双功能谷胱甘肽合成酶的突变体及其在谷胱甘肽合成中的应用的制作方法

文档序号：18994653发布日期：2019-10-29 21:08阅读：627来源：国知局

本发明属于生物催化领域，涉及一种新的双功能谷胱甘肽合成酶突变体及其谷胱甘肽合成中的应用。

背景技术：

谷胱甘肽是一种广泛存在于生物体内的非蛋白类巯基短肽，一般以氧化型谷胱甘肽(GSSG)和还原型谷胱甘肽(L-glutathione，GSH)两种形式存在，参与机体的一系列生理反应，具有多种生理功能。尤其是其中的还原型谷胱甘肽，具有很强的亲和力，能与多种体内代谢物结合，可以清除体内的氧自由基，具有抗氧化、增强免疫力等一系列功能，还能够结合人体内致癌物质、重金属、有毒化合物等，促使其排出体外，起到解毒的作用。

由于其重要的生理功能，GSH被广泛应用于多种领域，尤其是医药和保健品领域，临床上，作为抗氧化剂，保护细胞，防止红细胞溶血；保护免疫系统，有助于防癌，维持白细胞数量健康增加；作为解毒剂，对于重金属、有机溶剂、氟化物、一氧化碳中毒等的治疗。此外，还具有抑制脂肪肝，改善感染性肝炎和中毒性肝炎症状的作用。

还原型谷胱甘肽的生产方法有提取法、化学合成法、直接发酵法和酶催化法，其中提取法和化学合成法由于成本或质量问题，已被淘汰。目前主要采用直接发酵法和酶催化法两种路线生产GSH，目前主要利用酵母菌直接发酵生产GSH，但由于其发酵周期长，产物复杂，分离提取困难，发酵浓度低等问题，导致其生产成本较高。近几年酶催化法生产GSH取得了迅速的发展，有逐渐取代发酵法的趋势。

GSH的酶催化合成是以L-谷氨酸、L-半胱氨酸和L-甘氨酸为底物，添加ATP等辅助成分，在谷胱甘肽相关合成酶的催化下，在较短时间内反应生成还原型谷胱甘肽。这其中，制约酶催化法生产成本或效率的关键因素有两个，一个是能够合成谷胱甘肽的酶，二是廉价的ATP供应，而廉价的ATP供应主要靠ATP再生系统来解决。合成谷胱甘肽的酶主要有两类，大多数生物体内，谷胱甘肽的合成主要通过两步ATP依赖型的酶催化反应完成：L-谷氨酸和L-半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化下合成γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-Glu-Cys),γ-谷氨酰半胱氨酸和L-甘氨酸又在谷胱甘肽合成酶(GS)催化下合成还原型谷胱甘肽，这两步反应是由两个独立的酶催化，理论上只要能够提供γ-GCS和GS两个酶，再添加各种底物和辅助因子，就可以实现酶催化法合成谷胱甘肽GSH。但该路线存在一个重要的问题是γ-GCS受到终产物GSH的反馈抑制，当反应体系中的GSH累积到一定浓度时，将会与γ-GCS结合并使之失活，这就意味着用γ-GCS和GS两个酶的催化方法，不可能得到高浓度的GSH，制约了该路线的应用。

2005年以来，在微生物体内陆续发现了一些同时具有γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和谷胱甘肽合成酶(GS)活性的双功能酶，可以通过一个酶实现原来γ-GCS和GS两个酶的功能，这种双功能酶被命名为GshF，更为重要的是，GshF的催化活性不受终产物GSH的反馈抑制，这意味着用这种酶做催化反应，可以达到较高的产物浓度，具有很高的应用价值。目前已经有来自于无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(Blythe E.Janowiak and Owen W.Griffith,THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.280,No.12,Issue of March 25,pp.11829–11839,2005)，单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)(Shubha Gopal et al,JOURNAL OF BACTERIOLOGY,June 2005,p.3839–3847)，多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)(Bjorn Vergauwen et al，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.281,NO.7,pp.4380–4394,February 17,2006)等的双功能谷胱甘肽合成酶被分离克隆并进行了酶学性质的研究，也被应用于发酵法或酶催化法合成谷胱甘肽的制备工作。

这类双功能谷胱甘肽合成酶GshF的发现和应用，克服了原来γ-GCS和GS双酶系统产物抑制的问题，提高了谷胱甘肽的产物浓度，但后续研究也发现，这类双功能酶的活性低于原有的γ-GCS和GS双酶系统，因此反应时需要增加底物谷氨酸的供应；稳定性较差，而且终产物谷胱甘肽的浓度最高也只能达到14g/L，成本还是偏高。为解决上述问题，一方面需要发掘更多来源的GshF酶，从中寻找具有更高活性和稳定性的酶，另一方面通过蛋白质定向进化技术对原有的GshF进行改造，提高酶活性和稳定性，进一步提高产物抑制的浓度，降低GSH的生产成本。中国专利CN102071171A中，叶勤等从猪胸膜肺炎放线杆菌，琥珀酸放线杆菌，蜡状芽孢杆菌，血链球菌，格式链球菌、乳房链球菌、嗜热链球菌中克隆了7种不同来源的GshF，并将来源于猪胸膜肺炎放线杆菌的GshF用于谷胱甘肽的合成，37度条件下反应6小时，GSH浓度可达到7.1g/L。中国专利CN104328092A中，傅荣昭将来源于Melissococcus的GshF的128，256，320位点进行了突变，将酶活性提高了2倍。中国专利CN105238797中，徐志南等对S.agalactiae来源的GshF进行了定向进化，得到三种突变体。中国专利CN107267471A中，黄斌等将来源于唾液链球菌中的GshF酶的3，123，161，194，382和390等位点进行了突变，突变体的酶活力最高提高了12.8倍，最适温度和热稳定性都得到了提高，应用到谷胱甘肽的制备中，谷胱甘肽的浓度达到了21g/L。

尽管用双功能酶GshF来合成谷胱甘肽取得了很大的进步，并初步实现了工业化生产，但其生产成本受制于酶活性和稳定性，仍然偏高，发掘新的双功能型谷胱甘肽合成酶GshF，找到具有更高活性和更高稳定性的酶或突变体，仍然具有重要的经济价值。

技术实现要素：

鉴于目前现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种谷胱甘肽合成酶的突变体，以解决现有谷胱甘肽合成酶活性不高，稳定性不足以及对产物耐受性过低等问题。并将该突变体应用于谷胱甘肽的合成，降低生产成本。

本发明采用的技术方案如下：

克隆来源于蜡状芽孢杆菌的双功能酶GshF，分析其蛋白质结构，选择几个位点进行定点突变，对突变后带的酶进行活性测定，确定对酶活性有重要影响的位点，然后进行组合突变，迭加突变优势，获得相比野生型活性提高最多的突变体。

所述的来源于蜡状芽孢杆菌的双功能酶GshF，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示，从GenBank数据库中获得(GenBank:EEK41855.1)，对应的核酸序列如SEQ NO.2所示(GenBank:ACLS01000213.1)。

所述的GshF突变位点，包括第29位，第31位，第440位，第442位，第483位，第488位，第573位，第576位，第578位中的一个或多个位点。

所述的突变位点，其中第29位，指的是将原位点的缬氨酸(V)突变为亮氨酸(L)，该突变按常规命名为V29L；

所述的突变位点，其中第31位，指的是将原位点的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，该突变按常规命名为K31R；

所述的突变位点，其中第440位，指的是将原位点的异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)，该突变按常规命名为I440L；

所述的突变位点，其中第442位，指的是将原位点的甲硫氨酸(M)突变为亮氨酸(L)，该突变按常规命名为M442L；

所述的突变位点，其中第483位，指的是将原位点的丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)，该突变按常规命名为S483N；

所述的突变位点，其中第486位，指的是将原位点的丝氨酸(S)突变为缬氨酸(V)，该突变按常规命名为S486V；

所述的突变位点，其中第573位，指的是将原位点的异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)，该突变按常规命名为I573V；

所述的突变位点，其中第576位，指的是将原位点的苯丙氨酸(F)突变为酪氨酸(Y)，该突变按常规命名为F576Y；

所述的突变位点，其中第578位，指的是将原位点的天冬酰胺(N)突变为谷氨酸(E)，该突变按常规命名为N578E；

所述的GshF突变体，指的是除了上述位点外，其它位点与野生型的氨基酸序列一致，也就是与SEQ NO.1一致。

所述GshF突变体，指的是包含了上述位点突变方式的某一种或某几种的组合。

优选的，所述GshF突变体之一M1，为包含了上述第29位，第440位，第442位的突变体，具体氨基酸序列如SEQ NO.3所示，对应的DNA序列如SEQ NO.4所示，其酶活性相比野生型提高了5.3倍。

优选的，所述GshF突变体之一M2，为包含了上述第29位，第483位，第486位的突变体，具体氨基酸序列如SEQ NO.5所示，对应的DNA序列如SEQ NO.6所示，其酶活性相比野生型提高了8.8倍。

优选的，所述GshF突变体之一M3，为包含了上述第440位，第442位，第573位，第576位的突变体，具体氨基酸序列如SEQ NO.7所示，对应的DNA序列如SEQ NO.8所示，其酶活性相比野生型提高了13.2倍。

优选的，所述GshF突变体之一M4，为包含了上述第29位，第440位，第442位，第483位，第486位，第573位，第576位的突变体，具体氨基酸序列如SEQ NO.9所示，对应的DNA序列如SEQ NO.10所示，其酶活性相比野生型提高了26.6倍。

本发明还提供了一种构建双功能谷胱甘肽合成酶高表达基因工程菌的方法，即根据gshF的基因序列，全基因合成DNA片段，然后通过对DNA片段和表达载体进行双酶切、连接、转化等手段转入大肠杆菌，得到包含了gshF的重组载体，然后再将该重组载体提取质粒后，转入合适的表达宿主，得到能够高表达GshF的基因工程菌。

所述的gshF的基因序列如SEQ NO.2所示，也可以根据密码子简并性和所要表达的宿主，对DNA序列进行优化，得到氨基酸序列一致而DNA序列不同的基因片段。

所述表达载体通常包含抗性基因、复制区域、强启动子和调控序列、强终止子，例如很多商业化的表达载体如pET系列，pTrc99系列，pQE系列，pGEX系列，pIC3.5K，pIC9K等都可用于本发明。

所述表达宿主包括大肠杆菌DH5α，大肠杆菌TOP10，大肠杆菌BL21(DE3)，毕赤酵母GS115，毕赤酵母KM71等。

本发明还提供了上述突变体的制备方法，先将野生型gshF基因(如SEQ NO.2所示)克隆到合适的表达载体，再设计长片段的引物，利用聚合酶链式反应(PCR)对整个载体进行扩增，转化到大肠杆菌后，获得单突变的gshF基因。

上述所有野生型或突变型GshF酶，其基因除了可以通过上述方式PCR扩增或突变获得外，也可以根据序列全基因合成，特别地，可以根据密码子简并性获得氨基酸序列相同而核酸序列不同的基因。

本发明还提供了上述GshF突变酶的应用，以L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-半胱氨酸、ATP、镁离子为底物，在水相反应体系中，加入上述突变酶，控制反应温度维持在35-40度，优选37度，pH范围维持在7.6-8.2，优选pH8.0，制备得到还原型谷胱甘肽(GSH)。

本发明具有如下有益效果：通过对谷胱甘肽合成酶序列的特定位点进行突变，获得了几种谷胱甘肽合成酶突变体，相比野生型酶，活性得到大幅提高，最高活性提高了26.6倍。利用活性最高的突变体，通过添加L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-半胱氨酸、ATP、镁离子等底物，最终得到还原型谷胱甘肽。利用该高活性突变体工艺生产谷胱甘肽，提高了产物浓度，降低了生产成本，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中野生型和突变体M4谷胱甘肽合成酶催化合成谷胱甘肽的结果。

具体实施方式

本发明旨在提供几种双功能谷胱甘肽合成酶的突变体及其在谷胱甘肽合成中的应用，为进一步详细说明本发明，特结合具体实施例进行详细描述，应当理解，实施例的具体描述并不限定本发明，通过采用了其他方式而达到本发明的突变效果，都属于本发明的保护范围。

本发明所用的主要试剂中，所用的限制性内切酶和DNA连接酶购自TAKARA公司，高保真DNA聚合酶KOD购自TOYOBO公司，质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)和表达载体pET24a购自Merck公司。

实施例中，未特别说明的各种分子生物学操作，包括PCR条件，DNA酶切条件，DNA连接条件，感受态细胞制备和转化方法，DNA回收纯化等操作，按照购买的酶或试剂盒的说明书操作，或者按照《分子克隆实验指南》操作。

实施例1、野生型gdhF表达载体的构建

根据GenBank数据库中蜡状芽孢杆菌双功能谷胱甘肽合成酶的编码序列(GenBank:ACLS01000213.1，SEQ NO.2)，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成基因片段，命名为gshFbc基因。为了便于后续克隆，基因片段5’端增加CC两个碱基，形成NcoI酶切位点，3’端增加GGATCC六个碱基，形成BamHI位点。

将合成的gshFbc基因和pET28a载体分别用NcoI和BamHI进行双酶切，分别用DNA凝胶试剂盒(购自AXYGEN公司)回收片段，用T4 DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌DH5α，用卡那霉素抗性LB平板筛选，得到克隆子。

挑取8个克隆子，用质粒提取试剂盒(购自AXYGEN公司)抽提质粒后，由苏州金唯智生物科技有限公司测序，选择正确插入载体且无突变的克隆子，得到gshFbc表达载体，命名为pET28a-gshFbc。

实施例2、GshFbc的表达和酶的制备

将实施例1中得到的表达载体pET28a-gshFbc转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到能高表达谷胱甘肽合成酶的大肠杆菌基因工程菌。

将高表达谷胱甘肽合成酶的工程菌按常规方法在摇瓶中发酵培养，当发酵液OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，降温到28度继续培养16小时左右，4000转离心20分钟，收集菌体，用50mM pH7.4的PBS缓冲液洗两次，得到含有谷胱甘肽合成酶的菌体，用于后续催化研究和酶活性测定。

实施例3、谷胱甘肽合成酶活性的测定

将收集到的含有谷胱甘肽合成酶的菌体称重10g，另加入终浓度为0.5％的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)通透细胞，加100mM pH8.0的PBS缓冲液至终体积50mL，得到谷胱甘肽合成酶粗酶液

5mL反应体系中，分别加入L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L甘氨酸和ATP到终浓度50mM，加入镁离子至终浓度10mM，加入粗酶液500uL，加100mM pH8.0的PBS缓冲液至终体积5mL，得到反应液。

将反应液于37℃反应30分钟，沸水浴5分钟终止反应，4000转离心20分钟，收集上清液用于后续检测。

取上清液样品250uL，加入750uL 0.2M的氢氧化钠溶液，再加入250uL 3％的甲醛以消除半胱氨酸的干扰，颠倒混匀后静置5分钟，取500uL样品加入2.5mL 50mM的Tris盐酸缓冲液(pH8.0)，再加入25uL二硫硝基苯甲酸(DTNB)，混匀后25℃水浴10分钟，测定样品在412nm出的吸光值。用水做空白对照，不同浓度的GSH作标准曲线。

根据测定得到的GSH浓度计算GshF的酶活，并将酶活力单位(U)定义为：37度，pH8.0条件下，1分钟内催化生成1umol产物所需的酶量为1U。

实施例4gshF基因的定点突变

根据序列比对和结构模拟，推测29-31区域，440-442区域，483-486区域，573-578区域可能与活性有很大关系，因此设计了9个氨基酸位点做定点突变，并检测催化活性的变化。

所述的突变位点，其中第29位，指的是将原位点的缬氨酸(V)突变为亮氨酸(L)，该突变按常规命名为V29L；

所述的突变位点，其中第31位，指的是将原位点的赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)，该突变按常规命名为K31R；

所述的突变位点，其中第440位，指的是将原位点的异亮氨酸(I)突变为亮氨酸(L)，该突变按常规命名为I440L；

所述的突变位点，其中第442位，指的是将原位点的甲硫氨酸(M)突变为亮氨酸(L)，该突变按常规命名为M442L；

所述的突变位点，其中第483位，指的是将原位点的丝氨酸(S)突变为天冬酰胺(N)，该突变按常规命名为S483N；

所述的突变位点，其中第486位，指的是将原位点的丝氨酸(S)突变为缬氨酸(V)，该突变按常规命名为S486V；

所述的突变位点，其中第573位，指的是将原位点的异亮氨酸(I)突变为缬氨酸(V)，该突变按常规命名为I573V；

所述的突变位点，其中第576位，指的是将原位点的苯丙氨酸(F)突变为酪氨酸(Y)，该突变按常规命名为F576Y；

所述的突变位点，其中第578位，指的是将原位点的天冬酰胺(N)突变为谷氨酸(E)，该突变按常规命名为N578E；

全部突变采用全质粒扩增的方法获得，分别设计突变引物如下：

PCR扩增条件为：95℃30ec，95℃15sec，55℃30sec，68℃5min，30个循环，68℃10min。

PCR结束后，加限制性内切酶DpnI除掉模板质粒，DNA凝胶回收试剂盒回收后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，利用卡那霉素抗性平板筛选正确转化子。

每种转化子挑取4个单克隆，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序，确定为正确的突变。

实施例5、gshF单点突变体的活性测定

将实施例4中的正确单点突变质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到9个单点突变的GshF高表达基因工程菌。

将9个单点突变的GshF高表达基因工程菌连同野生型的工程菌分别按照实施例2和实施例3的方法，制备GshF酶并进行活性测定，按每g湿菌体计算酶活单位，结果如下：

从酶活检测结果中可见，K31R和N578E的突变没有达到预期效果，反而使得突变体酶活性降低，其余7个突变都使得GshF活性得到了提高。

实施例6、GshF的位点组合突变

从实施例5中得知，有7个位点的突变使GshF活性提高，因此这些位点相互组合，有可能使得活性提高得到迭加，因此采用DNA Shuffling方法将这些位点相互组合，具体操作为：

根据gshF序列设计引物，用于扩增整个基因，具体引物序列为：

F-gshF-NcoI：gagccatgggaggtacagtttgtatg(SEQ NO.29)

R-gshF-BamHI：cacggatccttatttttttggtagttcagg(SEQ NO.30)

用上述引物对分别扩增V29L，I440L，M442L，S483N，S486V，I573V，F576Y共七个突变基因，将得到的DNA片段分别用DNaseI短时间处理后，进行无模板PCR扩增，得到组合突变的gshF片段，然后通过常规基因克隆方式，构建表达载体，转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。

分别挑取转化子进行小量酶制备后，测定其中谷胱甘肽合成酶的活性，得到四个活性大幅提高的突变体，分别命名为M1，M2，M3和M4。对这四个突变体分别提取质粒测序后，确定突变位点。

再对四株突变菌株按照实施例2和3的方法进行酶制备和活性测定，跟野生型GshF对比活性提高情况。

四株突变体性质总结如下

实施例7、谷胱甘肽合成酶突变体用于酶催化制备还原型谷胱甘肽

分别将野生型和活性最高的突变体M4按照实施例2的方法培养，制备谷胱甘肽合成酶。

1L反应体系中，分别加入L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L甘氨酸和ATP到终浓度100mM，加入镁离子至终浓度20mM，加入含有野生型和M4突变体的湿菌体40g，加pH8.0的PBS缓冲液至终体积1L，得到反应液。

将反应液于37℃反应，维持pH在8.0，每1小时取样500uL，沸水浴3分钟终止反应，4000转离心，测定谷胱甘肽浓度。具体结果见附图1，经过8个小时反应，野生型GshF合成谷胱甘肽浓度为4.3g/L，M4突变体合成的谷胱甘肽浓度达到24.8g/L，提高到5.76倍，取得了很好的效果。

应当知晓，本发明公开的高活性突变体除了可以应用于大肠杆菌酶催化法合成谷胱甘肽外，还可以应用于其他宿主菌酶催化法合成谷胱甘肽，也可以用于构建代谢工程菌，进一步应用于发酵法直接生产谷胱甘肽。

序列表

<110> 珠海天香苑生物科技发展股份有限公司

<120> 双功能谷胱甘肽合成酶的突变体及其在谷胱甘肽合成中的应用

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 761

<212> PRT

<213> 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus野生型GshF 氨基酸序列)

<400> 1

Met Gly Gly Thr Val Cys Met Glu Met Lys Lys Met Leu Asn Asn Asp

1 5 10 15

Arg Ile Lys Pro Tyr Leu Leu Lys Ala Arg Phe Gly Val Glu Lys Glu

20 25 30

Ser Gln Arg Val Asp Leu Ser Gly Ser Leu Ala Lys Thr Glu His Pro

35 40 45

Lys Ser Ile Ser Val Arg Asp Glu His Pro Tyr Ile Gln Arg Asp Phe

50 55 60

Ser Glu Thr Gln Met Glu Leu Ile Thr Pro Val Thr Glu Thr Leu Gly

65 70 75 80

Asp Leu Phe Asn Tyr Leu Ala Ala Ile His Asp Val Ala Tyr Arg Ser

85 90 95

Met Gly Asn Asn Glu Met Leu Trp Pro Leu Ser Met Pro Pro Gln Leu

100 105 110

Pro Glu Lys Glu Glu Asp Ile Val Ile Ala Lys Leu Asn Asn His Glu

115 120 125

Asn Val Leu Tyr Arg Arg Tyr Leu Ser Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Lys

130 135 140

Gln Met Ile Ser Gly Ile His Tyr Asn Phe Glu Phe Ser Asp Asn Leu

145 150 155 160

Ile Gln Ala Leu Phe Glu Leu Gln Ser Glu Ile Lys Asp Tyr His Gln

165 170 175

Phe Lys Thr Glu Ile Tyr Leu Lys Val Thr Arg Asn Tyr Leu His Tyr

180 185 190

Arg Trp Leu Ile Thr Tyr Phe Phe Gly Ala Ser Pro Ser Ser Glu Lys

195 200 205

Asn Phe Phe Glu Ile Asn Pro Leu Asn Asp Ala Val Arg Ser Ile Arg

210 215 220

Asn Ser Lys Tyr Gly Tyr Ser Asn Glu Asn Asp Val Gln Val Ser Tyr

225 230 235 240

Ser Ser Leu Gln Asn Tyr Ile Ser Asp Leu Ser Ser Leu Val Ser Lys

245 250 255

Gly Val Leu Leu Glu Glu Lys Glu Phe Tyr Ala Ser Val Arg Leu Arg

260 265 270

Gly Gly Pro Gln Val Ser Asp Leu Lys Asn His Gly Ile Arg Tyr Ile

275 280 285

Glu Leu Arg Asn Leu Asp Leu Asn Pro Phe Glu Thr Tyr Gly Ile Ser

290 295 300

His Glu Gln Ala Glu Phe Leu His Leu Phe Leu Ile Tyr Leu Leu Trp

305 310 315 320

Ile Asp Gln Asp Asp Asn Asn Asp Glu Trp Val Lys Ile Gly Asp Phe

325 330 335

Gln Asn Asn Leu Val Ala Leu Glu His Pro Leu Glu His Thr Gln Phe

340 345 350

Lys Thr Asp Ala Glu Arg Ile Ile Asp Glu Met Glu His Leu Thr Gly

355 360 365

Leu Leu Asp Ile Thr Val Ser Asn Thr Leu Phe Val Asn Leu Arg Glu

370 375 380

Met Leu Thr Asp Pro Ser Lys Thr Leu Ala Gly Arg Leu Tyr Lys Glu

385 390 395 400

Ile Ile Lys Ser Ser Gln Ser Gln Val Ala Ser Arg Ile Ala Lys Glu

405 410 415

Asn Tyr Lys Lys Ala Trp Asp Lys Pro Tyr Gln Leu Ser Gly Phe Thr

420 425 430

Asp Met Glu Leu Ser Thr Gln Ile Leu Met Phe Asp Ala Ile Gln Gln

435 440 445

Gly Leu Gln Val Asp Val Leu Asp Arg Gln Asp Gln Phe Leu Lys Leu

450 455 460

Gln Leu Gly Asn His Val Glu Tyr Val Lys Asn Gly Asn Met Thr Ser

465 470 475 480

Lys Asp Ser Tyr Ile Ser Pro Leu Ile Met Glu Asn Lys Thr Val Thr

485 490 495

Lys Lys Ile Leu Gln Gln His Gly Phe Arg Val Pro Ile Gly Glu Glu

500 505 510

Phe Ser Asp Ile Glu Lys Ala Leu Arg Ser Tyr Asp Ile Phe Ala Gly

515 520 525

Lys Pro Phe Val Val Lys Pro Lys Thr Thr Asn Tyr Gly Leu Gly Ile

530 535 540

Ser Ile Phe Lys Glu Asn Gly Ala Ser Tyr Glu Asp Tyr Gln Lys Ala

545 550 555 560

Leu Thr Ile Ala Phe Lys Glu Asp Ser Ser Val Leu Ile Glu Glu Phe

565 570 575

Ile Asn Gly Thr Glu Tyr Arg Phe Phe Val Leu Asp Gly Lys Val Ser

580 585 590

Ala Val Leu Leu Arg Ile Pro Ala Asn Val Ile Gly Asp Gly Ser His

595 600 605

Thr Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Lys Asn Leu Asn Ser Leu Arg Gly

610 615 620

Met Asp His Arg Thr Pro Leu Glu Asn Ile Gln Leu Gly Glu Leu Glu

625 630 635 640

Val Leu Met Leu Lys Ala Gln Gly Tyr Arg Lys Asp Ser Ile Pro Thr

645 650 655

Ser Asp Glu Ile Val Phe Leu Arg Glu Asn Ser Asn Val Ser Thr Gly

660 665 670

Gly Asp Ser Ile Asp Met Thr Asp Gln Ile Pro Asp Asp Tyr Lys Lys

675 680 685

Ile Ala Val Asp Ala Val Ser Ala Leu Gly Ala Asn Ile Ser Gly Ile

690 695 700

Asp Leu Ile Ile Glu Asn Thr Glu Val Pro Ala Ala Asn Lys Asn Ala

705 710 715 720

Tyr Gly Ile Ile Glu Ala Asn Phe Asn Pro Ser Met Tyr Met His Ile

725 730 735

Tyr Pro Tyr Lys Gly Lys Ser Arg Arg Leu Thr Ile Cys Ile Leu His

740 745 750

Tyr Leu Phe Pro Glu Leu Pro Lys Lys

755 760

<210> 2

<211> 2286

<212> DNA

<213> 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus野生型GshF 基因序列)

<400> 2

atgggaggta cagtttgtat ggaaatgaaa aaaatgttaa acaatgaccg tattaaacca 60

tatttattaa aagcacgttt tggagttgaa aaagaaagtc aacgagttga cctatcagga 120

agtttagcta aaacggaaca tcccaaaagt atttcagtaa gagatgaaca tccttatatt 180

cagcgagatt tctctgaaac acaaatggaa ttaatcacac cagttactga gacactagga 240

gatttattta attatttagc agctatccat gatgttgcct atcgttctat gggaaataac 300

gaaatgcttt ggccattaag catgccacca cagttgcccg aaaaagaaga agatattgtt 360

attgcgaaac ttaataatca tgaaaatgtt ttatatcgtc gatatttatc taattcttat 420

ggtcgacgaa aacaaatgat tagtggtatt cattacaatt ttgaatttag cgataatttg 480

attcaggcat tatttgaatt acaatcagaa ataaaagatt atcatcaatt taaaacagaa 540

atttatctga aagtcacaag gaattattta cactatcgat ggttaataac ttatttcttc 600

ggtgcttctc ctagtagtga aaagaatttc tttgaaataa atcctttaaa tgacgccgta 660

agaagcatta gaaatagtaa atatggttat agtaatgaaa atgatgttca agtatcctat 720

agtagtttac agaactatat atctgatctt tcttcgctgg taagtaaagg ggttttatta 780

gaagaaaaag aattttatgc atctgtccgt ttaaggggcg gtcctcaagt ttcagattta 840

aaaaatcatg ggattcgtta tattgaatta agaaacctag atttaaatcc ttttgaaaca 900

tatggaatta gccatgaaca agcagaattt ctacatcttt tcctcatcta tttactctgg 960

attgatcaag acgataataa tgatgaatgg gtaaaaatcg gtgattttca aaataattta 1020

gtggctcttg aacatccgtt agaacatacg caatttaaaa cagatgctga gcgtattatt 1080

gatgagatgg aacatttaac agggctgtta gacataactg tttcgaatac cttatttgtt 1140

aacttgagag aaatgctaac agatccaagt aagactttag ctggaagact ttataaagag 1200

attataaaaa gtagtcaaag tcaggtagct tcccgtattg ctaaagaaaa ttataaaaaa 1260

gcatgggata aaccatatca actatcagga tttactgaca tggagttgtc tacacaaatt 1320

ttaatgtttg atgctattca acaaggatta caagtagacg ttttagatcg acaagatcaa 1380

tttttaaaac tacagttagg aaatcatgtt gaatatgtga aaaatgggaa tatgacaagt 1440

aaagatagtt atatatcacc attaattatg gaaaataaaa cagtaacaaa gaaaattctt 1500

caacagcatg gatttcgtgt accaataggt gaggaattta gtgatataga aaaagcctta 1560

cgttcctatg atatatttgc aggaaagcct tttgtcgtta aaccaaaaac aacaaattat 1620

ggtttaggaa tatctatctt taaagaaaac ggagcaagtt acgaagacta tcaaaaagca 1680

ctcacaatag catttaaaga ggactcatca gtattaatag aagaatttat taatggaaca 1740

gaatatcgat tttttgtgct agatggcaaa gtttctgccg ttttattacg aattccagcc 1800

aatgttatag gagacggttc acatacgatt gaagagttag tcgctcaaaa gaacctgaat 1860

tcattaagag gaatggacca tagaacacct ttagaaaata tacaattagg tgaattagag 1920

gtcctaatgc ttaaagctca agggtatcga aaagattcta ttccaacaag tgatgaaatt 1980

gtttttctgc gagaaaattc taatgtcagt acaggtggag actcaattga tatgacagat 2040

caaattcccg atgattataa gaaaattgcc gtagatgctg tgtcggcact tggagcaaat 2100

attagtggta ttgatttgat tattgaaaat acagaagttc ctgcagctaa taaaaatgct 2160

tatggaatta ttgaggcaaa ctttaatcca tcgatgtata tgcatatata tccgtataaa 2220

ggcaaatcca gacgtttgac catctgtata ttacattatt tattccctga actaccaaaa 2280

aaataa 2286

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