一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法与流程

本发明涉及一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，属于生物医药技术领域。

背景技术：

胎盘是一个暂时性的器官，是母体和胎儿的直接联系枢纽，在整个妊娠期内对胎儿的发育和生长相当重要，有重要的生理作用，可在胎儿和母体之间进行养分、气体和代谢废物的交换；不仅如此，胎盘在妊娠期间还参与了胎儿的免疫保护，因此胎盘是一个具有多功能的器官。

有研究表明：宝宝出生后胎盘中还保留有丰富的生命资源，可以分离出大量胎盘亚全能干细胞，其发育阶段与胚胎干细胞接近，具备全能干细胞的生物学特征，数量丰富，分化能力强，可定向分化为血管内皮细胞、上皮干细胞、神经干细胞、肝脏细胞、心肌细胞、脂肪细胞、骨、软骨样细胞等。因此亚全能干细胞具有重要的临床意义，成为研究的热点，但是，如何从胎盘中成功高效地分离获得胎盘亚全能干细胞是干细胞研究中的难点。

现有胎盘亚全能干细胞分离方法包括羊膜预处理-酶解消化-两步离心步骤；其中羊膜预处理是从胎盘剥离羊膜(局部将羊膜用镊子提起，然后用剪刀剪下)，并用ph＝7.2-7.4的d-hank’s平衡盐液冲洗至无残留血液后，剪碎得到5×5cm²羊膜块；而后将羊膜块上皮层向下，放入d-hank’s平衡盐液润湿底部的培养皿中，使用载玻片将间充质层的胶状物质刮下，最后将去胶的羊膜块放入10ml含10％(w/v)n-乙酰基-l-半胱氨酸的d-hank’s平衡盐溶液，室温孵育15min，去除羊膜上的黏液，得到羊膜样块；

酶解消化步骤是将羊膜样块置于20ml蛋白酶溶液中，在37℃下气浴消化30min，得到消化后羊膜和消化液；所述消化液过滤，得到细胞悬液；

两步离心步骤是将细胞悬液过筛并收集筛下物，经初步离心后，将底层细胞用d-hank’s平衡盐溶液吹打；而后用d-hank’s平衡盐溶液重悬细胞，向重悬后的细胞悬液加入ficoll淋巴细胞分离液，再次经离心分离后，细胞悬液分为三层，中层为人胎盘亚全能干细胞。

现有胎盘亚全能干细胞分离方法中，局部将羊膜用镊子提起，然后用剪刀剪下，均为不规则的碎块，而且羊膜极薄，很容易剥碎，一方面无法确保羊膜完全取尽，导致人胎盘亚全能干细胞的得率较低；

另一方面，现有胎盘亚全能干细胞分离方法中，羊膜用镊子剥离得到的碎块不规则，不便于使用细胞刮刮去凝血和胶状物，影响了酶解效果，最终得到的人胎盘亚全能干细胞中杂细胞较多，为得到纯度更高的人胎盘亚全能干细胞，需要在重悬时加入ficoll淋巴细胞分离液，比重较大的杂细胞(如红细胞)离心后沉于管底，比重较小的杂细胞(如单核细胞)漂浮于分层液的液面上，人胎盘亚全能干细胞夹于两层液面之间，由于传统方法得到的人胎盘亚全能干细胞量少，取出操作费时费力；而且从两层液面之间取出人胎盘亚全能干细胞时，极易取不干净或连同其他杂细胞一同取出，影响细胞得率和纯度。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能够减少分离时间，并得到得率和纯度较高的人胎盘亚全能干细胞的分离方法。

本发明由如下技术方案实施：一种人胎盘亚全能干细胞的分离方法，包括如下步骤：s1.羊膜样品制备；s2.羊膜试样制备；s3.酶解；其中：

所述s1.羊膜样品制备：将待取羊膜的胎盘盘面分为规则的区域，而后揭起羊膜并按照分好的区域裁剪，得到规则的羊膜样品；

所述s2.羊膜试样制备：将所述羊膜样品用ph＝7.2-7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，并用镊子和细胞刮处理羊膜样品上的凝血和胶状物，待羊膜样品呈半透明状，以防影响后续酶的消化效率，得到羊膜试样；

所述s3.酶解，将羊膜试样酶解，制得人胎盘亚全能干细胞。

羊膜位于胎盘的最内层，主要由来源于外胚层的上皮细胞和来源于中胚层的间充质细胞构成，其不含血管，细胞成分相对简单，在胎儿娩出后即成为废弃物；

胎盘上的凝血是粘附在羊膜上的黑红色块状物，胶状物附着在羊膜表面，呈透明状，用镊子取大块的凝血，然后用细胞刮轻柔缓慢刮下羊膜上剩余的凝血和明胶，观察羊膜呈半透明状，即为羊膜已处理干净。由于凝血及凝血表面含有血清，而血清能够抑制胰蛋白酶的活性，所以处理后的羊膜可以提高胰蛋白酶对羊膜细胞的消化效率，获得更多的羊膜上皮细胞。

进一步的，所述s1.羊膜样品制备中，羊膜样品形状为环形、多边形中的任意一种。

进一步的，所述s1.羊膜样品制备：将胎盘有脐带连接口的一面朝上放置，以脐带与胎盘连接处为起点，以顶点与胎盘边缘的连线为轴线圆周分区，将羊膜取下，得到环状的羊膜样品。

进一步的，环状的所述羊膜样品的宽度为3-5cm。

进一步的，所述s1.羊膜样品制备：将胎盘有脐带连接口的一面朝上放置，以脐带与胎盘连接处为起点，以顶点与胎盘边缘的连线为裁剪起点，进行多边形或扇形分区。

进一步的，所述s3.酶解包括如下步骤：

s3.1.一次酶解：将s2.羊膜试样制备中得到的羊膜试样放入预处理后的0.1(w/v)％胰蛋白酶溶液中，确保羊膜试样充分展平、无折叠，胰蛋白酶溶液可以采用市售胰蛋白酶粉兑水制得，羊膜试样表面积与胰蛋白酶溶液体积比(s/v)＝10cm²：(0.8-1.5)ml；在37℃下酶解10-15min，为了清除一次酶解产物粘附于羊膜试样表面，将一次酶解后的羊膜试样用磷酸盐缓冲液清洗，以便保证羊膜表面的清洁，得到一次酶解试样；一次酶解的目的是去除羊膜上的残留杂细胞；

s3.2.二次酶解：将s3.1.一次酶解得到的一次酶解试样放入预处理后的0.1(w/v)％胰蛋白酶溶液中，确保一次酶解试样充分展平、无折叠，一次酶解试样表面积与胰蛋白酶溶液体积比(s/v)＝10cm²：(0.8-1.5)ml；在37℃下酶解45-60min，分离得到二次酶解液和二次酶解试样，而后在二次酶解液中加入胎牛血清终止酶解；

s3.3.得到人胎盘亚全能干细胞：s3.2.二次酶解得到的加入胎牛血清的二次酶解液经100目的细胞筛过滤，收集细胞初悬液，送入离心机内离心，弃掉上清液，而后加入dmem细胞培养液重悬细胞，得到人胎盘亚全能干细胞悬液，人胎盘亚全能干细胞需接种到培养瓶中，37℃培养箱内培养。

进一步的，由于酶解下来的人胎盘亚全能干细胞会粘附或被包裹在二次酶解试样里，为收集更多的人胎盘亚全能干细胞，所述s3.2.二次酶解得到的二次酶解试样用磷酸盐缓冲液冲洗，得到的冲洗液加入二次酶解液中。

进一步的，所述胰蛋白酶溶液的预处理方法是将4℃保存的胰蛋白酶溶液放入37℃培养箱中预热，直到胰蛋白酶溶液达到37℃。

进一步的，所述s3.3.得到人胎盘亚全能干细胞中，所述细胞初悬液的离心速度为1500r/min。

进一步的，所述s3.3.得到人胎盘亚全能干细胞中，所述细胞初悬液的离心时间10min。

进一步的，所述s3.3.得到人胎盘亚全能干细胞中，所述dmem细胞培养液的加入量为10ml。

本发明的优点：

1、本方案包括羊膜样品制备-羊膜试样制备-一次酶解-二次酶解-得到人胎盘亚全能干细胞，减少了工序，流程短，工序简单，而且在羊膜试样制备步骤中，采用分区剥离羊膜的方式，羊膜不易碎，一方面规则的羊膜样品便于后续的冲洗、细胞刮去凝血和胶状物、一次酶解和二次酶解作业，另一方面分区剥离羊膜的方式能够确保羊膜取尽，保证了人胎盘亚全能干细胞的得率。

2、本方案分区剥离的羊膜样品规则整齐，便于清理，羊膜上的凝血和胶状物清理干净，保证了酶解效果；而且清理后的羊膜试样采用两次酶解，第一次酶解去除羊膜上的杂细胞，例如：红细胞、白细胞、单核细胞等，因此无需再使用ficoll淋巴细胞分离液分离，也能得到纯度较高的人胎盘亚全能干细胞；细胞悬液由传统的两次离心操作减少为一次离心操作，人胎盘亚全能干细胞的分离时间由传统方法的3h左右减少到了本方法的2h左右，减少了人胎盘亚全能干细胞的分离时间，提高了分离效率。

附图说明：

图1是tpsy-2体外生长3天时的图片；

图2是tpsy-2体外生长5天时的图片；

图3是tpdz-2体外生长3天时的图片；

图4是tpdz-2体外生长5天时的图片；

图5是tpsy-1流式细胞分析的流式图；

图6是tpdz-1流式细胞分析的流式图；

图7是tpsy-2流式细胞分析的流式图；

图8是tpdz-2流式细胞分析的流式图；

图9是tpsy-3流式细胞分析的流式图；

图10是tpdz-3流式细胞分析的流式图。

具体实施方式：

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

取一个胎盘放入肾形盘中，有脐带连接口的一面朝上，使用镊子和剪刀，以脐带与胎盘的连接处为顶点，以顶点与胎盘边缘的连线为轴线剪开羊膜，并沿该轴线的相对于该顶点的对称线再剪开，将整个胎盘分为两块，一块胎盘采用实施例1的方法分离人胎盘亚全能干细胞，另一块采用实施例2的方法分离人胎盘亚全能干细胞。

实施例1：

以脐带与胎盘连接处为圆点，以顶点与胎盘边缘的连线为轴线圆周分区，将羊膜取下，得到宽度为3-5cm的环状羊膜样品。

将取下的环状的胎盘羊膜用派ph值7.3的磷酸盐缓冲液冲洗三遍，之后放入肾形盘中用镊子和细胞刮将膜上的凝血块和胶状物质处理干净，得到羊膜试样，防止影响酶的消化效率；胎盘上的凝血块是粘附在膜上的黑红色块状物，胶状物是附着在羊膜表面，呈透明状的粘性物质，在肾形盘中用镊子取掉大块的凝血，然后用细胞刮轻柔缓慢刮下羊膜上剩余的凝血和胶状物，观察羊膜呈半透明状，即为羊膜已处理干净。由于凝血及凝血表面含有血清，而血清能够抑制胰蛋白酶的活性，所以处理后的羊膜可以提高胰蛋白酶的消化效率，以便获得更多的羊膜上皮细胞。

将处理好的羊膜分别放入50ml离心管中进行一次酶解，每个离心管内放入一条羊膜试样，向离心管中加入预处理(37℃温浴)的0.1(w/v)％的胰蛋白酶溶液，羊膜试样表面积与胰蛋白酶溶液体积比(s/v)＝10cm²：1ml，在37℃消化10min；

将一次酶解的消化液倒掉，为了清除第一次胰蛋白酶消化下来的产物粘附于羊膜表面，用20ml磷酸盐缓冲液清洗羊膜两遍，以便保证羊膜表面的清洁；

将羊膜分别放回50ml离心管，每个离心管加入预处理(37℃温浴)过的0.1(w/v)％胰蛋白酶溶液，羊膜试样表面积与胰蛋白酶溶液体积比(s/v)＝10cm²：1ml，37℃消化45min；

将消化液分别收集到新的50ml离心管中并加入1ml国产胎牛血清终止消化，为了将消化下来的胎盘亚全能干细胞收集完全，再用20ml磷酸盐缓冲液冲洗羊膜，并将缓冲液分别收集到盛有消化液的离心管中；

将收集的细胞液经100目的细胞筛过滤后，收集细胞初悬液，置于新的50ml离心管中；而后送入离心机，在1500r/min离心10min，弃上清液，加入10mldmem细胞培养液重悬细胞，分别接种到t75培养瓶中，37℃培养箱培养。

实施例2

将羊膜从胎盘随意剥离，用ph＝7.3的d-hank’s平衡盐液反复冲洗，去除残留的血液，将羊膜剪碎为5×5cm²小块；

向6-cm的培养皿内滴入1mld-hank’s平衡盐溶液，润湿培养皿底部，将羊膜的上皮层向下放置于培养皿内，使用载玻片将间充质层的胶状物质刮下；

将刮好胶的羊膜放入10ml含10(w/v)％n-乙酰基-l-半胱氨酸的d-hank’s平衡盐溶液，室温孵育15min；去除羊膜上残余的黏液，以便于消化完全；

向羊膜加入20ml蛋白酶溶液，在37℃温度条件下气浴消化30min，收集消化液并加入5ml胎牛血清；其中所述蛋白酶溶液为0.15(w/v)％的胶原蛋白酶ii-edta溶液与0.25(w/v)％的胰蛋白酶-edta溶液以1:9的体积比混合；

消化结束后，使用d-hank’s平衡盐溶液反复冲洗羊膜；

将消化液和清洗下来的液体合并，经100目筛网过滤，重复两次，得到细胞悬液；

细胞悬液置于离心机中以2000r/min的转速离心15min，将底层细胞用d-hank’s平衡盐溶液反复吹打，再以1500r/min的转速离心10min，弃去上清液；

用10mld-hank’s平衡盐溶液重悬细胞，向细胞悬液缓缓加入10mlficoll淋巴细胞分离液，离心8min，不使用制动减速；

离心结束后，将两层液面间的细胞吸出；使用d-hank’s平衡盐溶液清洗吸出的细胞，以1500r/min的转速离心5min，去上清液，加入10mldmem培养基将细胞沉淀吹打均匀，得到人胎盘亚全能干细胞，之后加入t75培养瓶37℃恒温培养箱培养。

取实施例1和实施例2中相同圆周位置得到的人胎盘亚全能干细胞细胞悬液作为一个对照组进行对照实验，本实施例中取三个对照组，第一对照组命名为tpsy-1(实施例1方法得到的细胞悬液)和tpdz-1(实施例2方法得到的细胞悬液)，第二对照组命名为tpsy-2(实施例1方法得到的细胞悬液)和tpdz-2(实施例2方法得到的细胞悬液)，第三对照组命名为tpsy-3(实施例1方法得到的细胞悬液)和tpdz-3(实施例2方法得到的细胞悬液)；

实施例3：

三个对照组的细胞悬液均进行体外生长，三天后和五天后采用显微镜观察细胞生长情况，第一对照组的生长情况如图1-图4所示；

由于胎盘亚全能干细胞的形态是圆形的，图1-3中细胞形态基本是圆形的，而图4中有梭形细胞，可见本专利方法分离的细胞相对于传统方法分离的人胎盘亚全能干细胞纯度更高。

实施例4：

在三个对照组的细胞悬液体外生长七天时，从培养箱内取出培养瓶，将培养基吸出，用10ml磷酸盐缓冲液冲洗三遍；而后加入1.5ml0.1m％胰蛋白酶溶液消化3min，加入0.5ml胎牛血清终止消化，然后加入3ml磷酸缓冲溶液，用枪吹打，使细胞完全脱落，将细胞悬液加入15ml离心管内，1000r/min离心5min；弃上清液，分别用3ml完全培养基重悬细胞，用流式细胞仪分别检测，流式图附于图5-图10，结果列于表1。

表1三个对照组的细胞悬液流式细胞仪检测结果表

通常采用流式细胞仪分析干细胞表面的标志确定细胞的质量，在胎盘亚全能干细胞流式检测中，选用cd34、cd45、hla-dr、ssea-4细胞表面抗原为检测目标。其中cd34、cd45、hla-dr为该检测中的阴性对照，其检测值小于2定为细胞合格，而ssea-4是阶段特异性胚胎表面抗原，被公认作为胎盘羊膜上皮细胞干性的标志，其检测值越大说明该细胞悬液含的胎盘亚全能干细胞越多，干性越好；

由图5-图10和表1可知，三个对照组的cd34、cd45、hla-dr检测值均小于2，因此采用本专利方法和传统方法均可得到合格的人胎盘亚全能干细胞；每个对照组中，本专利方法得到的细胞悬液ssea-4检测值均大于传统方法得到的细胞悬液的ssea-4检测值，可见本专利方法得到的细胞悬液含的胎盘亚全能干细胞更多，细胞得率更高，干性更好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。