一种作物铁锌生物强化方法与流程

本发明涉及的是植物生物学技术领域，尤其涉及的是一种作物铁锌生物强化相关基因及强化方法。

背景技术：

铁、锌是动植物生长发育必需的营养元素，在新陈代谢中起着十分重要的作用。铁是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及其他酶系统的主要成分，帮助氧的运输，促进脂肪的氧化。缺铁会降低人体的免疫力，影响人们的生活质量，甚至危及人们的健康。铁营养摄入不足是导致人体缺铁性贫血的主要原因。在膳食结构中，以谷物为主食，特别是发展中国家的人群，缺铁性贫血更为严重。缺铁不仅影响植物的生长，更影响作物的营养品质。缺铁会造成植物叶片失绿、生长受阻、产量降低等生理现象，从而影响植物的健康生长。

锌是人体必需而又易缺乏的营养元素，世界约20％的人口面临着锌吸收不足的威胁。人体内大约含有2g锌，大部分分布在骨骼、肌肉、血浆和头发中。锌在人体生长发育、生殖遗传、免疫等生理历程中起着极其重要的作用，被人们冠以“生命之花”的美称。人类缺锌会导致生长发育缓慢、智力发育低下、营养不良等。锌是生物体内多种酶的辅助因子，参与机体的各种代谢。儿童在生长发育过程中，对锌的需求量比较大。锌与儿童的免疫功能、视觉及性发育密切相连。缺锌会降低机体的免疫水平，特别是呼吸道和消化道的抵抗力。锌是调节基因表达即调节dna复制、转译和转录的dna聚合酶的必需组成部分，因此，缺锌动物的突出的症状是生长、蛋白质合成、dna和rna代谢等发生障碍。人们依赖从植物中获得日常膳食所需的锌。锌也是植物生长发育所必需的微量营养元素，对于植物的生长和发育是必不可少的。植物缺锌会导致节间缩短、叶子向内卷曲及叶片变小等，严重缺锌会导致植物生长受阻进而影响植物的产量和品质。所以，增加植物获得铁锌的能力，对植物的生长发育和人类的健康具有重要的意义。在饮食上补充富含铁锌的食物，是最安全的补锌方法，被认为是解决人体缺铁锌的最有潜力的途径。

随着我国生活水平的不断提高，高产、优质育种一直是作物研究的主题。生物强化仍然是改善谷物中微量元素缺乏问题的一种现实的、经济的和可持续发展的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种作物铁锌生物强化方法，以采用基因工程方式，提供一种能够增强根对锌的吸收、转运能力，改良作物籽粒中微量元素含量和产量的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种作物铁锌生物强化方法，该方法利用水稻rcc3基因启动子启动水稻osckx1基因的表达，通过增强根对锌的吸收和转运能力，改良作物籽粒中微量元素含量和产量，其中，所述水稻osckx1基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述水稻rcc3基因启动子具有如seqidno.3所示的核苷酸序列。

所述利用水稻rcc3基因启动子启动水稻osckx1基因的表达的方法，步骤包括：

(1).根据已知的水稻rcc3基因启动子、水稻osckx1基因序列，从水稻基因组或cdna中克隆获得水稻rcc3基因启动子、水稻osckx1基因；

(2).将步骤(1)的水稻rcc3基因启动子和水稻osckx1基因依次顺式连接到作物表达载体中，构建获得rcc3pro:osckx1表达载体；

(3).将rcc3pro:osckx1表达载体导入待增强作物的基因组中，获得转基因植株，所述的转基因植株相比较原始植株的铁锌含量、产量都有提高。

所述作物表达载体为双元载体pcambia1300。

所述水稻osckx1基因的克隆方法，步骤包括：提取水稻总rna，并反转录成cdna，以：

seqidno.4，5’端引物：5’-ggggtaccatggcggcgatttacctg-3’

seqidno.5，3’端引物：5’-cgggatcctcagttgaagatgtcctggcc-3’

为特异性扩增引物，进行pcr扩增，获得含有kpni和bamhi酶切位点的水稻osckx1基因序列。

所述水稻rcc3基因启动子的克隆方法，步骤包括：提取水稻总dna，以：

seqidno.6，5’端引物：5’ggaattctattagaagcagtacgatcttatt-3’

seqidno.7，3’端引物：5'-ggggtacctgctacgtacccgagatcgatc-3’

为特异性扩增引物，进行pcr扩增，获得含有ecori和kpni酶切位点的水稻rcc3基因启动子序列。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种作物铁锌生物强化方法，该方法首次利用水稻rcc3基因启动子启动水稻osckx1基因的表达，可增强根对锌的吸收、转运能力，该方法可用于改良作物籽粒中微量元素含量和产量。

附图说明

图1为图1rcc3pro:osckx1双元载体示意图；

图2苗期rcc3pro:osckx1株系根中osckx1基因的表达量；

图3成熟期rcc3pro:osckx1株系株型图；

图4rcc3pro:osckx1株系中糙米铁含量；

图5rcc3pro:osckx1株系中糙米锌含量；

图6rcc3pro:osckx1株系小区产量。

具体实施方式

实施例1

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

本实施例所涉及的水稻品种为中花11号水稻(tongh,jiny,liuw,lif,fangj,yiny,qianq,zhul,chuc(2009)dwarfandlow-tillering,anewmemberofgrasfamily,playspositiverolesinbrassinosteroidsignalinginrice.plantj.58:803-816)公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

下述实施例中的双元载体pcambia1300(tongh,jiny,liuw,lif,fangj,yiny,qianq,zhul,chuc(2009)dwarfandlow-tillering,anewmemberofgrasfamily,playspositiverolesinbrassinosteroidsignalinginrice.plantj.58:803-816)公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

2、方法

2.1.osckx1基因过表达载体pcambia1300-rcc3pro:osckx1的构建

2.1.1.重组载体pcambia1300-osckx1的构建

提取水稻中花11号三叶期幼苗总rna，采用rt-pcr方法扩增到编码osckx1的1599bp全长cdna。其中：

1)植物总rna的提取：选取100mg生长一周的水稻中花11号的幼苗为材料，在液氮中研磨，将液氮中研碎的冻干粉转入到含1mltrizol试剂(invitrogen)的1.5ml离心管中，充分混匀；室温放置5分钟；每管中加入0.2ml氯仿，剧烈振摇20秒，室温放置2-3分钟；12,000rpm，4℃，离心15分钟；把上清的水相0.5ml转移到一个新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，25℃放置10分钟使rna沉淀；12,000rpm，4℃，离心10分钟；去上清，将rna沉淀。用1ml75％乙醇清洗2次，超净台吹至半干；用50μldepc-ddh2o重悬沉淀，60℃水浴10分钟，以溶解rna沉淀获得rna溶液。将此rna溶液分装后-70℃保存，备做反转录的模板。

2)rt-pcr：取1μl上述rna溶液，用depc-ddh2o稀释100倍，用分光光度计测定rna浓度。参照rt-pcr试剂盒(toyobo)说明书，根据rna的定量结果，取含有2μgrna的上述rna溶液，65℃变性5分钟，立即置于冰上。加入4μl反转录混合物i，补水至16μl。混匀后，37℃5分钟。加入4μl反转录混合物ii。37℃15分钟；50℃5分钟；98℃5分钟；4℃5分钟。取1μl上述产物作为pcr的模板，按以下体系进行pcr反应：0.2μllataq(5u/μl)、10μl2×buffer，1.8μldntps,0.5μl5′端引物(10μm)，0.5μl3′端引物(10μm)，加ddh2o终体积20μl。其中：

5′端引物：5’-ggggtaccatggcggcgatttacctg-3’(下划线序列为kpni位点)；

3′端引物：5’-cgggatcctcagttgaagatgtcctggcc-3’(下划线序列为bamhi位点)

进行pcr扩增，得到pcr产物。回收pcr产物进行测序，结果表明该pcr产物的核苷酸序列为序列表中序列。

3)该pcr产物为osckx1基因，其编码序列为序列表中序列，编码氨基酸序列为序列表中序列2的蛋白质osckx1。将该pcr产物用kpni和bamhi酶切后，将该片段克隆入质粒载体pcambia1300的kpni和bamhi位点处，得到重组载体pcambia1300-osckx1。

2.1.2.pcambia1300-osckx1中连入rcc3启动子

1)将装有研磨的水稻一周幼苗样品的离心管加入700μlctab提取液，65℃烘箱温浴30min；

2)加入700ul氯仿，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min；

3)取上清加入新的1.5mlep管中，加入680μl异丙醇。震荡均匀，12000rpm离心10min；

4)去上清，向沉淀中加入700μl75％乙醇溶液，清洗沉淀；

5)去上清，沉淀晾干，加入适量h2o，待用；

6)取1μl上述dna作为pcr的模板，按以下体系进行pcr反应：0.2μllataq(5u/μl)、10μl2×buffer，1.8μldntps,0.5μl5′端引物(5’ggaattctattagaagcagtacgatcttatt-3’，下划线序列为ecori)，0.5μl3′端引物(5'-ggggtacctgctacgtacccgagatcgatc-3',下划线序列为kpni)，加ddh2o终体积20μl；

7)将pcr产物用ecori和kpni酶切后，将该片段克隆入质粒载体pcambia1300的ecori和kpni位点处，如图1所示，得到重组载体pcambia1300-rcc3pro:osckx1。

2.2.重组载体pcambia1300-rcc3pro:osckx1转化农杆菌

取100μl农杆菌菌株agl1的感受态细胞于eppendorf管中，加入1μg质粒pcambia1300-rcc3pro:osckx1，混匀。冰浴30min后立即放入液氮中冰冻5min。取出eppendorf管，置于37℃水浴5min。加入yeb培养基1ml，28℃，150rpm培养2-3h。涂于yeb平板(kan50mg/l，rif50mg/l)上，28℃暗培养2-3天。挑单菌落做pcr鉴定，得到的重组菌正确，将该重组菌记作agl1/pcambia1300-rcc3pro:osckx1。

yeb培养基组成：beefextract(牛肉浸膏)5g/l，yeastextract(酵母膏)1g/l，peptone(蛋白胨)5g/l，sucrose(蔗糖)5g/l，mgso4·7h2o0.4g/100ml，agar(琼脂)1.5g/100ml，ph7.4。

2.3.转化水稻

具体的转化筛选方法参见如下文献：易自力，曹守云，王力，何锶洁，储成才，唐祚舜，周朴华，田文忠.提高农杆菌转化水稻频率的研究，遗传学报，2001，28(4)：352-358。去壳的野生型日本晴水稻种子先用70％酒精(加一到两滴tween100)进行表面处理3min后，用5％的次氯酸钠振荡消毒30min，然后经无菌水漂洗4-5次后点播于nb培养基(购自phytotechnologylaboratories，产品目录号为n492)上诱导愈伤组织。20天左右从成熟胚盾片处挑选色泽淡黄且致密的愈伤组织继代，以后每两周继代一次。培养重组农杆菌agl1/pcambia1300，至菌液的od600＝0.4左右；选择生长状态良好的颗粒状的愈伤组织浸入重组农杆菌agl1/pcambia1300的菌液中，150rpm，震荡培养20min后，取出并用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织依次进行共培养、抗性筛选培养、生根培养，炼苗后移至试验田，得到转入pcambia1300的转基因水稻植株(t0代)。

2.4.转基因水稻的鉴定

随机取步骤2.3得到的2株t0代转pcambia1300-rcc3pro:osckx1水稻(株系名称分别为#1和#2)。

按照如下方法进行pcr鉴定：取水稻叶片提取基因组dna,使用相关引物进行转基因水稻阳性鉴定。阳性鉴定所用引物为pcambia1300所含有的潮霉素hyg基因引物，其序列为5'aacccgctcgtctggctaa3'及5'gcgaagaatctcgtgctttca3'，靶序列为hyg基因的部分序列，预测目的产物片段长度307bp。

2.5.转基因植株的获得

将上述转入pcambia1300-rcc3pro:osckx1的转基因水稻植株继代繁殖，并得到转基因纯株系#1和#2，将转入pcambia1300的转基因水稻植株继代繁殖，并得到转空载体的纯株系wt。

3、效果验证

3.1.检测osckx1基因表达量

分别提取#1和#2及野生型wt株系两周幼苗根的总mrna，采用toyobo反转录试剂盒(revertraaceqpcrrtmastermixwithgdnaremover)反转录成cdna，然后利用cfx96荧光定量pcr仪(bio-rad)进行荧光定量pcr检测。qpcr反应使用sybrgreenreal-timepcrmastermixreagent(toyobo)试剂盒。所有试剂盒涉及的方法均根据相关的操作说明书操作。

结果如图2所示，图中可以看出，#1和#2转基因纯株系的osckx1基因表达量相比较wt对照组具有显著提升。

3.2.转基因植株的表型分析

图3为成熟期rcc3pro:osckx1与wt株系株型图，图中可以看出，转基因株系与野生型株系的形态相似，说明rcc3pro:osckx1的转入对植株地上部分的表型无影响。

3.3.转基因植株中糙米铁含量分析

取#1和#2及野生型wt株系水稻糙米0.5g，用7ml盐酸/高氯酸(4:1v/v)100℃消解2h，然后150℃消解5h。定容至15ml。用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测定铁元素含量。

结果如图4所示，图中可以看出，rcc3pro:osckx1株系水稻糙米中铁含量相比较wt具有显著提升，#1和#2株系相对于wt分别增加了26.5％和40.5％。

3.4.转基因植株中糙米锌含量分析

取#1和#2及野生型wt株系水稻糙米0.5g，用7ml硝酸/高氯酸(4:1v/v)100℃消解2h，然后150℃消解5h。定容至15ml。用icp-oes测定锌元素含量。结果如图5所示，图中可以看出，rcc3pro:osckx1株系水稻糙米中锌含量相比较wt具有显著提升，#1和#2株系相对于wt分别增加了49.2％和67.4％。

3.5.转基因植株小区产量分析

每个小区种8行，每行8株，共64株。#1和#2及野生型wt三个株系，每个株系种三个小区。每个小区取中间36株作产量统计，作为一个重复。

结果如图6所示，图中可以看出，rcc3pro:osckx1株系水稻小区产量相比较对照具有显著提升，#1和#2株系相对于对照分别增加了14.2％和17.6％。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。