检测鸡毒支原体F弱毒疫苗株的引物对及方法与流程

本发明涉及一种检测菌株的引物对及方法，具体涉及一种检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的引物对及方法，属于生物检测技术领域。

背景技术：

鸡毒支原体(mycoplasmagalliscepticum，mg)感染是鸡呼吸道病的一种，主要引起慢性呼吸道病(chronicrespiratorydisease，crd)、气囊炎和窦炎。随着养鸡规模加大、饲养方式改变和饲养密度提高，鸡毒支原体感染发病率越来越高，主要影响雏鸡生长和使成年鸡产蛋减少，造成养鸡业经济上的重大损失，危害性日益突出，受到养鸡业者的普遍关注。鸡毒支原体感染一般为一次感染会终生处于持续性感染的带菌状态，其主要传播方式是鸡与鸡之间的水平接触式传播，即随呼吸道分泌物排出，通过飞沫和尘埃经呼吸道感染。另外，垂直传播也是其传播的主要方式。

目前，国家要求原种鸡场对支原体、马立克、禽白血病等多种疾病尽快完成净化，各养殖集团主要通过生物安全隔离和其他控制措施加以防范，但除禽白血病外，其他禽类相关疾病的净化工作仍然未取得明显进展，主要原因在于没有行之有效的检测手段，常规的临床诊断与病理变化诊断无法确诊，血清学检测周期过长且存在结果不准的缺陷，最精准的检测当属利用分子生物学确定病原，淘汰阳性感染包括病毒携带种鸡。但国内疫苗免疫混乱，常用的mg疫苗就有ts11、6/85、f株3种活苗，除此之外，还有r株和s株等野毒株，如果不能对疫苗株与野毒株很好的加以区分，那么种鸡场的净化工作将成为空谈。只有确定每只种鸡确实是支原体阴性或者只有接种疫苗株的阳性，才能够做到正确淘汰，实现净化。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的引物对及方法，利用本发明提供的引物对和检测方法检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、快速且结果可靠。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的引物对，其特征在于，该引物对包括：

上游引物：aatggatccatgaaaatggaggtca；

下游引物：actctcgagttaaatgtaggtgagat。

一种检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

step1：提取待测样品的dna；

step2：以step1提取到的dna为模板，以前述引物对为引物，进行pcr扩增反应；

step3：pcr扩增反应结束后，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；

step4：观察电泳检测图，根据有无特异性扩增产物的目的条带出现来判定待测样品中是否含有鸡毒支原体f弱毒疫苗株。

前述的检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的方法，其特征在于，在step1中，使用青岛英赛特生物科技有限公司研发的棉拭子dna提取试剂盒来提取待测样品的dna。

前述的检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的方法，其特征在于，在step2中，pcr扩增反应的反应体系为：2×mix10μl，ddh2o4μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板5μl。

前述的检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的方法，其特征在于，在step2中，pcr扩增反应的反应程序为：95℃变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。

前述的检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的方法，其特征在于，在step4中，判定待测样品中是否含有鸡毒支原体f弱毒疫苗株的方法为：在紫外灯下观察电泳检测图并与标准分子量相对照，若待测样品在356bp处出现了明亮的条带，而其他疫苗株与野毒株和阴性对照均没有目的条带，则证明该待测样品中存在鸡毒支原体f弱毒疫苗株。

本发明的有益之处在于：

1、特异性引物对

本发明设计了对鸡毒支原体f弱毒疫苗株具有特异扩增作用的pcr引物对，并已经对鸡毒支原体ts11疫苗、鸡毒支原体f疫苗、鸡毒支原体6/85疫苗、野毒r株与野毒s6株为供试材料进行了验证，只有鸡毒支原体f弱毒疫苗株的样品能特异性地扩增出一条356bp的电泳条带，这说明本发明设计的引物对具有很强的特异性和准确性。

2、检测方法

(1)检测周期短：pcr检测方法可以2h得出结果，而传统培养扩增测序方法检测周期要一个星期。

(2)实用性强：目前国家要求原种鸡场对支原体尽快完成净化，但是如果对支原体疫苗株和野毒株无法进行正确的判定，那么净化只能成为一种空想，f弱毒疫苗株的鉴定能够有效区分f弱毒疫苗株与其他鸡毒支原体，能够帮助种鸡场判断该场的支原体阳性鸡体内的抗原是不是来源于本场的f疫苗接种，本发明提供的检测方法实现了鸡毒支原体f弱毒疫苗株的快速检测，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1是对鸡毒支原体疫苗进行pcr扩增后获得的凝胶电泳图；

图2是对从鸡毒支原体疫苗提取的dna进行10倍梯度稀释后再pcr扩增和凝胶电泳所获得的凝胶电泳图；

图3是对发病组织进行pcr扩增后获得的凝胶电泳图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

一、设计特异性引物

为了获得检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的引物对，我们以青岛易邦生物科技有限公司生产的鸡毒支原体ts11疫苗、鸡毒支原体f疫苗、鸡毒支原体6/85疫苗以及山东益生畜牧兽医科学研究院提供的野毒r株与野毒s6株为供试材料，使用青岛英赛特生物科技有限公司研发的棉拭子dna提取试剂盒提取样品核酸，具体操作步骤如下：

(1)向疫苗中加入400μlpbs，浸泡疫苗；

(2)取200μl上清液，加入300μl缓冲液la，涡旋震荡30s，56℃水浴10min；

(3)离心2min，取上清，加入150μl缓冲液b0，轻轻混匀后，室温放置5min，加入150μl异丙醇，混匀后将溶液转移至吸附柱中，13000g离心1min，弃收集管中的废液，将吸附柱重新套入收集管中；

(4)向吸附柱中加入600μl清洗液，13000g离心1min，弃收集管中废液，将吸附柱重新套入收集管中；

(5)再次向吸附柱中加入600μl清洗液，13000g离心1min，弃收集管中废液，将吸附柱重新套入收集管中，13000g离心2min；

(6)将吸附柱置于干净的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央部位悬空滴加50μl洗脱液(或灭菌双蒸水)，室温静置5min，13000g离心2min，即得到病毒dna，-20℃保存。

根据genbank中的序列差异，我们用primer5软件设计了检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的引物对，该引物对的序列如下：

上游引物：aatggatccatgaaaatggaggtca；

下游引物：actctcgagttaaatgtaggtgagat。

二、检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株

在已设计的特异性引物对的基础上，我们通过优化pcr反应体系和扩增参数，建立了检测鸡毒支原体f弱毒疫苗株的方法。

step1：提取待测样品的dna

使用青岛英赛特生物科技有限公司研发的棉拭子dna提取试剂盒来提取待测样品的dna。具体操作如下：

(1)将在咽部(或鼻腔等部位)擦拭过的棉拭子转移到2ml离心管中，加入200μlpbs，浸泡过夜(效果更佳)；

(2)取200μl上清液，加入300μl缓冲液la，涡旋震荡30s，56℃水浴10min；

(3)离心2min，取上清，加入150μl缓冲液b0，轻轻混匀后，室温放置5min，加入150μl异丙醇，混匀后将溶液转移至吸附柱中，13000g离心1min，弃收集管中的废液，将吸附柱重新套入收集管中；

(4)向吸附柱中加入600μl清洗液，13000g离心1min，弃收集管中废液，将吸附柱重新套入收集管中；

(5)再次向吸附柱中加入600μl清洗液，13000g离心1min，弃收集管中废液，将吸附柱重新套入收集管中，13000g离心2min；

(6)将吸附柱置于干净的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中央部位悬空滴加50μl洗脱液(或灭菌双蒸水)，室温静置5min，13000g离心2min，即得到鸡毒支原体dna，-20℃保存。

step2：pcr扩增

以step1提取到的dna为模板，以下列引物对为引物，进行pcr扩增反应：

上游引物：aatggatccatgaaaatggaggtca；

下游引物：actctcgagttaaatgtaggtgagat。

pcr扩增反应的反应体系为：2×mix10μl，ddh2o4μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板5μl。

pcr扩增反应的反应程序为：95℃变性3min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次；72℃延伸10min。

step3：琼脂糖凝胶电泳

pcr扩增反应结束后，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

step4：结果判定

观察电泳检测图，根据有无特异性扩增产物的目的条带出现来判定待测样品中是否含有鸡毒支原体f弱毒疫苗株。

判定待测样品中是否含有鸡毒支原体f弱毒疫苗株的方法为：

在紫外灯下观察电泳检测图并与标准分子量相对照，若待测样品在356bp处出现了明亮的条带，而其他疫苗株与野毒株和阴性对照均没有目的条带，则证明该待测样品中存在鸡毒支原体f弱毒疫苗株。

本次对鸡毒支原体疫苗进行pcr扩增后获得的凝胶电泳图如图1所示，点样顺序从左至右依次为：

泳道1：marker；

泳道2：鸡毒支原体ts11疫苗；

泳道3：鸡毒支原体f疫苗；

泳道4：鸡毒支原体6/85疫苗；

泳道5：野毒r株；

泳道6：野毒s6株；

泳道7：阴性对照。

从电泳结果可以看出，鸡毒支原体f疫苗出现了特异性扩增条带，鸡毒支原体ts11疫苗、鸡毒支原体6/85疫苗、野毒r株、野毒s6株与阴性对照均无扩增条带，这说明：本发明提供的检测方法成立。

三、对检测方法进行评价

用无菌超纯水对鸡毒支原体f弱毒疫苗株基因组dna进行稀释，配置成10倍数量级的系列浓度备用，浓度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，使用本发明提供的引物对对不同系列浓度的基因组dna进行pcr扩增，评估该引物对对鸡毒支原体f弱毒疫苗株基因组dna检测的灵敏性。

对pcr扩增产物进行凝胶电泳后获得的凝胶电泳图如图2所示，点样顺序从左至右依次为：

泳道1：marker；

泳道2：10^-1稀释度；

泳道3：10^-2稀释度；

泳道4：10^-3稀释度；

泳道5：10^-4稀释度；

泳道6：10^-5稀释度；

泳道7：10^-6稀释度；

泳道8：10^-7稀释度；

泳道9：10^-8稀释度；

泳道10：阴性对照。

从电泳结果可以看出，鸡毒支原体f弱毒疫苗株基因组dna浓度为10^-6稀释度时，仍可以检测到，这说明：本发明提供的检测方法检测灵敏。

四、对发病鸡组织中的鸡毒支原体f弱毒疫苗株进行检测

采用本发明提供的检测方法对发病鸡组织中的鸡毒支原体f弱毒疫苗株进行检测，检测结果见图3，点样顺序如下：

泳道1：marker；

泳道2：鸡毒支原体f疫苗；

泳道3：免疫鸡毒支原体f疫苗鸡1；

泳道4：免疫鸡毒支原体f疫苗鸡2；

泳道5：免疫鸡毒支原体f疫苗鸡3；

泳道6：未免疫鸡毒支原体f疫苗鸡1；

泳道7：未免疫鸡毒支原体f疫苗鸡2；

泳道8：未免疫鸡毒支原体f疫苗鸡3；

泳道9：阴性对照。

从电泳结果可以看出，免疫鸡毒支原体f疫苗的鸡1、鸡2和鸡3均检测出了鸡毒支原体f弱毒疫苗株，未疫鸡毒支原体f疫苗的鸡1、鸡2、鸡3以及阴性对照均无特异性条带出现，这说明：

(1)本发明提供的特异性引物对，可以将鸡毒支原体f弱毒疫苗株与其他鸡毒支原体疫苗株和野毒株分开来；

(2)本发明提供的检测方法，可用于鸡毒支原体f弱毒疫苗株快速可靠的检测和鉴定。

需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。