一种曲霉菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种dpo引物对、检测方法、试剂盒及其应用，主要涉及一种曲霉菌分种检测的dpo引物对、检测方法、试剂盒及其应用，尤其涉及一种曲霉菌分种检测的dpo引物对、检测方法、试剂盒及其应用，具体涉及一种烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉分种检测的dpo引物对、检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术：
：曲霉菌属于条件致病菌，广泛存在于生活环境中，其可产生分生孢子随呼吸进入机体，主要侵染肺部、皮肤或粘膜。常见的病原菌有烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等。目前对于曲霉菌的检测方法主要为：(1)病原体培养鉴定，取患处的标本做涂片或培养，涂片可见菌丝或曲霉菌孢子，培养见曲霉菌生长，曲霉菌为常见污染菌，须反复涂片或培养，多次阳性且为同一菌种才有诊断价值，培养周期长。(2)病理组织检查，取受损组织或淋巴结活检，根据真菌形态确诊，但该方法为有创检查，患者接受度较差。(3)免疫学检查，半乳甘露聚糖为曲霉菌细胞壁中的高度特异性和保守性的多糖，可作为检测曲霉菌的分子标志物，通过elisa方法进行检测，但该方法灵敏度不高，不能区分菌种。(4)实时荧光pcr法，通过引物和探针的组合提高检测特异性，为临床诊断提供依据。现有方法检测周期长，不利于临床诊断用药。虽然已有多种抗真菌药物，但针对各种曲霉菌的治疗方案相同，无法实现针对特定菌种的精准治疗。cn108070675a公开了一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量pcr试剂盒，属于病原微生物体外分子检测
技术领域：
。该发明提供了一种基于荧光pcr法同时检测三种曲霉的引物探针组合，所述曲霉包括烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉。但该发明只能检测出样本中含有烟曲霉、黄曲霉或黑曲霉中的任意一种或其组合，无法检测确定具体菌种，且该方法无法诊断土曲霉的存在。cn106755379a公开了一种基于二聚体突变引物建立的荧光定量pcr方法定量检测4中曲霉菌并同步进行基因分型的方法，该检测方法包括1)提取待检测样品及4种标准菌株中的dna；2)制备阳性质粒标准品；3)运行荧光定量pcr；4)数据分析。该发明还提供一种烟曲霉菌、黑曲霉菌、黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的检测试剂盒，该试剂盒包括标记有荧光报告基团的上游引物、淬灭基团标记的上游引物互补链及下游引物。但该发明的引物设计有荧光基团，影响荧光定量pcr的扩增；其次，该产物熔解曲线温度过高，曲霉菌的种间退火温度差异过小，曲霉菌分型鉴定的灵敏度和特异性不高；最后，仅通过普通引物无探针配合，且互补引物还设计有突变位点，导致扩增非特异性产物，方法特异性不佳。cn101038254a公开了一种试剂盒特异性扩增曲霉菌itsi区间的基因，产物大小为79bp，能快速准确地检测出常见的多种致病曲霉菌(如烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉和构巢曲霉)。但该发明无法检测曲霉菌的种间差异。cn102321738a公开了一种曲霉菌的荧光定量pcr检测通用引物，检测探针和检测试剂盒，通过一对通用引物以及4条特异性探针鉴别烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉。虽然能检测曲霉菌的种间差异，但该方法需要设计合成4条探针，成本极高。因此，提供一种特异性好、灵敏度高、能区分曲霉菌种且低成本的简便方法具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种曲霉菌分种检测的dpo引物对、检测方法、试剂盒及其应用，有效区分烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉，且该方法特异性好，灵敏度高，利用熔解曲线判断待测样本所含曲霉菌的菌种信息，高效简便，为精准治疗和用药奠定基础。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种曲霉菌分种检测的dpo引物对，所述dpo引物对的核苷酸序列如seqidno.1-2所示，具体如下所示：dpo上游引物序列(seqidno.1)：5’-acaaggtttccgtaggtgiiiiiicggaaggat-3’；dpo下游引物序列(seqidno.2)：5’-catttcgctgcgttcttciiiiiigcgagaacc-3’.dpo(dualprimingoligonucleotide)引物是一种双启动寡核苷酸引物，包括两个独立的特异性引物区域，这两段独立的特异性区域通过寡聚次黄嘌呤(inosine,i)进行连接，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，使5’和3’区域形成两个独立功能的双特异性引物结构。本发明提供一种基于熔解曲线分析的侵袭性曲霉dpo引物检测方法，采用clustax比对ncbi上大量核酸序列，比对的菌种范围包括烟曲霉aj853744.1、ab197939.1、lc228654.1、lc171332.1、ln832990.1等264条序列；黄曲霉aj853764.1、lt594458.1、lc133097.1、lc133096.1、ln832989.1等351条序列；黑曲霉aj853742.1、aj280006.1、lc133093.1、ln832991.1、lm653115.1等168条序列；土曲霉ab661667.1、fn645432.1、ln832993.1、hg964331.1、lc317459.1等160条序列，通过比对上述943条序列，可以最大程度获得曲霉菌种内高保守区，得到不同临床分离株的高保守区和可变区，进而指导引物设计位置，提高对不同菌种的不同分离株的敏感性；另一方面，通过不同菌种间的序列比对，可以明确不同菌种间的高突变区和高保守区，提高dpo引物对不同曲霉菌种的特异性。通过预测烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉和土曲霉高度保守序列作为特异靶序列，利用its1区的种间差异进行引物设计，利用目标产物的熔解曲线分析，实现对于四种常见的曲霉多重检测。经比对发现，不同种间的曲霉菌的保守序列仍存在个别突变位点，通过设计dpo引物规避高度保守序列中的个别突变位点。本发明通过dpo引物对的设计显著提高检测特异性，同时仅用一对引物即可实现多重检测，较现有技术更为简便经济。具体的引物设计包括如下步骤：(1)多重序列比对确定目标序列的高保守区经比对发现曲霉菌的18srrna580-730bp区段出现半保守区，其余为高保守区，序列比对结果示意图见图1；(2)设计dpo引物利用18srrna-its1-5.8srrna-28srrna区域，18s、5.8s、28srrna突变少，而its1和its2区域种间突变较多的特点。在18s、5.8s、28srrna区域上跨its去设计引物，使得引物位于突变少的18s、5.8s、28srrna区，以保证不同曲霉的正常扩增及效率，而its区域的突变和差异使得不同曲霉种可以通过熔解曲线分析得以分析和确定，dpo引物设计示意图见图2，其中dpo引物中脱氧次黄嘌呤跨过目标序列的可变位点如图3所示。图中红框内为本发明dpo引物的设计区域，序列上方有*的表示保守，所以该段序列中有一个可变序列。本发明中，结合软件预测与人为预测，为保证引物设计的通用性，需要在保守序列区设计引物，以使得设计的引物序列在面对绝大多数临床样本中的曲霉菌种可以高效准确的扩增。但在设计引物的保守区出现的个别突变位点，设计的普通引物很难避免将该突变位点引入到引物中，会导致该引物在对存在该突变位点的临床分离株无法扩增(或者扩增效率大大下降)的情况出现，而通过多重序列分析，找出突变位点并利用dpo引物跨过该位点时，能够大大改善这种情况，提高引物体系的扩增效率和整套检测体系的敏感性。第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的dpo引物对在制备曲霉菌分种检测的产品中的应用。第三方面，本发明提供一种曲霉菌分种检测的试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的dpo引物对。优选地，所述阴性质控为含有拟南芥dna片段的质粒，所述拟南芥dna片段的核苷酸序列如seqidno.3所示，具体如下：catgattcagccaacataacccgacccgtacaattctattacgcgtctccggcgactgactatacttgccgttcggagttagggttttactccgagagaaaattgagtcagcgatgaatccgttgacaaggtgaagaagacgcagagcattaacgcgaaagaattagatctagggatttacgacgaagcatcttggcacgccaagtacaaagattcagcctacgtttacgtcggagaattaccttacgatctcacggagggtgacctcctcgccgttttctcacaatatggtgaagttgttgatttgaatcttgttcgagataaaggaactgggagatcaaaaagatttgcgtttgttgcttatgaagatcagagaagtactaatcttgctgttggataataaaagtggagcattgtggtaaatacttaaagagagaagaggaagatgaagagacgaagcagaagaagagagaagctccgtggtgtttgcagagcttttcagagaaaggagtgtactcgtggagattcttgcaaattttctcacgatgaaaatagagctgccaataccgggtggggtcacgaagatcgtagaagttccaagtgagagatcaagtaagtaaataccataatgatgtagaggataaatagggattgttcatattgatatccaagtggtaatgctctacattgaagaatggtttctaagttgtagctagaatctaatggaaaatgtgatttattgaccattagcttacacaccggtgttttgctctgtatatgtcgatcttattttcagtgttcacctttac.优选地，所述阳性质控分别为含有烟曲霉dna片段的质粒、含有黑曲霉dna片段的质粒、含有黄曲霉dna片段的质粒和含有土曲霉dna片段的质粒。优选地，所述烟曲霉dna片段、黑曲霉dna片段、黄曲霉dna片段和土曲霉dna片段的核苷酸序列分别如seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6和seqidno.7所示。本发明中，阴性质控和阳性质控均采用本领域常用的质粒pmd19，需要说明的是，任何满足阴性质控和阳性质控质粒构建的载体均可用于替换pmd19，此处无需特殊限定。烟曲霉dna片段的核苷酸序列如seqidno.4所示，具体如下：atatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggccccttcggggtccgcgttgtaatttgcagaggatgcttcgggtgcagcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcatagagggtgagaatcccgtctgggacggggtgtctgcgtccgtgtgaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgtttgcgaccagactcgcccgcggggttcagccggcattcgtgccggtgtacttccccgtgggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggccctcggaatgtatcacctctcggggtgtcttatagccgagggtgcaatgcggcctgcctggaccgaggaacgcgcttcggctcggacgctggcgtaatggtcgtaaatgac.黑曲霉dna片段的核苷酸序列如seqidno.5所示，具体如下：atatcaataagcggaggaaaagaaaccaaccgggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggctccttcggagtccgcattgtaatttgcagaggatgctttgggtgcggcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcagagagggtgagaatcccgtcttgggcggggtgtccgtgcccgtgtaaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcgaccagactcgcccgcggggttcagccggcattcgtgccggtgtacttccccgtgggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggcccctggaatgtagtgccctccggggcaccttatagccaggggtgcaatgcggccagcctggaccgaggaacgcgcttcggcacggacgctggcataatggtcgtaaacgac.黄曲霉dna片段的核苷酸序列如seqidno.6所示，具体如下：aaaccaaccgggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggctccttcggggtccgcattgtaatttgcagaggatgcttcgggtgcggcccctgtctaagtgccctggaacgggccgtcagagagggtgagaatcccgtctgggatggggtgtccgcgcccgtgtgaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaaaagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcgaccagactcgcctccagggttcagccggcattcgtgccggtgtacttccctgggggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggctcccggaatgtagtgccctccggggcaccttatagccgggagtgcaatgcggccagcctggaccgaggaacgcgcttcggcacggacgctggcataatggtcgtaaacgac.土曲霉dna片段的核苷酸序列如seqidno.7所示，具体如下：attgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggctccttcggggtccgcattgtaatttgcagaggatgcttcgggtgcagcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcatagagggtgagaatcccgtatggggcggggtgtctgcgtccgtgtgaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcaaccagactcgctcgcggggttcagccgggcttcggcccggtgtacttccccgcgggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggcctccggaatgtagcgcccttcggggcgccttatagccgggggtgcaatgcggccagcctggaccgaggaacgcgcttcggcacggacgctggca.优选地，所述辅助试剂包括taq酶、dntp、mgcl2、dmso、缓冲液和sybrgreeni染料。优选地，所述缓冲液包括tris-hcl和kcl。优选地，所述tris-hcl在缓冲液中的浓度为15-20mm，例如可以是15mm、16mm、17mm、18mm、19mm或20mm。优选地，所述kcl在缓冲液中的浓度为100-200mm，例如可以是100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm或200mm。第四方面，本发明提供一种曲霉菌分种检测的方法，包括使用第一方面所述的dpo引物对、第三方面所述试剂盒的步骤。优选地，所述方法包括如下步骤：(1)分别以待测样本的dna、阴性质控的质粒和阳性质控的四种质粒为模板，加入权利要求1所述dpo引物对、taq酶、dntp、mgcl2、dmso和sybrgreeni染料，进行实时荧光pcr反应；(2)通过产物的扩增曲线和熔解曲线分析判断样品中是否存在曲霉菌并确定曲霉菌菌种。优选地，步骤(1)所述taq酶的终浓度为0.5-5u，例如可以是0.5u、0.8u、1u、1.2u、1.5u、1.8u、2u、2.5u、3u、3.5u、4u、4.5u或5u。优选地，步骤(1)所述dntp的终浓度为0.1-5m，例如可以是0.1m、0.3m、0.5m、0.8m、1m、1.2m、1.5m、1.8m、2m、2.5m、2.8m、3m、3.5m、4m、4.5m、4.8m或5m。优选地，步骤(1)所述dpo引物对的终浓度为50-500nm，例如可以是50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm。优选地，步骤(1)所述mgcl2的终浓度为0.8-10nm，例如可以是0.8nm、1nm、1.2nm、1.5nm、1.8nm、2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm或10nm。优选地，步骤(1)所述模板的终浓度为0.1pg-10ng，例如可以是0.1pg、0.5pg、1pg、2pg、3pg、4pg、5pg、10pg、20pg、30pg、40pg、50pg、60pg、70pg、80pg、90pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1ng、2ng、3ng、4ng、5ng、6ng、7ng、8ng、9ng或10ng，优选为0.5-1ng。优选地，步骤(1)所述dmso的质量百分比为1-15％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。优选地，步骤(1)所述sybrgreeni染料的终浓度为0.5-2×。本发明中，染料的添加量为0.5-2×，本领域技术人员应当知晓并掌握根据染料的浓缩倍数调整到体系所需的工作浓度，例如荧光染料一般为sigma的sybrgreenidye10000×，为dmso溶解的10000倍浓缩液，使用时需要稀释到工作浓度。如终浓度为1×，需要将储存的浓缩液稀释1000倍，取2.5μl加入到体系中(25μl体系)。优选地，步骤(1)所述实时荧光pcr反应包括如下步骤：(1’)90-98℃预变性，1-2min，1个循环；(2’)90-98℃变性10s，55-60℃延伸35-45s，40-50个循环；(3’)65-97℃升温，1个循环。优选地，步骤(1’)之前还包括预热的过程：50℃，2min，1个循环。本发明中，通过预热激活反应体系中的酶系统，提高反应效率。优选地，步骤(1)所述实时荧光pcr反应具体包括如下步骤：(1”)50℃预热2min，1个循环；(2”)95℃预变性10min，1个循环；(3”)95℃变性10s，58℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；(4”)95℃5s，65℃1min；升温到97℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。本发明中，通过特定引物设计原则设计出的dpo引物对，配合本发明所述pcr反应体系以及反应条件，可以显著提高曲霉菌种的分种检测特异性，不与其他常见菌种如大肠杆菌、念珠菌或金黄色葡萄球菌进行交叉，同时检测的灵敏度高。现有技术中，为实现不同菌种的分种需要配合多种探针，不仅增加经济成本，同时增加检测体系中的复杂程度，体系的稳定性下降，且多种探针需要多个荧光通道进行分析，而本发明仅通过一对dpo引物对即可实现在同一荧光通道中对四种常见曲霉菌种的分种鉴定，方法简便高效。优选地，步骤(2)所述判断的标准为：(a)若检测通道的ct值不大于35，则为阳性结果，若检测通道的ct值大于35，则为阴性结果；(b)对阳性结果进一步分析，通过熔解曲线分析，比对产物与四种阳性质控的对应退火温度tm值，tm值相同的即判定待测样本含有对应阳性质控的曲霉菌种。第五方面，本发明提供一种如第三方面所述的试剂盒用于曲霉菌分种检测的用途。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明的dpo引物对可以特异性扩增曲霉菌属，不与其他常见致病菌属如念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌发生交叉，此外，本发明dpo引物对的设计使得不同曲霉菌种的产物具有不同退火温度，通过产物的熔解曲线分析，即可判定是烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉或土曲霉中的哪种；(2)本发明中，熔解曲线分析法可以在实时荧光pcr扩增反应后直接进行，无需开管操作，也可以在普通pcr扩增后转移到实时荧光pcr仪进行分析，且熔解曲线分析属于非消耗性检测，在分析结束后，样本保持pcr后的状态，可以多次重复分析；(3)本发明中，熔解曲线法能够在同一荧光通道中同时分析和检测多种曲霉菌种，根据扩增产物的tm值变化，可以在同一荧光通道中区分多种曲霉菌种的特异靶序列；(4)本发明的dpo引物设计特异性高，退火温度范围50-65℃，整个体系的反应温度容易调整。附图说明图1为不同曲霉菌种的18srrna-its1-5.8srrna-its2-28srrna序列多重比对结果示意图；图2为dpo引物设计示意图，其中pf1是dpo上游引物，pr1是dpo下游引物；图3为曲霉菌属目标序列中的可变位点；每列序列上方有*代表比对结果一致，位点保守，无*表示比对结果不一致，位点存在突变；图4为以含有烟曲霉dna片段的质粒为模板，检测产物的熔解曲线；图5为以含有黑曲霉dna片段的质粒为模板，检测产物的熔解曲线；图6为以含有黄曲霉dna片段的质粒为模板，检测产物的熔解曲线；图7为以含有土曲霉dna片段的质粒为模板，检测产物的熔解曲线；图8为实施例2中待测样本的扩增曲线；图9为实施例2中待测样本的熔解曲线；图10为实施例4中不同浓度质粒标准品以及空白对照的扩增曲线，其中曲线1-7分别对应的质粒拷贝数为106copies、105copies、104copies、103copies、102copies、101copies和100copies，8为无靶序列的空白对照；图11为实施例4中不同浓度质粒标准品以及空白对照的熔解曲线；图12为实施例5中不同浓度的阳性标准质粒以及阴性对照的扩增曲线；图13为实施例5中ct值与靶序列浓度的线性关系图；图14为对比例1中本发明dpo引物与普通引物分别扩增同一浓度样本的扩增曲线，其中曲线1为本发明dpo引物体系，曲线2为普通引物体系；图15为对比例1中本发明dpo引物与普通引物分别扩增同一浓度样本的熔解曲线，其中曲线1为本发明dpo引物体系，曲线2为普通引物体系。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。材料与仪器rochelightcycler480ii荧光定量pcr检测仪；大龙恒温振荡金属浴hm100-pro；大龙高速冷冻离心机d3204r；eppendorf移液器。以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员应当掌握使用常规材料及仪器的相关知识。实施例1试剂盒的组装dpo引物的核苷酸序列如seqidno.1-2所示：dpo上游引物序列(seqidno.1)：5’-acaaggtttccgtaggtgiiiiiicggaaggat-3’；dpo下游引物序列(seqidno.2)：5’-catttcgctgcgttcttciiiiiigcgagaacc-3’.阴性质控品：所述阴性质控为含有拟南芥dna片段的质粒，所述拟南芥dna片段的核苷酸序列如seqidno.3所示，具体序列如下：catgattcagccaacataacccgacccgtacaattctattacgcgtctccggcgactgactatacttgccgttcggagttagggttttactccgagagaaaattgagtcagcgatgaatccgttgacaaggtgaagaagacgcagagcattaacgcgaaagaattagatctagggatttacgacgaagcatcttggcacgccaagtacaaagattcagcctacgtttacgtcggagaattaccttacgatctcacggagggtgacctcctcgccgttttctcacaatatggtgaagttgttgatttgaatcttgttcgagataaaggaactgggagatcaaaaagatttgcgtttgttgcttatgaagatcagagaagtactaatcttgctgttggataataaaagtggagcattgtggtaaatacttaaagagagaagaggaagatgaagagacgaagcagaagaagagagaagctccgtggtgtttgcagagcttttcagagaaaggagtgtactcgtggagattcttgcaaattttctcacgatgaaaatagagctgccaataccgggtggggtcacgaagatcgtagaagttccaagtgagagatcaagtaagtaaataccataatgatgtagaggataaatagggattgttcatattgatatccaagtggtaatgctctacattgaagaatggtttctaagttgtagctagaatctaatggaaaatgtgatttattgaccattagcttacacaccggtgttttgctctgtatatgtcgatcttattttcagtgttcacctttac.阳性质控品：含有烟曲霉dna片段的质粒，含有黑曲霉dna片段的质粒、含有黄曲霉dna片段的质粒和含有土曲霉dna片段的质粒。其中，烟曲霉dna片段的核苷酸序列如seqidno.4所示，具体如下：atatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggccccttcggggtccgcgttgtaatttgcagaggatgcttcgggtgcagcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcatagagggtgagaatcccgtctgggacggggtgtctgcgtccgtgtgaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgtttgcgaccagactcgcccgcggggttcagccggcattcgtgccggtgtacttccccgtgggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggccctcggaatgtatcacctctcggggtgtcttatagccgagggtgcaatgcggcctgcctggaccgaggaacgcgcttcggctcggacgctggcgtaatggtcgtaaatgac.黑曲霉dna片段的核苷酸序列如seqidno.5所示，具体如下：atatcaataagcggaggaaaagaaaccaaccgggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggctccttcggagtccgcattgtaatttgcagaggatgctttgggtgcggcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcagagagggtgagaatcccgtcttgggcggggtgtccgtgcccgtgtaaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcgaccagactcgcccgcggggttcagccggcattcgtgccggtgtacttccccgtgggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggcccctggaatgtagtgccctccggggcaccttatagccaggggtgcaatgcggccagcctggaccgaggaacgcgcttcggcacggacgctggcataatggtcgtaaacgac.黄曲霉dna片段的核苷酸序列如seqidno.6所示，具体如下：aaaccaaccgggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggctccttcggggtccgcattgtaatttgcagaggatgcttcgggtgcggcccctgtctaagtgccctggaacgggccgtcagagagggtgagaatcccgtctgggatggggtgtccgcgcccgtgtgaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaaaagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcgaccagactcgcctccagggttcagccggcattcgtgccggtgtacttccctgggggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggctcccggaatgtagtgccctccggggcaccttatagccgggagtgcaatgcggccagcctggaccgaggaacgcgcttcggcacggacgctggcataatggtcgtaaacgac.土曲霉dna片段的核苷酸序列如seqidno.7所示，具体如下：attgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggctccttcggggtccgcattgtaatttgcagaggatgcttcgggtgcagcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcatagagggtgagaatcccgtatggggcggggtgtctgcgtccgtgtgaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcaaccagactcgctcgcggggttcagccgggcttcggcccggtgtacttccccgcgggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggcctccggaatgtagcgcccttcggggcgccttatagccgggggtgcaatgcggccagcctggaccgaggaacgcgcttcggcacggacgctggca.辅助试剂：taq酶、dntp、mgcl2、dmso和sybrgreeni染料。将装有上述组分的离心管及说明书等装入试剂盒中。实施例2曲霉菌分种检测采用实施例1中的试剂盒进行曲霉菌分种检测，包括如下步骤：(1)待测样本dna提取：(2)配制体系，具体体系组成见表1：表1组分剂量taqpolymerase2udntp2mprimers200nmmgcl23mmtris-hcl15mmkcl100mmtemplate2μldmso5％sybrgreenidye1×total25μl(3)将步骤(2)体系放入实时荧光pcr仪，进行pcr扩增反应，具体条件如下所示：(1”)50℃预热2min，1个循环；(2”)95℃预变性10min，1个循环；(3”)95℃变性10s，58℃延伸40s，延伸时采集荧光信号，45个循环；(4”)95℃5s，65℃1min；升温到97℃，0.2℃/s，连续采集荧光信号，5次/℃。步骤(4”)的检测荧光通道为sybrgreeni，运行pcr反应程序，保存文件；(4)结果判定：1)试剂盒有效性的判定：阴性质控组有效：阴性质控组在sybrgreeni通道下无典型扩增曲线或无ct值，否则可能存在试剂污染，请排除污染源后重测；阳性质控组有效：阳性质控组在sybrgreeni通道下均有典型扩增曲线，确认无误后通过调节阈值将阳性质控的ct值调节至20，并以此作为待测样本的阈值；2)检测样本的有效性判定：若ct值在，表明加入的dna量正常；3)曲霉菌分种判定：pcr循环扩增产物后，不同曲霉菌种dna序列的熔解温度不同，通过阳性质控的四种质粒进行仪器校准，本发明采用罗氏480进行检测，得到烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉和土曲霉对应的产物退火温度表(表2)，需要说明的是，任何满足实时荧光pcr的仪器均可，在此无需做具体限定，校准目的在于消除不同仪器带来的具体退火温度差异。表2不同曲霉菌种的退火温度tm值对照表菌种tm值cg含量产物长度烟曲霉83.248.00％204bp黑曲霉81.040.70％194bp黄曲霉82.144.60％177bp土曲霉87.557.00％214bp由表2可知，不同曲霉菌种的产物tm值差异较大，均在1℃以上，便于区分，特异性好，灵敏度高，不限于pcr仪器的具体测量值可能稍有偏差，但曲霉菌种间的tm值是相对稳定的，通过对阳性质控的检测，可以得到适用于任何机器的tm值对照表，阳性质控对应的熔解曲线图见图4-7，待测样本的扩增曲线见图8，熔解曲线见图9。比对待测样本产的tm值即可得知样本为哪种曲霉菌。由图8可知，待测样本中存在目标序列，且采用本发明试剂盒及相应的检测体系可以有效对其进行扩增，扩增呈典型s曲线，ct值大于20且小于35，表明试剂盒工作正常且扩增有效；由图9可知，扩增反应结束后进行熔解曲线分析，随检测进行，荧光值发生改变，可进一步确定扩增产物的退火温度tm值为83.18，通过表2比对可知，该待测样本为烟曲霉感染。需要说明的是，在本发明试剂盒各组分添加量范围内均可以实现对曲霉菌的分种检测，即，0.1-5m的dntp、50-500nm的dpo引物对、0.8-10nm的mgcl2、0.1pg-10ng的模板、1-15％的dmso以及0.5-2×的sybrgreeni染料，本实施例2仅列举其中的最优添加量配比。实施例3特异性检测分析分别提取新生隐球菌、格特隐球菌、构巢曲霉、杂色曲霉、酿酒酵母、马尔尼菲青霉、白色念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、百日咳杆菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的dna，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测，结果见表3。表3特异性检测结果由表3可知，本发明试剂盒的特异性好，能有效区分曲霉菌属和非曲霉菌属，非曲霉菌属无ct值表明其不能进行有效扩增，此外，对于最接近烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉的其他曲霉菌种如杂色曲霉和构巢曲霉，虽然能进行有效扩增，但产物退火温度差异1℃以上，可以有效区分不同曲霉菌种。实施例4灵敏度分析检测通过熔解曲线法检测不同浓度四种曲霉靶序列的质粒标准品的灵敏度，利用人工合成的烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉靶序列的质粒标准品(上海生工合成)即阳性质控，稀释成106copies、105copies、104copies、103copies、102copies、101copies、100copies。将其作为模板，用无靶序列的体系作为空白对照，使用实施例1中的试剂盒和实施例2中的方法，利用罗氏480ii荧光定量pcr仪器进行检测，并进行熔解曲线分析。扩增曲线图见图10，熔解曲线见图11。由图10的扩增曲线可知，在106copies-102copies质粒标准品存在的情况下，本发明都能给出较好的信号，在101copies-100copies质粒标准品存在的情况下，无法检测出荧光信号，在靶序列不存在的情况下，本发明无法检测出荧光信号。由图11的熔解曲线表明，在106copies-102copies质粒标准品存在的情况下，能够形成独特且一致的熔点，形成图中的单峰；在101copies-100copies质粒标准品存在的情况下，无法形成独特一致的单峰，在靶序列不存在的情况下，无单峰。因此，采用本发明进行熔解曲线法检测曲霉菌靶序列的质粒标准品的灵敏度可达102copies。实施例5定量分析定量检测四种曲霉菌：将本试剂盒可检测的四种曲霉菌每种浓度为1ng/μl等量均匀混合，进行10倍连续梯度稀释制备成7个浓度点的标准曲线，每个浓度进行3个复孔，使用拟南芥的基因片段做为阴性对照，扩增曲线见图12，建立起ct值与浓度之间的线性关系见图13。由图13可知，标准曲线在pcr反应的线性扩增区域形成线性方程y＝3.445x+7.4314，r2＝0.9996,试剂盒扩增效率是95.11％，其线性范围是：1ng/μl～0.000001ng/μl。在测量样本时，上述标准曲线、阴性对照以及未知浓度的样本dna进行荧光pcr反应，使用罗氏lightcycler480ii、abi7500、steponeplus等荧光定量pcr仪时，其内置分析软件可以根据标准曲线和样本的ct值，计算出样本中的靶基因的核酸浓度，进行定量分析。对比例1采用普通引物进行曲霉菌种的检测鉴定，所述普通引物的序列如seqidno.8-9所示，同时采用本发明的dpo引物与配套试剂盒进行检测对比，扩增曲线见图14，熔解曲线见图15，其中1为本发明的dpo引物体系，2为普通引物体系。seqidno.8:5’-cttggatttgctgaagactaac-3’；seqidno.9:5’-ctaactttcgttccctgattaatg-3’.由图14可知，针对同一浓度的目标序列dna，本发明dpo引物对及配套试剂盒检测体系的配合可以显著提高扩增效率，明显高于普通引物的扩增效率；由图15可知，本发明的dpo引物对及配套试剂盒检测体系可以显著提高检测的特异性，而普通引物对扩增产物呈现非特性性扩增峰。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>丹娜（天津）生物科技有限公司<120>一种曲霉菌分种检测的dpo引物对、检测方法、试剂盒及其应用<130>2019<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>33<212>dna<213>人工合成序列<220><221>misc_feature<222>(19)..(24)<223>nisa,c,g,ort<400>1acaaggtttccgtaggtgnnnnnncggaaggat33<210>2<211>33<212>dna<213>人工合成序列<220><221>misc_feature<222>(19)..(24)<223>nisa,c,g,ort<400>2catttcgctgcgttcttcnnnnnngcgagaacc33<210>3<211>809<212>dna<213>人工合成序列<400>3catgattcagccaacataacccgacccgtacaattctattacgcgtctccggcgactgac60tatacttgccgttcggagttagggttttactccgagagaaaattgagtcagcgatgaatc120cgttgacaaggtgaagaagacgcagagcattaacgcgaaagaattagatctagggattta180cgacgaagcatcttggcacgccaagtacaaagattcagcctacgtttacgtcggagaatt240accttacgatctcacggagggtgacctcctcgccgttttctcacaatatggtgaagttgt300tgatttgaatcttgttcgagataaaggaactgggagatcaaaaagatttgcgtttgttgc360ttatgaagatcagagaagtactaatcttgctgttggataataaaagtggagcattgtggt420aaatacttaaagagagaagaggaagatgaagagacgaagcagaagaagagagaagctccg480tggtgtttgcagagcttttcagagaaaggagtgtactcgtggagattcttgcaaattttc540tcacgatgaaaatagagctgccaataccgggtggggtcacgaagatcgtagaagttccaa600gtgagagatcaagtaagtaaataccataatgatgtagaggataaatagggattgttcata660ttgatatccaagtggtaatgctctacattgaagaatggtttctaagttgtagctagaatc720taatggaaaatgtgatttattgaccattagcttacacaccggtgttttgctctgtatatg780tcgatcttattttcagtgttcacctttac809<210>4<211>593<212>dna<213>人工合成序列<400>4atatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtaacggcgagtgaagc60ggcaagagctcaaatttgaaagctggccccttcggggtccgcgttgtaatttgcagagga120tgcttcgggtgcagcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcatagagggtgagaat180cccgtctgggacggggtgtctgcgtccgtgtgaagctccttcgacgagtcgagttgtttg240ggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccg300atagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagc360acgtgaaattgttgaaagggaagcgtttgcgaccagactcgcccgcggggttcagccggc420attcgtgccggtgtacttccccgtgggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaag480gccctcggaatgtatcacctctcggggtgtcttatagccgagggtgcaatgcggcctgcc540tggaccgaggaacgcgcttcggctcggacgctggcgtaatggtcgtaaatgac593<210>5<211>593<212>dna<213>人工合成序列<400>5atatcaataagcggaggaaaagaaaccaaccgggattgcctcagtaacggcgagtgaagc60ggcaagagctcaaatttgaaagctggctccttcggagtccgcattgtaatttgcagagga120tgctttgggtgcggcccccgtctaagtgccctggaacgggccgtcagagagggtgagaat180cccgtcttgggcggggtgtccgtgcccgtgtaaagctccttcgacgagtcgagttgtttg240ggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccg300atagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaacagc360acgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcgaccagactcgcccgcggggttcagccggc420attcgtgccggtgtacttccccgtgggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaag480gcccctggaatgtagtgccctccggggcaccttatagccaggggtgcaatgcggccagcc540tggaccgaggaacgcgcttcggcacggacgctggcataatggtcgtaaacgac593<210>6<211>571<212>dna<213>人工合成序列<400>6aaaccaaccgggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaag60ctggctccttcggggtccgcattgtaatttgcagaggatgcttcgggtgcggcccctgtc120taagtgccctggaacgggccgtcagagagggtgagaatcccgtctgggatggggtgtccg180cgcccgtgtgaagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtg240gtaaatttcatctaaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatc300gaaagatgaaaagcactttgaaaagagagttaaaaagcacgtgaaattgttgaaagggaa360gcgcttgcgaccagactcgcctccagggttcagccggcattcgtgccggtgtacttccct420gggggcgggccagcgtcggtttgggcggccggtcaaaggctcccggaatgtagtgccctc480cggggcaccttatagccgggagtgcaatgcggccagcctggaccgaggaacgcgcttcgg540cacggacgctggcataatggtcgtaaacgac571<210>7<211>542<212>dna<213>人工合成序列<400>7attgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaagagctcaaatttgaaagctggctccttcg60gggtccgcattgtaatttgcagaggatgcttcgggtgcagcccccgtctaagtgccctgg120aacgggccgtcatagagggtgagaatcccgtatggggcggggtgtctgcgtccgtgtgaa180gctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggtggtaaatttcatc240taaagctaaatactggccggagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaa300gcactttgaaaagagagttaaacagcacgtgaaattgttgaaagggaagcgcttgcaacc360agactcgctcgcggggttcagccgggcttcggcccggtgtacttccccgcgggcgggcca420gcgtcggtttgggcggccggtcaaaggcctccggaatgtagcgcccttcggggcgcctta480tagccgggggtgcaatgcggccagcctggaccgaggaacgcgcttcggcacggacgctgg540ca542<210>8<211>22<212>dna<213>人工合成序列<400>8cttggatttgctgaagactaac22<210>9<211>24<212>dna<213>人工合成序列<400>9ctaactttcgttccctgattaatg24当前第1页12