柰酚、圣草酚、二氢槲皮素、黄豆苷元、染料木素、芹菜素、木犀草素、山柰酚、槲皮素、儿茶素、天竺葵色素、矢车菊素、阿福豆素、杨梅素、非瑟酮、高良姜素、橙皮素、柑桔黄酮、花翠素、表儿茶素、白杨素、白藜芦醇或柚皮素的苯丙素类化合物;

戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、二十烷、戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、十三烷醇、十四烷醇、十五烷醇、十六烷醇、十七烷醇、十八烷醇、十九烷醇、二十烷醇、癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕榈酸甲酯、棕榈油酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、花生酸甲酯、二十烯酸甲酯、芥酸甲酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、棕榈油酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯、花生酸乙酯、二十烯酸乙酯或芥酸甲酯的生物燃料组;

神经酰胺、棕榈酸酯或鞘氨醇的脂质化合物;和

3-羟基丙酸。

18.一种用于产生6-甲基水杨酸的重组微生物,其中在权利要求15的重组微生物中另外引入了编码6-甲基水杨酸合酶(6msas)和4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(sfp)的基因,或者增加所述基因的表达。

19.权利要求18的重组微生物,其中所敲低的基因是选自paba、fabf、xapr和ytcy的一种或多种。

20.权利要求18的重组微生物,其中在所述重组微生物中另外引入了编码选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、苹果酸脱氢酶(mdh)、磷酸甘油酸脱氢酶(sera)、乙酰-coa羧化酶(accbc和accd1)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapa)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、乙酰-coa合成酶(acs)和丙酮酸脱氢酶(aceef和lpd)的一种或多种酶的基因或增加所述基因的表达。

21.一种产生6-甲基水杨酸的方法,所述方法包括以下步骤:

(a)培养权利要求18的重组微生物;并且

(b)从所培养的微生物回收所述6-甲基水杨酸。

22.一种用于产生芦荟酮的重组微生物,其中在权利要求15的重组微生物中另外引入了编码芦荟酮合酶的基因或增加所述基因的表达。

23.权利要求22的重组微生物,其中所敲低的基因是paba。

24.权利要求22的重组微生物,其中在所述重组微生物中另外引入了编码选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)、苹果酸脱氢酶(mdh)、磷酸甘油酸脱氢酶(sera)、乙酰-coa羧化酶(accbc和accd1)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapa)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、乙酰-coa合成酶(acs)和丙酮酸脱氢酶(aceef和lpd)的一种或多种酶的基因或增加所述基因的表达。

25.一种产生芦荟酮的方法,所述方法包括以下步骤:

(a)培养权利要求22的重组微生物;并且

(b)从所培养的微生物回收所述芦荟酮。

26.一种用于产生白藜芦醇的重组微生物,其中在权利要求15的重组微生物中另外引入了编码酪氨酸氨裂解酶(tal)、4-香豆酸:coa连接酶(4cl)和芪合酶(sts)的基因或者增加所述基因的表达。

27.权利要求26的重组微生物,其中所述4-香豆酸:coa连接酶是其中seqidno:128所示的氨基酸序列中的氨基酸突变为i250l/n404k/i461v的突变酶,或者是其中seqidno:131所示的氨基酸序列中的氨基酸突变为a294g/a318g的突变酶。

28.权利要求26的重组微生物,其中所敲低的基因是选自paba、yfid、mqo、xapr、purb、fabh、fabf、yfcy、fadr、cytr、fmt和pyrf中的一种或多种。

29.一种产生白藜芦醇的方法,所述方法包括以下步骤:

(a)培养权利要求26的重组微生物;并且

(b)从所培养的微生物回收所述白藜芦醇。

30.一种用于产生柚皮素的重组微生物,其中在权利要求15的重组微生物中另外引入了编码酪氨酸氨裂解酶(tal)、4-香豆酸:coa连接酶(4cl)、查耳酮合酶(chs)和查耳酮异构酶(chi)的基因或者增加所述基因的表达。

31.权利要求30的重组微生物,其中所述4-香豆酸:coa连接酶是其中seqidno:128所示的氨基酸序列中的氨基酸突变为i250l/n404k/i461v的突变酶。

32.权利要求30的重组微生物,其中所敲低的基因是选自fadr、hyci和xapr中的一种或多种。

33.一种产生柚皮素的方法,所述方法包括以下步骤:

(a)培养权利要求30的重组微生物;并且

(b)从所培养的微生物回收所述柚皮素。

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